교신저자：장태영, 400-711 인천광역시 중구 신흥동 3가 7-206  인하대학교 의과대학 인하대학교병원 이비인후-두경부외과학교실
교신저자：전화：(032) 890-3473 · 전송：(032) 890-3580 · E-mail：jangty@inha.ac.kr

서     론

   Caveolae는 형질막(plasma membrane)에 존재하는 50~100 nm 크기의 작은 함입된 소포체로 1953년 Palade에 의해 처음 발견되었다.¹⁾ 이후 많은 연구에 의해서 caveolae는 형질막의 함입된 소포체 형태뿐만 아니라 형질막과 분리된 소포체, 포도모양의 군집(cluster), 로제트(rosette), 긴 세관(tubule) 등의 형태로도 존재한다는 것이 밝혀졌다.²⁾
   Caveolin은 caveolae를 구성하는 필수적인 단백질이다. Caveolin-1(Cav-1)은 세 가지의 Caveolin 중 가장 먼저 발견되었으며 주로 내피세포, 지방세포, 제 1형 폐포세포, 평활근세포 등에 존재한다. 또한 caveolae가 함입되고 소포체를 형성하는 등의 구조적 변형을 일으키는 데에 중요한 역할을 한다.²⁾ Caveolae/caveolin은 소포이동(vesicular transport)에 의한 단백질의 교통과 콜레스테롤 항상성(homeostasis)에 관여하고 있다. 또한 caveolin이 다양한 하위 신호전달분자와 상호작용함으로써 caveolae는 다양한 신호전달체계의 승강장과 같은 역할을 담당하고 있다. 이러한 신호전달 단백질에는 G-단백질 연결 수용체(G-protein coupled receptor), G-단백질, 성장인자 수용체(growth factor receptor), 비수용체 티로신 활성효소(non-receptor tyrosine kinase), H-Ras, 내피 산화질소 합성효소(endothelial nitrix oxide synthase；eNOS) 등이 있으며 Cav-1은 주로 이 단백질들을 억제하는 기능을 하고 있다.³⁾
   최근 Cav-1과 다양한 임상질환과의 관련성에 대한 연구가 진행되고 있으며 이미 Cav-1이 유방암, 죽상경화증(atherosclerosis), 만성 폐질환, 지방이상증(lipodystrophy) 등의 질환과 연관이 있다는 연구가 있다.³⁾ Cav-1은 여러 세포에서 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase；NOS)와 상호작용하고 있으며 NOS에 의해 생산되는 산화질소(nitric oxide；NO)는 다양한 세포 손상 및 염증 기전에 관련되어 있다. 비과 영역에서는 Cav-1에 대한 연구가 거의 이루어진 바 없으나 한 연구에서 Cav-1이 후각신경세포에도 존재하며 후각신호전달체계에서 중요한 역할을 한다고 하였다.⁴⁾ 하지만 아직까지 사람 코점막 상피세포에서 Cav-1의 발현이 보고된 바 없어 저자들은 사람의 정상 코점막 상피세포에서 Cav-1의 발현을 확인하고 염증반응 시 가장 대표적인 전구물질인 IL-1β의 영향으로 Cav-1 발현 정도가 어떻게 변화하는지 확인하고자 하였다.

대상 및 방법

코점막 상피세포의 계대배양⁵⁾
   만성 부비동염 및 비용으로 내시경적 부비동 수술을 받은 세 명의 환자들에게서 채취한 비용을 1% 단백분해효소(protease, Sigma, St. Louis, MO, USA)가 포함되어 있는 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Gibco, NY, USA)과 Ham's F12 nutrient mixture(F12, Gibco)의 1：1 혼합용액에 하룻밤 동안 처치한 후 검체 표면을 칼로 긁어 상피세포를 분리하였다. 이를 플라스틱 용기에 평판하여 37℃ 배양기에서 1시간 동안 배양하면 상피세포를 제외한 다른 세포들은 플라스틱 용기에 달라붙어 상피세포만을 분리할 수 있게 된다. 상피세포에 계대배양배지(subculture media)를 넣은 후 플라스틱 용기에 다시 평판하였다. 계대배양배지는 bronchial epithelial growth media(BEGM, Clonetics Co., San Diego, CA, USA)에 hydrocortisone(0.5 μg/ ml, Clonetics Co.), insulin(5 μg/ml, Clonetics Co.), transferrin(10 μg/ml, Clonetics Co.), epinephrine(0.5 μg/ml, Clonetics Co.), triiodothyronine(6.5 ng/ml, Clonetics Co.), gentamicin(50 μg/ml, Clonetics Co.), amphotericin B(50 ng/ml, Clonetics Co.), epidermal growth factor(25 ng/ml, Collaborative Res., New Bedford, MA, USA), all-trans retinoic acid(10^-7 M, Sigma), bovine serum albumin(1.5 μg/ml, Sigma), bovine pituitary extract(1% vol/vol, Pel Freez, Rogers, AR, USA) 등의 호르몬 및 성장인자를 첨가한 용액을 사용하였다. 계대배양배지는 평판 하루 후에 갈아주었으며 그 이후에는 2일에 한 번씩 갈아주었다. 80% 합류(confluency)를 이루었을 때 trypsin/EDTA를 처치하여 세포들을 플라스틱 용기로부터 분리시켜 단세포로 만들었다. 이 세포들을 플라스틱 용기에 이차배양하였고 평판 다음 날 배양배지로 갈아주었으며 그 이후에는 2일에 한번씩 갈아주었다. 이때 사용된 배양배지는 BEGM과 DMEM을 1：1로 혼합한 용액을 배양액으로 사용하였으며 배양액에 첨가된 호르몬과 성장인자는 epidermal growth factor를 25 ng/ml에서 0.5 ng/ml로 사용한 것 외에는 계대배양배지에서 사용한 것과 동일하였다. 배양은 37℃ 5% CO₂에서 시행하였다.

Air-liquid interface(ALI) 배양¹⁰⁾과 interleukin-1β(IL-1β) 처치
   80% 합류를 이루었을 때 trypsin/EDTA로 세포를 분리하고 세포의 분화를 위해 반투과성막으로 상하가 구분된 배양기(Transwell-clear, Costar Co., Cambridge, MA, USA)의 위쪽 반투과성막에 각각 1×10⁵개의 세포를 부유하여 평판하였다. 세포가 배양배지에 잠긴 상태로 7일간 배양하였으며 평판 다음 날과 이후 격일로 위 및 아래쪽 배양배지를 갈아주었다. 평판 8일째 위쪽 배양배지를 제거하여 air-liquid interface(ALI)를 형성하여 세포의 상부를 공기에 노출시켰으며 이후 아래쪽 배양배지만 매일 갈아주었다. 배양은 마찬가지로 37℃ 5% CO₂에서 시행하였다. 평판 13일째 배양기의 두 개의 well에는 IL-1β를 처리하지 않고 대조군으로 하였고 두 well에는 IL-1β 10 ng/ml를 나머지 두 well에는 IL-1β 20 ng/ml를 24시간 동안 처리하였다.

역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction；RT-PCR)
   Tri-Reagent(Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA)를 처리하여 세포로부터 총 RNA를 추출하였고 이를 RNA PCR kit Ver. 2.1(TAKARA Bio., Otsu, Shiga, Japan)을 이용하여 cDNA로 합성하였다. 이때 PCR Thermal Cycler(TAKARA Bio.)에서 30℃ 5분, 42℃ 30분, 99℃ 5분, 5℃ 30분 동안 반응시켰다.
   중합효소 연쇄반응을 위해 Table 1과 같은 시발체(primer)를 사용하였다. PCR Thermal Cycler를 이용하여 94℃에서 1분간 초기 변성 후 94℃ 40초, 58℃ 40초, 72℃ 1분간의 주기로 30회 반응시키고 72℃에서 10분간 반응시켜 증폭하였다. PCR 산물을 ethidium bromide(ETBR)가 포함된 1.5% agarose gel에서 전기영동한 후 폴라로이드 필름으로 사진을 찍었다. Densitometry 프로그램(BIO1D Ver. 97, Vilbert Lourmat, Torcy, France)을 이용하여 Cav-1 밴드와 18S rRNA 밴드의 강도를 측정하였다. 18S rRNA 밴드의 강도에 대한 Cav-1 밴드의 강도의 비율을 구하여 처리한 IL-1β 농도별로 비교하였다.

Western blot 분석
   IL-1β 처치한 세포를 단백질 분해효소 억제제(1 mM DTT, 10 μg Leupeptin, 10 μg Trypsin inhibitor, 2 μg Aprotonin, 1 mM PMSF, 1 μg Pepstatin)가 포함된 lysis buffer(320 mM Sucrose, 200 mM HEPES, 1 mM EDTA)로 용해시킨 후 초음파기를 이용하여 세포막을 파쇄시켰다. 파쇄한 시료는 BCA protein assay kit(Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용해 단백질의 양을 정량하였다. 처리한 IL-1β 농도에 따라 각각 다른 lane에 단백질 20 μg을 넣어 10% SDS polyacrylamide gel에서 전기영동하였다. 전기영동된 단백질은 polyvinylidene difloride(PVDF) membrane(Millipore, Miliford, MA, USA)에 4℃에서 18 V로 밤새 전이시켰다. 이 막에 TBST(0.1% Tween 20, 10 mM Tris base, 100 mM NaCl, pH 8.0)에 녹인 5% non-fat dry milk를 실온에서 1시간 반 동안 처리하여 항체와의 비특이적 결합을 억제시킨 후 Cav-1에 대한 다클론 항체(1：2000, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA)와 β-actin에 대한 단클론 항체(1：5000, Sigma)로 밤새 반응시켰다. 10분마다 3회 TBST로 세척 후 Cav-1 다클론 항체로 반응시킨 막은 anti-rabbit IgG 다클론 이차항체(1：5000, Pierce)로 β-actin 단클론 항체로 반응시킨 막은 anti-mouse IgG 단클론 이차항체(1：10000, Pierce)로 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 다시 TBST로 10분마다 3회 세척하고 enhanced chemiluminescence(ECL kit, Pierce)에 막을 2분간 반응시킨 후 암실에서 X-ray 필름(Kodak, NY, USA)에 감광하였다. X-ray 필름을 현상 및 고정한 후 densitometry 프로그램을 이용하여 Cav-1 밴드와 β-actin 밴드의 강도를 측정하였다. β-actin 밴드의 강도에 대한 Cav-1 밴드의 강도의 비율을 구하여 처리한 IL-1β 농도별로 비교하였다.

결     과

역전사 중합효소 연쇄반응
   역전사 중합효소 연쇄반응 결과 사람의 정상 코점막 상피세포에서 Cav-1 mRNA가 발현되었다. 이와 같은 Cav-1의 발현은 IL-1β를 처리하였을 때 농도 의존적으로 감소하였다(Fig. 1).

Western blot 분석
   역전사 중합효소 연쇄반응 결과와 같이 Western blot 분석 결과에서도 정상 사람 코점막 상피세포에서 Cav-1 단백질이 발현됨을 알 수 있었다. 또한 Cav-1의 mRNA 발현 양상과 동일하게 IL-1β를 처리하였을 때 농도 의존적으로 단백질 발현 정도가 감소하였다(Fig. 2).

고     찰

   Cav-1은 세 가지의 caveolin 단백질 가족 중 가장 먼저 발견되었으며 caveolae 형성에 반드시 필요한 단백질이다. 반면에 Cav-2는 Cav-1과 이형과합체(hetero-oligomer)를 형성하고 있으며 caveolae 형성에 반드시 필요하지는 않다. Cav-3는 Cav-1 상동유전자의 cDNA 라이브러리 검색을 통해서 발견되었으며 심근세포와 골격근세포의 형질막에 있는 caveolae를 구성하고 있다.³⁾ Cav-1은 내피세포, 섬유모세포, 제 1형 폐포세포, 지방세포, 평활근세포 등에 풍부하게 존재하며 성장인자 수용체 단백질을 포함하는 여러 신호전달 단백질의 기능을 억제하여 일반적으로 증식 억제 기능을 나타낸다.
   최근 연구들은 다양한 질환의 발생과 진행에 있어서 Cav-1이 관련 있다는 것을 보여주고 있다. 원발성 유방암과 구강 상피세포암에서 Cav-1 유전자의 돌연변이가 발견되었으며 갑상선암에서 Cav-1과 Cav-2의 발현이 감소되어 있다는 것이 발견되었다.^6,7,8) 또함 Cav-1 결손 마우스는 화학물질 유발성 피부 종양이 더 잘 발생하는 것으로 알려져 Cav-1은 종양 억제 유전자의 기능이 있을 것으로 생각되고 있다.⁹⁾
   폐는 Cav-1이 가장 많이 발현되어 있는 조직 중의 하나로 폐포 내피세포뿐만 아니라 제 1형 폐포세포에도 풍부하게 발현되어 있다. Cav-1 결손 마우스의 폐세포에서는 과세포충실성(hypercellularity)과 폐포 중격이 두꺼워진 소견 등 과증식성의 표현형을 보였다.¹⁰⁾ 이러한 소견은 Cav-1이 제한성 폐질환과 관련이 있을 수 있음을 말해준다. 또한 Cav-1이 없는 지방세포는 세포의 지름이 감소하고 분화가 잘 되지 않은 소견이 관찰되었으며 이는 비만과의 관련성을 보여주는 소견이다.¹⁰⁾
   Cav-1은 혈관 생리 분야에서 가장 잘 연구되어 왔다. Cav-1은 혈관 내피세포에서 eNOS의 기능을 억제하고 있어 Cav-1을 결손시키면 Cav-1의 eNOS 억제효과가 사라지므로 강력한 혈관확장물질인 산화질소(NO)가 증가하여 혈관의 긴장도가 낮아진다.¹⁰⁾ 또한 Cav-1 결손 마우스의 혈관내피세포에서 미세혈관 투과성이 증가하는 소견도 관찰되었다.¹¹⁾ 이러한 소견으로 미루어 Cav-1은 혈관 긴장도와 투과성을 조절하는 중요한 단백질로 생각되며 죽상경화증과 같은 혈관질환의 병태생리와 관련이 있을 것으로 추정된다. 한 연구에서는 Cav-1을 완전히 결손시키면 죽상경화증 발생을 막을 수 있을 것이라고도 하였다.¹²⁾
   한 연구에서 Cav-1은 Cav-2과 함께 후각상피세포에서도 발견되었다. 이 연구에서 Cav-1은 G단백질과 같은 신호전달분자와 상호작용함으로써 후각신호를 전달하는 데 결정적인 역할을 한다고 하였다.⁴⁾ 하지만 아직까지 사람의 정상 코점막 상피세포에서 Cav-1의 발현을 보고된 바는 없었다. 본 연구에서는 정상 코점막 상피세포로의 분화를 유도할 수 있는 ALI 방법으로 정상 코점막 상피세포를 배양하여 역전사 중합효소 연쇄반응과 Western blot 분석을 시행하였다. 그 결과 사람 정상 코점막 상피세포에 Cav-1이 발현되어 있음을 알 수 있었다. 본 저자들은 사람 코점막 상피세포의 염증과정에서 Cav-1이 관련 있는지를 확인하기 위하여 강력한 염증유발 사이토카인으로 알려진 IL-1β를 농도별로 처리하여 Cav-1의 발현을 관찰하였다. 그 결과 처리한 IL-1β의 농도를 증가시킴에 따라 Cav-1의 발현이 mRNA 수준에서 감소한다는 것을 알 수 있었다. 이 소견으로 미루어 Cav-1이 사람 코점막의 염증과정과 관련이 있을 것이라고 생각된다.
   다른 세포에서도 아직까지 염증과정에서 Cav-1의 역할에 대해서는 정확히 밝혀지지 않았다. Cav-1 결손 마우스를 이용한 실험에서 리포다당질(lipopolysaccharide)을 투여하였을 때 Cav-1 knock-out 마우스의 폐에 비해 Cav-1 wild-type 마우스의 폐에 중성구 분리가 많이 일어났고 미세혈관 투과성과 부종 형성이 증가하였다. 이 연구에서는 Cav-1이 eNOS에 의한 NO 생성을 통해 리포다당질에 대한 염증 반응을 조절할 수 있다고 하였다.¹³⁾ 반면에 다른 연구에서는 마우스 대식세포에서 Cav-1의 발현을 감소시킨 경우 염증유발 사이토카인인 TNF-α, IL-6가 증가하였고 염증억제 사이토카인인 IL-10이 감소하였으며 Cav-1의 발현을 증가시키면 반대의 현상이 나타났다. 따라서 Cav-1이 MKK3/p38 MAPK 경로를 통해 항염증 효과를 가진다고 하였다.¹⁴⁾
   사람 코점막 상피세포의 염증 과정에서 Cav-1의 역할을 밝히기 위해서는 이 과정에서 Cav-1이 관여하는 신호전달체계에 대한 연구가 필요할 것이다. 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase；NOS)는 여러 세포에서 Cav-1과 상호작용하고 있으며 NOS에 의해 생산되는 NO는 다양한 세포 손상 및 염증 기전에 관련되어 있다. 세 가지의 NOS 중에서 유도형 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase；iNOS)는 다른 동위효소와 다르게 칼슘의 농도와 관계없이 활성을 보이며 IL-1β, TNF-α, IFN-γ와 같은 염증유발 사이토카인에 의해 전사(transcription) 수준에서 발현이 조절되어 염증반응이 있을 때 다양한 세포에서 발현된다.¹⁵⁾ iNOS는 정상 코점막 상피세포에서도 발현되며¹⁶⁾ 정상 하비갑개 점막 상피세포에 비해 비용 상피세포에 더 많이 발현된다고 알려져 있다.¹⁷⁾ 따라서 비용 발생의 병인론에 대하여 초기 염증반응에 의해 iNOS가 증가하고 다량의 산화질소가 생성되며 산화질소에 의해 염증이 지속되어 비용이 발생하는 것으로 설명하기도 한다.¹⁷⁾ Cav-1은 NOS의 caveolin 결합 motif와 상호작용함으로써 eNOS와 신경 산화질소 합성효소(neuronal nitic oxide synthase；nNOS)의 활성을 억제한다.²⁾ iNOS도 이와 유사한 motif를 가지고 있지만 Cav-1이 다른 NOS와 마찬가지로 iNOS의 활성 억제 효과가 있는지는 논란의 여지가 있다.¹⁸⁾ 하지만 사람 대장암종 세포를 이용한 최근 연구에서는 Cav-1이 단백질 분해과정을 통해서 iNOS의 활성을 억제한다고 보고한 바 있다.¹⁹⁾ 반면에 췌장 β세포를 이용한 한 연구에서는 IL-1β에 의해 인산화된 Cav-1은 Ras 신호전달체계를 활성화함으로써 iNOS 발현과 산화질소 생성을 증가시킨다고 하였다.²⁰⁾ 이러한 연구들을 종합하여 볼 때 코점막 염증과정 및 비용 발생에서 Cav-1과 iNOS가 관련 있을 것이라는 가설을 제기할 수 있을 것이며 이를 증명하기 위해서는 더 많은 연구가 필요할 것이다.

결     론

   사람 코점막 상피세포에서 Cav-1이 발현됨을 확인할 수 있었다. 또한 염증유발 사이토카인인 IL-1β를 처리한 결과 Cav-1의 발현이 농도 의존적으로 감소되었다. 따라서 사람 코점막의 염증 반응과정에서 유리되는 다양한 사이토카인들의 영향으로 면역기전에 작용하는 Cav-1의 새로운 역할들이 규명되어야 할 것이다.

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