교신저자：박경호, 137-701 서울 서초구 반포동 505  가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
교신저자：전화：(02) 590-4933 · 전송：(02) 595-1354 · E-mail：khpent@catholic.ac.kr

서     론

   감각신경성 난청은 산업화 국가 인구의 약 5~10%가 앓고 있는 비교적 흔한 장애이며 주된 원인은 내이 내에 있는 감각신경상피의 변성에 기인하기 때문에 포유류에서는 그 재생이 이루어지지 않는 것으로 알려져 왔다.^1,2,3) 이를 극복하기 위한 방법으로 최근 성체 신경줄기세포(adult neural stem cell)를 이용한 난청에 대한 세포치료(cell therapy)의 가능성을 두고 그 연구가 활발히 이루어지고 있다.^3,4) 세포치료의 일환으로 줄기세포 이식치료에 대한 연구를 하는 중 가장 중점이 되는 것이 이식을 위한 성체 신경줄기세포의 추출일 것이다. 성체 신경줄기세포는 신경구(neurosphere)를 형성하며 자기 재생 능력(self renewal)과 특정 신경세포로의 분화(differentiation)가 가능한 특징을 지닌다.^5,6) 과거에는 성체 신경줄기세포를 중추신경계와 혈액에서 주로 채취하였다.^7,8,9,10,11) 그러나 최근의 많은 연구에서 청각기관에서도 성체 신경줄기세포가 분리 배양되어 보고된 바, 전정기관의 감각세포와 청각기관 즉, 갓 태어난 쥐의 코르티 기관(organ of Corti)과 와우신경절(spiral ganglion)에서 성체 신경줄기세포와 같은 특징을 가지는 세포들이 발견되어 보고되었다.^7,12,13) 그러나 배양된 성체 신경줄기세포는 지속적으로 증식과 분화 과정을 겪는 특성을 지니는 바, 성체 신경줄기세포의 정확한 수와 비율을 알 수 없었다. 따라서 본 실험에서는 기니아피그 와우신경절에서 성체 신경줄기세포를 분리한 후, flow cytometry를 이용하여 분화된 성체 신경줄기세포의 비율과 성체 줄기세포에서 분화된 신경세포의 비율을 정량적으로 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

재  료
   실험 동물은 생후 3~6개월 된 300 g 정도의 기니아피그를 사용하였고 졸레틸(50 mL/mL, Virbac, Carros, France)과 럼푼(10 mg/kg, Bayer Korea LTd., Seoul, Korea)을 섞은 마취제를 복강 내에 충분히 주입하여 마취를 유도하고 이후 기니아피그의 경부 절제를 시행하여 현미경하에서 와우신경절을 채취하였다.

와우신경절 성체 줄기세포의 분리, 배양
   얻어진 조직을 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Gibco, Carlsband, CA)이 들어있는 용기에 옮긴 후 DMEM 배지로 3차례 세척을 시행하였다. 그 후 0.25% trypsin(Gibco)이 들어있는 15 mL 튜브로 옮긴 후, 37℃ 수조에서 2분간 배양하였다. 튜브에 10 mg/mL DNase I (Invitrogen, Carlsbard, CA)를 더 첨가하고 세포들을 조심스럽게 파쇄한 후, 비교적 큰 세포나 조직들은 아래로 가라앉을 수 있도록 2분 정도 실온에 방치하였다. 상층액은 새로운 튜브로 옮긴 후 10% fetal bovine serum(FBS, Gibco)을 첨가하여 효소작용을 멈추게 하고, 1,000 rpm으로 5분간 원심분리를 시행하였다. 침전물은 신경구(neurosphere)의 배양을 위하여 0.5% B27 supplement(Invitrogen), 1% L-glutamin(Sigma, St. Louise, MI)과 1% gentamycin(Gibco)을 포함한 neurobasal medium(DMEM：F12=1：1)에 부유시켰다. 배양 초기에는 neurobasal medium에 20 ng/mL epidermal growth factor(EGF, Invitrogen)과 10 ng/mL fibroblast growth factor(FGF, Invitrogen)을 첨가하여 성체 줄기세포의 배양을 촉진하도록 하였다. 이 성장인자가 첨가된 새로운 배양액은 매 3일마다 반 정도를 기존 배양액에 넣어주고 9일째 되는 날 배지를 갈아주었다.

배양된 신경줄기세포의 유세포분석
   신경줄기세포 배양 배지에서 3차례 계대 배양을 한 후, 증식하는 세포를 알아보기 위해 10 mM 5'-Bromo-2-deoxy-uridine(BrdU, Sigma Chemical Co.)을 24시간 동안 첨가하였다. 세포들을 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 세척한 후 0.25% trypsin/EDTA 용액으로 세포들을 mononuclear세포로 만들었다. 이 세포들은 2% FBS가 포함되어 있는 Hank's Balanced Salt Solution(HF2, Invitrogen)으로 2번 세척한 후 1.5 mL 튜브에 옮겨 fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled nestin항체(Chemicon, Temecula, CA), β III tubulin(Chemicon), polysialylated Neural Cell Adhesion Molecule(PSA-NCAM；polySia NCAM, Sigma Chemical Co.), Neural Cell Adhesion Molecule(NCAM, non-polysialilated NCAM, Zymed), S-100(Sigma, St. Luise, MI, USA)을 1：100으로 희석한 용액 항체를 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 세포들은 HF2로 2회 세척하였고, 원심 분리한 후 침전물을 모아 죽은 세포의 표지자로 이용되는 propidium iodide(1 μg/mL, Sigma Chemical Co.)가 들어간 flow cytometry 용액에 재부유하여 분석할 때까지 얼음에 보관하였다. 염색된 세포들은 FACSCaliburTM Flow Cytometer(BD Biosciences, San Diego, CA)로 측정하였고 Cell Quest software로 분석하였다.

결     과

   기니아피그 와우신경절에서 분리 배양된 세포들은 줄기세포의 표지자로 알려진 BrdU와 nestin에 양성반응을 보 이며, 자기 재생이 가능한 구형태의 줄기세포를 분리 배양 할 수 있었다(Fig. 1). 그리고 이들 구 형태의 줄기세포들 은 PSA-NCAM과 β III tubulin에 양성을 보여(Figs. 2 and 3) 신경원세포로의 분화가 가능함을 확인하였고, Schwann cell marker인 S-100 staining에 양성을 보여(Fig. 4) 신경교세포로의 분화가 가능함을 확인하였다. 이로써 전정이나 고막뿐 아니라 와우신경절에서도 성체 신경줄기세포를 분리 배양할 수 있으며, 이 성체 신경줄기세포가 신경원세포와 신경교세포로의 분화가 가능한 다능성 신경줄기세포(pluripotent stem cell)임을 확인하였다.
   성체 신경줄기세포에서 신경세포로의 분화단계 세포들을확인한 후, 각 배양 배지 내의 세포들에 대한 줄기세포와 분화 과정에 있는 세포들의 정량적 분석을 위해 유속세포분석을 시행하였다. 그 결과, 신경줄기세포의 표지자인 nestin 을 발현하는 세포들은 전체 세포에서 약 1.7%(24,300 cells)를 차지하였다. 이는 지금까지 알려진 골수 간엽줄기세 포에서 분리되는 신경줄기세포 비율(약 3%)보다는 적지만, 와우신경절 내에서 2만개 이상의 신경줄기세포가 분리될 수 있는 것은 큰 의미가 있다고 볼 수 있다. 신경줄기세포의 표지자이며 신경원세포의 발생 초기 단계에서 발현되는 PSA-NCAM는 전체 세포에서 3.45%을 차지하였다. 신경원세포의 표지자인 β III tubulin은 3.57%를 차지하였고, 신경줄기세포 및 신경원세포와 신경교세포의 일부에서 발현되는 NCAM은 7.19%를 차지하였다(Fig. 5). 이러한 신경줄기세포 배양을 위한 배양 배지 조건하에서도 지속적으로 세포의 분화가 지속됨을 확인할 수 있었다.

고     찰

   감각신경성 난청을 극복하기 위한 방법으로 연구되고 있는 세포치료(cell therapy)의 일환으로 성체 신경줄기세포 (adult neural stem cell)를 이용한 연구가 최근 이루어지고 있다. 가장 흔히 성체 신경줄기세포를 얻는 원천으로는 중추신경계나 골수의 간엽줄기세포이나 최근의 연구를 통해 성체의 내이에도 줄기세포가 존재함이 확인되어 이를 이용한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 내이에서의 성체 신경 줄기세포 확보 위치는 성체 쥐 내이의 전정기관,^7,14) 갓 태어난 쥐의 와우,^12,14) 태어난지 7일된 쥐의 와우²⁾ 등이 알려져 있다. 이와 함께 본 저자 등은 성체 기니아피그 고막에서 성체 신경줄기세포를 분리 배양하는데 성공하여 보고 한 바 있으며,¹³⁾ 내이 성체 신경줄기세포와는 다르게 채취가 비교적 쉬운 부위에서 기관 특이적인 성체 신경줄기세포를 얻었다는 점에서 의미가 있다.
   난청에 대한 세포치료에 있어 줄기세포의 분리 획득 다음으로 필요한 것은 분리에 성공한 줄기세포를 세포치료에 이용 가능한 만큼의 세포 수, 즉 내이에 주입 가능한 수만큼의 세포 수를 얻어내도록 배양해 내는 것이다. 성체 신경줄기세포를 이용한 줄기세포 이식치료에 있어서는 정확한 연구가 된 바는 없으나 약 10만개 이상의 줄기세포 주입이 필요하다고 알려져 있다. 그러므로 와우신경절에서 얻은 성체 신경줄기세포를 배양과정에서 성장인자를 이용하여 얼마만큼 증폭시킬 수 있는지를 아는 것이 줄기세포 이식치료에 있어서 중요한 부분일 것이다. 또한 줄기세포에서 신경세포로의 분화가 실제적 청각 회복에 있어서는 필수적인 요소이기 때문에 이에 대한 분화 비율을 아는 것이 필요하다.
   Yang 등은 출생 19일째 쥐의 망막에서 분리한 배아 망막 기원세포(embry-onic retinal progenitor cell)를 FACS방법으로 분석한 결과, primary cells의 22.23%, 16.04%, 19.66%의 세포에서 각각 신경줄기세포의 표지자인 nestin, 신경아교세포로의 분화 표지자인 Sox-2, 망막세포의 표지자인 Calretinin을 표현하였다고 보고하였다.¹⁵⁾ 망막에서 분리한 세포뿐 아니라 척수의 배근 신경절(dorsal root ganglion), 해마(hippocampus) 등의 신경세포에서 분리 배양한 경우에서 FACS 방법으로 분석한 결과, 배양 부유액 내의 입자 중 64%가 신경세포이며 이중 2/3가 생존력이 있는 세포라고 보고된 바 있다. 그리고 이 생존력이 있는 세포의 대부분이 4주 이상 생존하였다고 하였다.¹⁶⁾
   본 연구에서는 내이에 존재하는 성체 신경줄기세포의 이용 가능성에 대비해서 와우신경절에서 배양 가능한 성체 신경줄기세포의 비율과 이식 가능한 세포 수를 알아보고자 연구를 진행하였다. 또한 이식을 위해서는 순수한 성체 신경줄기세포만의 분리가 필수적인데 이 과정에서 신경세포로의 분화정도와 세포 활성도가 중요한 의미를 지니는데 이에 대한 내용을 알아보기 위한 연구를 진행하였다.
   과거 다른 연구와 비교하여 볼 때, 본 연구는 기관 특이세포를 해당 기관인 와우신경절에서 분리하였으며, 3계대 배양 후 각 성체 신경줄기세포의 표지자를 이용하여 측정한 세포수가 부유세포 중 10% 미만으로 적은 부분을 차지했다고 평가할 수 있다.
   성체 줄기세포 배양에서 보면 대개 계대 배양의 횟수가 3계대에서 가장 많은 줄기세포가 배양되는 것으로 알려져 있고, 와우신경절 배양에서도 계대가 늘어나면서 세포 사멸로 인해 그 수가 줄어드는 것으로 되어있어 본 연구 진행을 할 때에 가장 많은 수의 줄기세포가 있을 것으로 생각되는 3계대에서 flow cytometry를 시행하였다.
   와우신경절을 채취하여 줄기세포 배양 배지에서 3계대 배양 후 배양 배지 내에서의 성체 신경줄기세포는 nestin positive cell로서 1.7%로 나타났고, 이로부터 분화된 신경 세포는 tubulin positive cell로서 3.57%에 달했다. NCAM과 PSA-NCAM은 신경줄기세포에서 신경세포로의 분화단계에서 다양하게 나타나는 marker로서 nestin, tubulin이 중요한 의미를 가지고 있으며, 이 두 가지 표지자를 이용한 cell sorting이 향후 줄기세포 이식시 중요한 표지자로 알려져 있다.
   성체 신경줄기세포를 이용한 세포 이식치료를 위해서 필요한 정확한 세포의 갯수는 밝혀지지 않았다. 한 연구에 따르면 기니아피그에서 소음성 난청 모델을 만들어 와우신경절세포와 아교세포의 감소를 조사하고, 배양된 줄기세포 용액을 주입 후 다시 와우신경절세포와 아교세포의 증가를 조사하였다.¹⁷⁾ 소음성 난청 동물 모델에서, 와우신경절세포는 15.1±0.5 cells/10,000 μM², 아교세포는 13.5±0.8 cells/10,000 μM²만큼 감소한 것으로 나타났다. 소음성 난청을 보인 기니아피그의 정원창으로 40,000 cells/μL의 농도를 가지는 배양된 세포 용액을 2.5 μL/min의 속도로 15분간 주입을 시행하고, 3일 후 와우 내의 세포 갯수를 다시 측정하였다. 그 결과 와우신경절세포는 5.7 cells/10,000 μM², 아교세포의 경우 3.9 cells/10,000 μM²만큼 증가하였다.¹⁷⁾
   본 연구의 결과와 종합하여 생각해 볼 때, 현재 연구가 되고 있는 세포 배양액 내의 세포보다 약 세배 가량 효율성을 높여야 하는 것으로 분석할 수 있다. 이는 전체 배양 용액 내의 세포 갯수를 늘리는 방향으로 연구를 진행하거나, 같은 세포 개수 내에서 얻어내는 성체 신경줄기세포의 비율을 높이는 방법이 필요하다는 결론을 얻을 수 있다.
   현재 본 연구에서는 분리된 세포를 배양하였을 때 얻는 신경줄기세포의 양은 전체 배양세포의 10% 이내로 작은 비율을 차지하는 것으로 밝혀졌다. 앞으로 작은 양의 성체 신경줄기세포만으로도 난청에 대한 성공적인 세포치료를 하기 위해서 분리된 세포를 배양할 때, 현재 방법보다 더 많은 신경줄기세포를 얻을 수 있는 세포 배양의 최적의 조건에 대한 연구가 필요하리라 생각된다.

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