교신저자：여상원, 137-701 서울 서초구 반포동 505번지  가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   최근의 많은 연구를 통하여 내이 즉 전정기관의 감각기, 청각기관의 코르티 기관과 와우신경절 등에서 성체줄기세포의 존재가 확인되었다. 특히 2003년 Li 등¹⁾은 성체 포유류의 난형낭 감각상피세포에서 줄기세포 특징을 지니는 세포를 분리 배양하는데 성공하였다. 이들은 줄기세포의 특징인 자기 재생(self renewal)이 가능하였으며 발생과정의 내이 표지자(marker)와 신경줄기세포 표지자를 가지는 구(sphere)를 형성하였다. 또한 이들은 내이 특이적인 유모세포와 지지세포로의 분화가 가능하였다. 이는 난형낭 감각세포층의 일부가 줄기세포로서의 특징을 지니며 또한 유모세포로의 분화가 가능하리라고 생각할 수 있게 되었다. 이와 함께 골수의 간엽줄기세포와 배아줄기세포를 이용한 난청동물모델에 대한 줄기세포치료연구가 활발히 이루어지고 있다.
   현재까지는 Unge 등²⁾에 의하여 고막 천공이 회복되는 과정에서 줄기세포가 관여한다고 밝혀졌고, Wang 등³⁾에 의하여 rat의 고막에서 상피 줄기세포(epidermal stem cell)를 분리 배양하였다고 보고하였으나 이 줄기세포가 신경 관련세포로 분화되는 것까지는 보여주지 못하였다. 따라서 본 연구자는 고막에서의 신경줄기세포의 존재와 신경세포로의 분화 여부를 알아보기 위해 기니아 피그의 고막에서 성체신경줄기세포를 분리 배양을 하고자 하였다.

재료 및 방법

대  상
   실험 동물은 생후 3~6개월 된 300 g 정도의 기니아 피그를 사용하였고 Pentobarbital(Pentothal sodium, 100 mg/kg)을 복강 내에 충분히 주입하여 마취를 유도하고, 이후 기니아 피그의 경부 절제를 시행하여 고막을 채취하였다.

세포의 분리 배양 및 면역 형광 염색
   이후 세포분리과정을 진행하기 위하여 얻어진 조직을 Ducobecco's modified Eagle's media(DMEM, Gibco, Carlsbard, CA, USA)가 들어있는 용기에 옮긴 후 3차례 DMEM으로 세척을 시행하였다. 그 후 0.25% trypsin(Gibco)이 들어있는 15 ml tube로 옮긴 후 37℃ 하에서 20분간 배양하였다. 그 다음 DNase I(Invitrogen, Carlsbard, CA, USA) 10 mg/ml를 첨가하고 세포들을 조심스럽게 파쇄하며, 비교적 큰 세포 혹은 조직들은 아래로 가라앉을 수 있도록 2분 정도 실온에 방치하였다. 상층액은 새로운 tube로 옮긴 후 10% fetal calf serum(Gibco)으로 효소작용을 멈추게 하고, 이들은 다시 1,000 rpm으로 5분간 원심분리를 시행하였다. 침전물은 신경구의 배양을 위하여 B27 supplement(Invitrogen), L-Glutamin(Sigma, St. Luise, MI, USA)과 Gentamycin(Gibco)을 포함한 F12와 DMEM이 1：1로 함유된 배양액에 부유시켰다. 배양 초기의 배양 배지에는 epidermal growth factor(EGF, Invitrogen)와 fibroblast growth factor(FGF, Invitrogen)를 첨가하였다. 매 3일마다 성장인자가 첨가된 새로운 배양액 반 정도를 기존 배양액에 넣어주고 9일째 되는 날 배지를 갈아주었다. 
   그리고 신경구로부터 분화되는 세포의 확인을 위해 신경구의 일부를 B27 supplement(Invitrogen), L-glutamin과 gentamycin이 포함된 neurobasal medium(Gibco)으로 옮겨서 분화를 유도하였다. 이들 배양액에는 glial cell derived neurotrophic factor(GDNF, Invitrogen), brain derived neurotrophic factor(BDNF, Invitrogen)와 neurotrophin-3(NT-3, Invitrogen)를 첨가하였으며 이들 세포들을 코팅된 배양 접시에 분양하였다.
   증식하는 세포를 알아보기 위해 배양된 세포는 cover slide가 깔린 6-well에 옮긴 후 10 μM Bromodeoxyuridine (BrdU, ABD serotec, Raleigh, NC, USA)을 신경구와 분화된 세포에 첨가하였다. BrdU는 4~12시간 동안 처리하고 이후 3일간 신경세포 분화 배지에서 배양하였다.
   분화된 세포는 통상적인 조직학적 고정 방법에 따라 15분간 4% paraformaldehyde(Sigma)에 고정한 후 PBS로 washing을 해 주었다. 5분간 0.2% triton-×100 PBS(Junsei chemical, Tokyo, Japan)로 incubation한 후 BrdU 염색을 위해 1시간 동안 2M HCl로 배양하여 DNA denaturation을 하였다. 그 후 neutralization 과정을 위해 0.1M의 Na2B4O7(Sigma)을 이용하여 5분간 배양을 한 후 PBS를 이용하여 세척해 주었다. 그리고 10% goat serum(Vector Lab. Inc., Peterborough, England)을 이용하여 blocking을 시행하였다.
   BrdU와 함께 이중형광염색(double staining)을 위해 각각 nestin(Chemicon, 1：200), β Ⅲ tubulin(Chemicon, 1：100), S-100(Sigma, 1：100)에 대한 특이 항체를 10% goat serum이 포함된 PBS에 1차 항체를 희석하여 넣은 후 4℃에서 12시간 배양하였다. 이후 PBS를 이용하여 세척을 한 후에 2차 항체로서 cyanine-conjugated secondary antibody인 goat anti-Rat IgG Antibody(Alexa Fluor-red colour for BrdU, ABCam, Cambridge, England)와 sheep anti-mouse Cy2(Cy2-green colour for nestin and β Ⅲ tubulin, Jackson, Baltimore, PA, USA), Goat anti-rabbit Fluorescein Isothiocyanate(FITC, green colour for S-100, ABCam)를 10% goat serum이 포함된 PBS로 1：200으로 희석하여 넣어 붙여주었다. PBS로 세척을 한 후 mounting medium for fluorescence(Vector Lab. Inc.)를 이용하여 mounting하였다. 그리고 핵 염색을 위해서 4,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI, Vector Lab. Inc.)을 사용하였다.

결     과

   EGF와 FGF를 포함한 신경줄기세포 배양을 위한 배지에서의 3 passage 배양 후 관찰한 결과 구 형태를 지니는 세포의 군집들을 확인할 수 있었고, 이들은 줄기세포의 표지자 및 증식하는 세포들의 표지자로 알려진 BrdU와 신경줄기세포의 표지자로 알려진 nestin을 모두 발현하였다(Fig. 1). 이들 neurosphere는 계대 배양과 self-renewal이 가능하였고 크기는 200~300 μm였다.
   그리고 특정 세포로의 분화를 확인하기 위한 위의 일부 neurosphere를 BDNF, GDNF, 그리고 NT-3가 포함된 분화 배지(differentiation media)에서의 배양을 통해서 이들을 특정한 신경세포들로 분화를 유도하였다. 이들 분화된 세포들에 대하여 각각의 신경 표지자를 통해서 확인을 하였다. 
   분화된 세포들은 β Ⅲ tubulin에 양성반응을 보이는 신경원세포와 S-100에 양성반응을 보이는 신경교세포로 분화됨을 확인할 수 있었다(Figs. 2 and 3). 그리고 이들 분화된 신경세포들을 BrdU도 발현함을 확인하여 이들이 증식하는 신경구로부터 분화된 세포임을 확인할 수 있었다.
   BrdU와 nestin 두 표지자에 모두 양성을 보이는 세포들은 기존에 알려진 줄기세포 특유의 구 형태를 보이고 있었지만 분화배지에서 분화된 세포들은 다양한 형태를 보이고 있었으며 그 크기는 50~100 μm였다.

고     찰

   고막의 천공은 임상적인 면에서 중요한 문제이며 전도성 난청 및 만성 중이염의 원인이 되기도 한다. 특히 외상성 고막 천공은 많은 수에서 자연적으로 치유되지만 만성적인 천공은 수술적 치료가 필요하게 된다. 고막 천공에 관여하는 인자로는 basic fibroblast growth factor(bFGF)가 중요한 역할을 하는 것으로 알려졌으며^4,5) 최근 배아줄기세포(embryonic stem cell)가 고막천공의 치유를 촉진하는 것이 밝혀졌다.^2,6) 또한 고막에서 성체줄기세포를 분리하고자 하는 시도가 이루어졌으며, rat의 고막에서 상피성줄기세포(epidermal stem cell)의 존재를 면역화학염색을 통하여 확인하였다.³⁾
   이 연구에서는 기니아 피그 고막에서 성체신경줄기세포에 대한 분리 배양을 시도하여, 구 형태의 neurosphere를 배양할 수 있었으며 이 neurosphere들은 계대 배양과 self-renewal이 가능하였다. 또한 분화배지를 통하여 신경원 세포와 신경교세포로의 분화를 확인할 수 있었다. 이는 기니아 피그 고막 내에 성체신경줄기세포가 존재함을 의미하고 이들은 줄기세포로서의 특징을 가지고 있었으며, 특이적인 신경세포로 분화됨을 확인할 수 있었다.
   따라서 성체 동물의 고막에서도 줄기세포를 분리 배양할 수 있다는 사실을 보여주었다. 이는 기관 특이적인 성체신경줄기세포를 이용한 세포 치료의 가능성을 보여주는 것이며, 이를 통해 배아줄기세포와 관련된 윤리적인 문제도 벗어날 수 있다. 또한 비교적 채취하기 쉬운 고막 조직을 이용하여 줄기세포를 배양하고 이를 신경 세포로 분화시켜 내이 질환과 관련한 줄기세포치료의 가능성을 보여주었다는 의미가 있다고 할 수 있다.
   이 실험의 신경줄기세포 기원에 대해서는 고막 자체에 신경줄기세포 자체가 존재하거나 혹은 신경줄기세포로 분화가 가능한 세포가 존재하며, 특정한 조건하에서 신경줄기세포로 분화되었을 것으로 생각할 수 있다. 이는 성체줄기세포가 가지는 특징인 plasticity, 즉 microenvironment에 따라 trans-differentiation의 가능성이 있을 것이다. 전술한 바와 같이 현재까지 고막에 존재한다고 알려진 상피성 줄기세포가 신경배양배지 조건하에서 신경줄기세포의 특성을 지니는 세포로 분화가 되었을 가능성이 있을 것이다. 따라서 이 실험에서 확인된 신경줄기세포의 기원에 대해서는 아직 많은 연구가 필요하리라 생각된다.
   최근의 성체줄기세포에 대한 많은 연구를 통해서 제대혈액 내 줄기세포와 골수 내 줄기세포 외에도 신체의 각 기관에서도 각종 세포로 분화되는 줄기세포가 존재함이 알려졌다.^7,8) 따라서 이러한 줄기세포는 뇌, 피부, 유방, 간, 눈, 위장관 등 자체적인 재생능력이 있는 장기 조직에는 줄기 세포가 존재하고 있으리라 말할 수 있다. 또한 이러한 성체줄기세포 특히 골수나 탯줄에 존재하는 조혈모세포나 체지방세포가 신경이나 근육과 같은 세포로도 분화할 수 있어 이들을 내이질환 치료에 이용하려는 시도가 이루어지고 있다.^9,10,11) 그리고 최근의 연구에서 전정기관과 청각기관에서도 성체줄기세포가 발견되었으며, 내이의 자체적인 신경재생 가능성과 이들 신경줄기세포를 이용한 연구가 활발히 이루어지고 있다.
   고막에서 줄기세포 분리를 시도한 연구는 그 예가 거의 없으며 국내에서는 본 저자들의 시도가 유일한 것이라 하겠다. 앞으로 좀 더 많은 연구를 통해 비교적 채취가 용이한 고막을 이용한 자가 신경줄기세포를 이용한 난치성 내이 질환에 대한 줄기세포치료가 이루어질 수도 있으리라 생각된다.

결     론

   기니아 피그 고막에는 self renewal과 특정세포로의 분화가 가능한 성체신경줄기세포가 존재함을 배양 실험을 통해 확인하였다. 이는 고막 내 존재하는 줄기세포를 이용한 귀 질환에서의 세포치료 가능성을 보여주는 것이라 생각된다. 

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3. Wang WQ, Wang ZM, Tian J. Epidermal stem cells in the tympanic membrane. Zhonghua Er Bi Yan Hou Ke Za Zhi 2004;39(12):712-6.

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