교신저자：양훈식, 156-755 서울 동작구 흑석동 224-1  중앙대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
교신저자：전화：(02) 6299-1765 · 전송：(02) 825-1765 · E-mail：yhsljr@cau.ac.kr

서     론

   두경부 편평세포암은 세포의 이질성이 많아 진행양상이 다양하며 예측이 어렵고 발생 부위별로 다양한 생물학적 특성과 전파경로를 가진다. 또한 국소 침습성이 강하며, 조기에 림프절로의 전이가 흔하고 진행된 병기의 암일지라도 국소성이 높아 조기에 발견하여 치료하면 좋은 예후를 기대할 수 있는 특징을 가지고 있다.¹⁾ 따라서 다른 부위의 종양과 마찬가지로 종양의 국소침습의 정도와 주변 림프절로의 전이 정도가 두경부암의 예후를 결정하는데 있어 가장 중요한 요소이며, 이에 따라 종양의 정확한 병기를 파악하고 나아가 국소 침습 및 전이의 특성을 알아내는 것이 치료에 있어 가장 중요한 요소로 알려져 있다. 
   악성 종양의 국소 침윤과 전이는 여러 단계에 걸쳐 진행된다. 가장 중요한 기전은 기저막(basement membrane)과 종양 세포의 상호작용이다.¹⁾ 종양 세포가 기저막에 부착되면, 종양 세포에서 분비되는 단백 분해효소에 의해 기저막이 파괴되고, 이 파괴된 기저막을 통해 종양 세포가 파급되어 주위의 결합조직으로 전파된다. 또한, 신생혈관생성(angiogenesis)은 종양의 발달, 증식, 전이에 필수적인 과정이다. 종양의 신생혈관은 정상혈관보다 혈관벽이 약하여 보다 쉽게 종양 세포가 침습할 수 있어 림프절 전이의 통로가 될 수 있으므로 신생혈관의 생성은 종양 세포의 성장과 전이에 중요하다.²⁾ 이러한 일련의 과정이 종양의 성장과 전이과정을 통해 반복된다.³⁾
   이러한 암의 국소 침윤과 전이과정에 중요한 역할을 하는 것으로는 Matrix metalloproteinase(MMP)와 Vascular endothelial growth factor(VEGF), Cyclooxygenase(COX), p53 등이 알려져 있다. MMP는 기저막과 간질의 단백 분해에 중요한 역할을 하며,⁴⁾ VEGF는 신생혈관의 생성을 촉진시키고 COX-2는 VEGF를 포함하여 여러 혈관신생 촉진인자들의 생성을 변화시켜 종양의 혈관생성을 조절하여 종양의 성장과 전이에 관여한다.^5,6) 그리고 p53 유전자는 세포주기의 조절, DNA교정 및 세포소멸(apoptosis)에 관여하여 세포의 증식과 변형을 억제한다고 알려져 있다.⁷⁾
   현재까지 두경부 편평세포암에 대한 각각의 COX-2, MMP-9, p53 및 VEGF 발현에 대해서는 많은 연구가 발표되었으나, 두경부 편평세포암에 있어서 이런 인자들의 동시발현성에 대한 연구는 아직까지 미흡한 실정이다. 이에 저자들은 두경부 편평세포암에서 COX-2, MMP-9, p53 및 VEGF의 발현 양상을 알아보아 이들 인자들의 동시발현성이 두경부 편평세포암의 병기, 림프절 전이 및 예후와 어떠한 관계가 있는지를 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   1999년 1월부터 2003년 12월까지 본원에서 두경부 종양에 대한 근치수술을 시행하여 확진된 두경부의 편평세포암 69예를 대상으로 하였다. 69예 중 8예를 제외하고 61예에 대해서 경부곽청술을 시행하였다. 환자의 의무 기록지 및 병리조직 검사결과지를 토대로 미국 암학회(American Joint Commitee on Cancer, AJCC, 2002)의 TNM 체계에 따른 원발 종양의 크기 혹은 국소 침윤 정도(size and/or local invasion of the primary tumor；T), 경부 림프절 전이여부(regional lymph node metastasis；N) 등을 후향적으로 분석하였다. 평균 연령은 56.8세였고, 원발병소로는 구강암이 12예, 인두암이 18예, 후두암이 39예였고, 원발 병소의 병기는 T1 9예, T2 30예, T3 19예, T4 11예였으며 경부 림프절 병기는 Nx가 8예, N0 26예, N1 4예, N2 30예, N3 1예였다(Table 1). 수술시 적출된 종양을 대상으로 면역조직화학적 염색을 시행하여 COX-2, MMP-9, p53 및 VEGF 유전자단백의 발현을 관찰하였다. 

방  법
   선택된 파라핀 포매조직을 4~5 μm 두께로 박절하고 자일렌으로 탈 파라핀 과정을 거친 후 무수알코올, 90%, 75% 및 50% 에탄올에 각각 2분씩 처리하여 함수시켰다. 내인성 과산화효소의 활성을 억제하기 위해 0.3% hydrogen peroxide-methanol에 10분간 처리하고 증류수로 세척한 다음 50 mM Tris 완충용액(TBS, pH 7.5)으로 수세하였다. 그 다음 비특이성 반응을 제거한 후 일체항체인 COX-2 (1：50, Zymed, USA), MMP-9(1：50, Noemarker, USA), p53(DO-7, Dako, Denmark), 그리고 VEGF(1：50, Santa Cruz, USA)를 실온에서 2시간 동안 작용시켰다. 일차항체의 반응 후 TBS로 5분간 3회 수세한 다음 biotin이 부착된 이차항체(Labelled streptavidin biotin kit, Dako)에 20분간 작용시킨 후 통상적인 avidin-biotin complex법으로 염색하였다. 발색제는 3,3-diaminobenzidine을 사용하고 Mayer's hematoxylin으로 대조염색하여 광학현미경으로 관찰하였다.

면역조직화학적 염색의 평가
   두경부 편평세포암에서 유전자 단백의 발현 빈도를 각각 원발 부위, 원발 병소의 병기와 경부 림프절 전이에 따라 분석하였으며, 동시발현빈도도 역시 원발 병소의 병기와 경부 림프절 전이에 대한 관련성을 분석하였다. 항인체 COX-2, MMP-9, p53 및 VEGF 항체를 이용하여 면역조직화학적 염색을 시행한 후 판정은 두 명의 병리의사가 판독하였고, COX-2, MMP-9 및 VEGF에 대해서는 종양 세포의 세포막이나 세포질에 염색된 세포의 수가 10% 이상 그리고 p53에 대해서는 종양 세포의 핵내 염색된 세포가 10% 이상이면 양성으로 간주하였다. 

통계분석
   각각의 유전자 단백의 발현 빈도 및 동시발현빈도와 원발 부위의 병기 및 경부 림프절 전이와의 관계를 알아보기 위하여 chi-square test를 시행하였으며 p값이 0.05 이하인 것을 통계학적으로 유의성이 있는 것으로 판정하였다. 생존율은 Kaplan-Meier method를 사용하여 측정하였고 생존율의 차이는 Log-Rank 법을 이용하여 비교하였다. 

결     과

두경부 편평세포암의 원발 부위에 따른 유전자 단백의 발현빈도
   면역조직화학적 방법으로 각각의 유전자 단백의 발현빈도를 조사한 결과 COX-2는 69예 중 40예인 57.9%에서 양성반응을 나타내었으며 MMP-9은 34예인 49.3%에서, p53은 42예인 60.9%에서, VEGF는 31예인 44.9%에서 각각 양성반응이 관찰되었다. 원발 부위에 따른 각각의 유전자 단백의 발현빈도는 Table 2에 정리하였다.

원발병소의 병기와 면역조직화학적 표지자 발현양상과의 연관성
   원발병소의 병기에 따른 유전자 단백의 발현양상을 살펴 보면 MMP-9의 경우 원발병소의 병기가 진행할수록 MMP-9의 발현이 통계학적으로 유의하게 증가하였다(p=0.021). 하지만, MMP-9을 제외한 COX-2, p53, VEGF 등은 원발병소의 병기와 유전자 단백의 발현간에 통계학적 유의성이 관찰되지 않았다(Table 3). 

경부 림프절 전이와 면역조직화학적 표지자 발현양상과의 연관성
   각각의 유전자 단백의 발현과 림프절 전이와의 연관성을 알아보기 위해, 경부 곽청술을 시행한 61예를 대상으로 관찰한 결과를 보면 COX-2는 림프절 전이가 있는 33예 중 25예(75.8%)에서, 림프절 전이가 없는 28예 중 13예(46.4%)에서 발현되었으며, p53은 림프절 전이가 있는 33예 중 28예(84.8%)에서 림프절 전이가 없는 28예 중에서 13예(46.4%)에서 발현되어 두경부 편평세포암에서 COX-2 및 p53의 발현은 림프절 전이가 있을 경우 통계학적으로 유의하게 증가된다는 것을 알 수 있었다(p=0.019, p=0.001).
   그러나 MMP-9은 림프절 전이가 있는 33예 중 20예(60.6%)에서, 림프절 전이가 없는 28예 중 11예(39.3%)에서 발현되었으며, VEGF는 림프절 전이가 있는 33예 중 18예(54.5%)에서, 림프절 전이가 없는 28예 중 10예(35.7%)에서 발현되었다. 두경부 편평세포암에서의 MMP -9 및 VEGF의 발현은 림프절 전이가 있을 경우 증가하는 경향을 보였으나 통계학적 유의성은 관찰되지 않았다(Table 4).

두경부 편평세포암에서 면역조직화학적 표지자 동시발현과 그에 다른 결과분석
   두경부 편평세포암 69예 중 면역조직화학적 표지자의 발현빈도를 관찰한 결과, 한 가지도 발현되지 않은 경우는 11.6%(8/69), 1가지가 발현된 경우는 24.6%(17/69), 2가지, 3가지, 4가지가 동시발현된 경우는 각각 31.9%(22/69), 21.7%(15/69), 10.2%(7/69)였으며, 이 결과 면역조직화학적 표지자가 2가지 이상 발현된 경우는 63.8%(44/69)였다.
   두경부 편평세포암에서 원발병소의 병기와 COX-2, MMP -9, p53 및 VEGF 단백의 동시발현성에 대해 유전자 단백이 1가지 이하로 발현된 군과 2가지 이상 발현된 군으로 나누어 연관성을 관찰한 결과 조기암군(T1, T2)과 진행암군(T3, T4)에 대한 COX-2, MMP-9, p53 및 VEGF 단백의 동시발현 빈도는 통계학적으로 연관성은 없었다(Table 5). 
   병리학적으로 경부 림프절 전이의 유무를 확인하였던 61예를 대상으로 1가지 이하의 단백 발현이 있었던 경우와 2가지 이상의 단백 발현이 있었던 경우로 나누어 분석한 결과 병리학적으로 경부 림프절 전이가 있었던 군에서 통계학적으로 유의하게 동시발현의 빈도가 높았다(p=0.030)(Table 6).
   추적관찰이 불가능한 11예를 제외한 58예를 대상으로 1가지 이하의 단백 발현이 있었던 경우와 2가지 이상의 단백 발현이 있었던 경우의 생존율을 비교한 결과, 통계학적으로 의미 있는 차이를 보이지 않았다.

고     찰

   발생초기의 아주 작은 크기의 종양이 성장하기 위해서는 신생혈관형성이 필수적이며, 종양의 부피가 커짐에 따라 종양 세포나 침윤된 대식 세포가 여러 가지 혈관형성인자를 생성하여 종양내 미세혈관을 증식시킨다.⁸⁾ 이렇게 증식된 혈관은 종양 세포에 영양을 공급하고, 종양 세포에서 생기는 노폐물을 배출하며 여러가지 성장인자를 분비하여 종양을 성장시킨다.⁹⁾ 또한 신생혈관은 분절된 기저막을 가지고 있고 성숙된 혈관보다 벽이 취약해서 종양 세포들이 쉽게 침범할 수 있기 때문에 신생혈관형성이 암의 전이과정에도 중요한 역할을 하게 된다. 혈관형성인자는 현재까지 10종 이상이 보고되고 있으며,¹⁰⁾ 그 중에서도 종양 세포에서 분비되는 혈관 내피 세포 성장인자(VEGF)가 종양의 성장과 전이에 중요하게 관여하는 것으로 알려져 있다. VEGF는 적어도 두 가지 기전으로 혈관신생에 관계하는 것으로 생각된다. 첫째, 두 개의 tyrosine receptor 단백(flt-1, kdr)과 결합하여 직접 혈관 내피 세포의 세포분열을 촉진시켜 강력한 혈관신생인자로 작용하며, 둘째, 미세혈관의 투과도를 증가시키는 강력한 매개자 역할을 한다. 미세혈관의 투과도가 증가하면 혈장단백이 주변 조직으로 배출되어 세포외 기질을 변화시켜 혈관생성을 용이하게 한다.¹¹⁾ 
   p53은 17번 염색체의 단완에 위치하며, 핵의 DNA에 결합하여 전사인자(transcription factor)로 작용하는 핵인 단백질(nuclear phosphoprotein)의 합성과 연관이 있는 기능을 하는 유전자로서, 종양에서는 돌연변이에 의해 p53 단백질의 DNA결합과 전사조절능력이 소실된다.⁷⁾
   Arachidonic acid로부터 prostaglandin 합성과정에 중요한 역할을 하는 속도조절효소가 cyclooxygenase이다. COX-1은 생리작용에 있어서 광범위한 전신효과, 즉 혈액응고, 배란, 분만의 개시, 골대사, 신경의 성장과 발육, 창상치유, 신기능유지, 혈관긴장상태의 유지 및 면역반응 등에 관여하는 자연적으로 분비되는 효소이다.¹²⁾ 이에 반해 COX-2는 호르몬, 성장인자, phorbol esters, cAMP, 염증인자나 cytokine, 종양유전자 등과 같은 자극에 의해 분비가 유도되는 효소이다.¹³⁾ COX-2의 발현은 야생형 p53에 의해 현저하게 억제되는데, 이러한 이유에 의해 정상 세포에서 COX-2 단백의 발현이 잘 되지 않게 된다.¹⁴⁾ Subbaramaiah 등¹⁴⁾의 실험적 연구에 의하면 정상기능을 하는 야생형의 p53 발현세포는 변이에 의해 비활성화된 p53보다 COX-2의 발현을 억제하는 능력이 10배 더 강하며, 이러한 이유에 의해 종양의 진행과정에서 비활성화된 p53의 과발현과 COX-2의 과발현이 중요한 역할을 할 것이라는 가능성을 시사하였다. COX-2의 작용에 의해 분비된 유도성 prostaglandin은 염증에 대한 연구는 많이 되어왔으나, 이 물질의 과발현이 종양의 발생 및 진행에 중요한 역할을 한다는 것이 알려진 후, 이에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 활성화된 COX-2은 정보전달체계(signal transduction pathway)를 조절하여 세포의 증식, 종양의 성장 및 면역반응에 관여하게 된다.¹⁵⁾ 또한 COX-2는 여러 가지 기능 중에서 신생혈관 조절측면에서 보면 COX는 혈관 내피 세포 성장인자(VEGF)의 발현을 유도하고, VEGF는 endothelial cell mitogen으로 작용하여 종양 신생혈관을 형성하게 되고, 결국은 종양의 성장과 침습을 촉진시키게 된다.¹⁶⁾ 실험적 연구에 의하면 COX-2의 발현은 상피 세포의 세포외기질에 흡착력을 높이며 또한 세포자연사를 억제하므로써 상피 세포의 종양전환을 촉진시키는 역할을 할 수 있다고 한다.¹⁷⁾ 이상에서 보면 종양의 진행과 전이에 있어서 신생혈관형성과 종양유전자 또는 종양 세포에서 분비되는 유전자 산물들의 상호작용이 중요한 작용을 할 것이라는 가능성을 제시할 수 있다.
   종양의 침윤성 성장 과정에서 종괴를 형성한 종양이 원래의 종괴로부터 탈출하여 혈관 또는 림프절로 침범해야 한다. 이를 위해서 종양 세포를 둘러싸고 있는 기저막과 간질을 침윤해야 하는데, 기저막과 간질 성분의 단백 분해에 중요한 역할을 하는 효소 중의 하나가 matrix metalloproteinase(MMP)이다. 이 물질은 적어도 20개 이상의 아형이 있으며, 작용하는 기전이 각각 다른 것으로 알려져 있다.¹⁸⁾ 이 중에서 MMP-9는 기저막의 주성분인 collagen IV를 분해시키는 92KDa의 효소로 유방암, 결장암, 위암등에서 과발현될 수 있다는 보고들이 있으며,¹⁹⁾ Shou 등¹⁵⁾은 종양의 침윤성 성장에 있어서 단백 분해효소와 혈관형성인자와의 관련성을 시사하였다. 
   본 연구에서는 종양의 진행과 전이과정에 있어서 종양 세포에서 분비될 수 있는 유전자산물들의 상호작용이 중요한 역할을 할 것이라는 가능성에 주안점을 두어, 두경부 편평세포암 세포에서 분비될 수 있는 유전자 산물인 COX-2, MMP-9, p53 및 VEGF의 발현빈도, 원발병소 병기 및 림프절 전이유무에 따른 동시발현을 관찰하고자 하였다.
   두경부 편평세포암에서 COX-2의 발현 빈도는 57.9%였으며 MMP-9은 49.3%, p53은 60.9%, 그리고 VEGF는 44.9%에서 발현되었고, 부위에 따른 발현의 차이는 COX-2, p53 및 VEGF는 후두암에서, 그리고 MMP-9은 인두암에서 가장 높은 빈도를 나타내었다. 각각의 표지자들의 발현을 원발부위의 병기와 비교한 결과 MMP-9의 발현이 원발병소의 병기가 증가할수록 통계학적으로 유의하게 발현이 증가되었고, 경부림프절전이와 비교한 결과 COX-2와 p53이 경부림프절전이가 있었던 군에서 전이가 없었던 군보다 통계학적으로 유의하게 발현 비율이 높은 것으로 나타났다. MMP의 역할이 종양 세포 주위의 기저막과 간질을 분해하는 것임을 고려할 때 원발병소 병기의 증가에 따른 MMP 발현의 증가는 종양의 국소침습에 MMP가 중요한 역할을 한다는 것을 시사하는 소견이라고 사료되었다. 그리고 경부림프절전이가 있던 군에서 COX-2와 p53이 과발현되었고 비활성화된 p53이 COX-2의 과발현을 유도하고 이에 따라 종양의 침습과 신생혈관생성이 촉진된다는 기존의 연구 결과를 고려할 때 이 두가지 물질이 두경부편평세포암의 경부림프절전이에 있어 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다. 
   그리고 이러한 표지자들의 동시발현과 두경부 편평세포암의 진행 정도를 비교해 보았을 때 비록 통계학적인 유의성은 관찰되지 않았지만 원발병소의 병기가 증가할수록 동시발현의 정도가 증가하는 것으로 나타났고 경부림프절전이의 경우 한가지 이하의 유전자단백의 발현보다는 두가지 이상의 유전자단백이 동시에 발현되는 것이 경부림프절전이와 통계학적으로 유의하게 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 비록 동시발현의 정도와 생존율이 통계학적으로 유의한 상관관계를 보이지 않았지만 앞서 나온 결과를 볼 때 이러한 표지자들이 서로 상관관계를 가지며 종양의 침습 및 전이에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다. 

결     론

   다른 암과 마찬가지로 두경부 편평세포암에서도 종양의 침습과 전이에 작용하는 여러 가지 물질이 알려져 있으며 이들간에는 서로 활발한 상호작용이 있어 서로 간의 작용을 상승시키거나 감소시킨다. 비록 예는 적지만 본 연구 결과, 이러한 표지자들의 동시발현이 종양의 침습과 전이에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었으며 향후 좀 더 많은 예를 바탕으로 원발부위별로 연구를 한다면 좀 더 좋은 결과를 얻을 수 있을 것이라 사료되었고 각각의 유전자 단백간 상호 작용에 대해서도 추가적인 연구가 필요하다고 사료되었다.

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