교신저자：권순영, 425-020 경기도 안산시 단원구 고잔동 516  고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
교신저자：전화：(03`1) 412-5962 · 전송：(031) 412-5174 · E-mail：entkwon@chollian.net

서     론

   비인강암은 해부학적 특징 때문에 조기에 발견이 어려워 진단 시에 진행된 병기로 발견되는 경우가 많으며, 다른 두경부암과 달리 원격전이가 모든 예의 50%까지 보고되고 있다.^1,2) 비인강암은 다른 두경부암들보다 방사선 치료에 더 잘 반응하기 때문에 일차적인 선택으로 방사선 치료가 시도되어 왔고, 방사선 치료에 따른 5년 생존율은 32~62%로³⁾ 보고자에 따라 성적이 다양하다. 비인강암은 국소 재발률과 원격 전이의 빈도가 높아서, 최근에는 국소적으로 진행된 비인강암에서 방사선치료와 항암화학요법의 병행요법이 표준치료 방법으로 시도되고 있다.⁴⁾ 그러나 같은 병기 내의 환자들 간에도 치료결과가 다양하게 나타나서 치료 반응률에 영향을 미치는 다른 인자가 있을 것으로 생각되고 있다.
   c-kit 유전자는 tyrosine kinase의 기능을 가지는 경세포막 수용체로 정상조직에서는 mast cells, melanocytes, hematopoetic stem cells, interstitial cells of Cajal에서 발현이 되는 proto-oncogene이다.⁵⁾ 이러한 c-kit 단백이 발현되는 종양으로 mastocytosis, gastrointestinal stromal tumors(GIST), natural killer/T-cell lymphomas, acute myeloid leukemia, myeloproliferative disorder 등이 있으며 c-kit 단백의 발현은 종양의 침윤이나 전이에 관여하고 예후에 관련이 있다고 알려져 있다.⁶⁾
   최근 만성골수성백혈병의 병인으로 알려진 Bcr-Abl 유전자(tyrosine kinase 활성을 가지는 종양 유전자)를 억제하는 약제로서 개발된 selective tyrosine kinase inhibitor인 imatinib mesylate(STI571, Gleevec(r))가 c-kit 유전자의 변이를 나타내는 위장관 기질암(GIST)에서도 치료에 효과적인 것으로 보고되었다.⁷⁾ 따라서 다른 악성종양에서의 imatinib mesylate의 치료가능성이 연구되고 있으며 비인강암에서는 c-kit 단백이 이스라엘 환자의 33%에서 발현된다는 보고가 있었다.⁸⁾
이에 저자들은 본원에서 비인강암으로 진단 받고 치료한 환자의 표본을 대상으로 c-kit 단백의 면역조직화학적 염색을 시행하고, PCR-SSCP(polymerase chain reaction-single strand conformational polymorphism) 방법과 sequencing을 통해 c-kit 유전자 변이를 검출하여, 비인강암 환자에서 c-kit 단백의 발현도와 유전자 변이 양상을 살피고 임상적 특성과의 연관성을 비교하고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   1996년 2월부터 2004년 6월까지 비인강암으로 진단된 후 항암화학요법 및 방사선 치료를 받은 환자의 비인강암 조직 표본 중 비교적 상태가 양호한 20예를 대상으로 하였다. 의무기록을 후향적으로 분석하여 성별, 연령, 조직학적 분류, 병기, 생존율 등의 임상기록을 조사하였다. 남녀의 성별 비는 17：3으로 남자의 빈도가 많았고, 진단 당시의 연령은 36세부터 86세로 평균연령은 56세였다.

면역조직화학적 염색
   10% 중성 포르말린에 고정한 후 파라핀에 포매한 조직을 4 μm 두께로 박절하여 유리 슬라이드에 부착시켰다. 60℃의 항온기에서 한 시간 가온한 다음 통상적인 방법으로 탈파라핀과 함수과정을 거쳤다. 내인성 과산화효소의 활성을 억제시키기 위해 3% 과산화수소수를 사용하여 10분간 처리한 후 증류수와 tris 완충액(pH 7.4)에 세척하였다. 항원회복을 위해 압력솥에서 citrate 완충액(pH 6.0)에 넣고 가열하여 끓기 시작할 때 슬라이드를 넣고, 압력이 최고(103 kpa)에 도달한 후 2분간 더 끓인 다음, 찬물에 담가 압력을 낮춘 후 슬라이드를 꺼내 tris 완충용액에 담갔다. c-kit에 대한 1차 monoclonal antibody로 antibody dilution reagent solution(Zymed, U.S.A)에 1：100으로 희석하여 100 μl씩 처리하고 1시간 동안 반응시켰다. 일차항체 반응 후 tris 완충액으로 수세하여 일차항체를 제거하고, LSAB 2 system peroxidase(DAKO, Carpinteria, U.S.A)를 이용하여 이차항체 biotinylated link anti-mouse and anti-rabbit immunoglobulin을 가하고 30분간 방치하였다. 슬라이드를 다시 tris 완충용액에 세척한 후 과산화효소가 결합된 streptavidin-HRP를 이용하여 실온에서 30분간 반응시키고 Tris 완충액으로 10분간 수세하였다. 발색제인 DAB(3,3’-diaminobenzidine)를 떨어뜨려서 2~3분 정도 반응시킨 후 증류수에 씻어 Mayer’s hematoxylin으로 5분간 대조염색하고, 탈수과정을 거쳐 봉입하였다.

판  독
   염색결과 판독은 병리전문의에 의하여 과거의 조직병리학적, 임상적 정보 없이 시행되었으며 광학현미경 100배율 시야에서 종양세포의 세포질이 적갈색으로 염색되고 염색된 세포의 수가 반정량적으로 전체 세포수의 10% 이상일 때 양성, 50% 이상일 때 강한 양성으로 판독하였다.

c-kit 유전자에 대한 PCR-SSCP 방법

파라핀 포매조직에서 DNA 추출
   숙련된 병리의사에 의하여 정상주위조직을 제외한 병변이 있는 것으로 생각되는 파라핀 블록의 부위를 골라서 각각 10 μm 두께로 4조각씩 박절한 후 Eppendorf tube에 넣은 다음 파라핀을 제거하기 위해 xylene 1 ml를 가한 후 56℃에서 5분 동안 방치하였다가 13,000 rpm으로 10분간 24℃에서 원심분리를 하였다. 이런 과정을 3회 반복하였다. 무수메탄올 1 ml를 각각 가하고 5분간 방치한 후 10,000 rpm에서 8분간 원심분리하였다. 과정을 3회 반복한 후 알코올을 제거하기 위하여 상온에서 완전히 시료를 건조시켰다. High Pure PCR Template Preparation Kit에서, tissue lysis buffer 200 μl와 Proteinase K 40 μl를 가한 후 56℃에서 24시간 방치하였다. Binding buffer 200 μl를 가한 후 혼합하여 72℃에서 10분간 방치하고 isopropanol 100 μl와 혼합하였다. 8,000 rpm에서 원심분리를 1분간 한 후 collection tube를 교체하였다. Inhibitol Removal Buffer 500 μl를 넣고 8,000 rpm에서 1분간 원심분리시키고 washing buffer 500 μl를 가한 후 원심분리하고 collection tube를 버리고 1.5 ml reaction tube에 filter tube를 끼웠다. 마지막으로 72℃ elution buffer 200 μl를 filter tube에 가한 후 1분간 원심분리하고 microfuge tube에 DNA를 얻어 -20℃에서 보관하여 template DNA로 사용하였다.

중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction)
   c-kit exon 9, 11, 17에 대해 PCR을 실시하였다. 증폭시킬 각 DNA 2 μl(200~400 ng), primer 각각 1.5 μl, 2 μl dNTP , 2 μl buffer, 0.2 μl Taq polymerase를 가하여 20 μl가 되게 한 후 PCR thermal cycler(Perkin Elmer 2, 400-U.S.A.)를 사용하여 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초간의 반응을 44회 반복하였다. 증폭된 PCR 산물을 1.5% agarose gel 전기영동으로 확인하였다. PCR 양성대조군으로 추출한 DNA에서 β-globin에 대한 PCR을 동시에 실시하였다. 각 유전자에 대한 시발물질(primer)의 염기서열은 다음과 같다.
   c-kit, exon 9
      Forward(sense)：5'-TTT GGA AAG CTA GTG GTT CA-3'
      Reverse(antisense)：5'-ATG GTA GAC AGA GCC TAA AC-3'
   c-kit, exon 11 
      Forward(sense)：5'-ATT, ATT, AAA, AGG, TGA, TCT, ATT, TTT, C-3'
      Reverse(antisense)：5'-ACT, GTT, ATG, TGT, ACC, CAA, AAA, G-3'
   c-kit , exon 17
      Forward(sense)：5'-TTC, ACT, CTT, TAC, AAG, TTA, AAA, TG-3'
      Reverse(antibody)：5'-GGA, CTG, TGA, AGC, AGA, GAA, TG-3'
   β-globin
      Forward(sense)：5'-TGACGGGGTCACCCACAC TGTGCC-3'
      Reverse(antibody)：5'-CTAGAACCATTGGGGT GGACGATG-3'

Single stand conformational polymorphism(SSCP) 으로 유전자 변이조사
   PCR산물을 10 μl를 취해 끓이면서 변성시킨 후, 얼음으로 급히 냉각시킨 다음, 5% glycerol을 포함한 12% polyacrylamide gel에서 250 V로 5시간 전기영동을 하였다. 전기영동이 끝난 gel은 10% ethanol로 10분간 고정시킨 후, 아래에 기술한 은 염색법으로 DNA Single band pattern을 확인하였다. 먼저 gel을 1% nitric acid에서 3분 담근 다음 증류수를 가해 3분간 세척하고 다시 0.2% silver nitrate 용액(0.2% silver nitrate, 300 μl formaldehyde (37%), 200 ml D.W)을 30분간 반응시킨 후 재빨리 증류수로 세척하였다. 발색용액(6 g sodium carbonate, 120 μl formaldehyde, 200 ml D.W, 100 μl sod. Thiosulfate (1%))을 가한 후 band가 뚜렷이 보일 때까지 반응시키고 10% glacial acetic acid로 고정시켰다. 양성대조군으로 정상인의 혈구세포에서 분리한 DNA를 이용하여 SSCP band 양상을 비교검토하였고 3730 AB1 applied biosystem에서 sequence를 확인하였다.

자료분석 및 통계처리 방법
   SPSS 11.0 프로그램을 사용하여 임상적 자료를 분석하였다. Fisher's exact test를 통하여 각 군 간에 유의한 차이가 있는지 알아보았고, Kaplan-Meier survival analysis와 log-rank test를 이용하여 c-kit 양성군과 음성군간의 차이를 비교하였다. 유의수준은 p<0.05로 하였다.

결     과

면역조직화학적 염색
   숙련된 병리전문의에 의한 면역조직화학적 염색의 판독 결과(Fig. 1), 양성을 10% 이상의 염색으로 할 경우 65%(13/20)의 발현율을 보였으며, 50% 이상의 염색을 강한 양성으로 할 경우 강한 양성 발현은 40%(8/20)에서 보였으며, c-kit이 발현된 군 중에서는 61.5%(8/13)였다. c-kit 단백 발현도를 성별, 연령(60세 미만 군과 60세 이상 군), WHO type, 병기별로 나누어 비교한 결과 발현도의 의미있는 차이는 각 군에서 관찰되지 않았다(p<0.05)(Table 1). c-kit 단백 발현군(13예)과 c-kit 단백 미발현군(7예)의 생존율 차이를 분석한 결과, 양 군에서 병기의 중앙값은 3기로서 동일하였고 c-kit 단백 미발현군에서 생존율이 높은 경향이 관찰되었으나 두 군 간의 통계적으로 의미 있는 차이는 없었다(p=0.0867)(Fig. 2).

PCR-SSCP 결과
   c-kit gene의 유전자 변이 여부를 확인하기 위하여 PCR-SSCP를 시행한 결과 총 20예 중 4예에서 유전자 변이가 관찰되었다. 이 중 exon 9에서 3예, exon 11에서 2예, exon 17에서 2예에서 유전자 변이가 관찰되었다(Fig. 3).
   Exon 9의 3예는 면역조직화학적 염색에서 각각 60%, 80%, 90%의 발현도를 나타내었고, exon 11의 2예는 각각 60%, 80%의 발현도를, exon 17의 2예에서는 각각 60%, 80%의 발현도를 나타내었다.

Sequencing 결과
   유전자 변이가 관찰된 예에서 시행한 DNA sequence analysis결과는 다양한 양상의 염기서열 변화를 보였으며 일관적인 변화 양상을 관찰할 수는 없었다(Fig. 4).

고     찰

   c-kit 유전자에 의해 발현되는 c-kit 단백은 14.5~16.5 kDa 크기의 인단백으로 줄기세포인자(stem cell factor)라고 불리는 kit 리간드에 대한 경세포막 수용체이면서 tyrosine kinase의 기능을 가지고 있다.⁹⁾
   Stem cell factor가 receptor tyrosine kinase(KIT)에부착되면 intracellular domain에 존재하는 tyrosines가 auto-phosphorylation이 되며 이에 따라 KIT가 dimerization 되는 과정을 거쳐 세포분열 과정이 조절된다. 그러나 c-kit 유전자 변이가 일어나면 stem cell factor와 같 은 ligand가 부착되지 않은 상태에서 phosphorylation이 일어나고(ligand-independent phosphorylation), KIT가 활성화되어 세포주(cell line)가 인자의존적 성장(factor-dependent growth)에서 인자비의존적 성장(factor-independent growth)을 하게 되어 이 결과로 악성세포 과다분열이 발생하게 된다.^10,11,12)
   c-kit(CD117)가 정상적인 두경부 조직에서 발현된다는 보고는 없었고, 정상적인 비인강의 상피세포에서도 발현되지 않는 것으로 알려져 있다.¹³⁾ 현재까지 c-kit이 발현되는 것으로 보고된 종양으로는 비만세포 질환, seminoma, serous ovarian carcinoma, melanoma로 중등도 이상의 발현을 보였으며,¹³⁾ childhood sarcoma,¹⁴⁾ angiomyolipoma,¹⁵⁾ adenoid cystic carcinoma¹⁶⁾의 일부에서 강한 양성이 보고되었다. 위장관 기질암(GIST)에서는 c-kit 유전자의 변이 상태와 상관없이 모든 예에서 c-kit 발현이 나타나는 것으로 알려지고 있다.¹⁷⁾ 이에 따라 chronic myeloid leukemia의 치료에 가장 효과가 좋은 단일제제로 알려진¹⁸⁾ imatinib mesylate의 항 c-kit 효과(anti-c-kit effect)를 이용하여 GIST 치료에 시도한 결과, imatinib mesylate의 효과가 뛰어나며 치료제로의 사용 가능성이 보고되었다.¹⁹⁾
   비인강암에서 CD117의 발현에 대한 연구는 2003년 이스라엘에서 최초로 보고하였고,⁸⁾ 이후 비인강암에 대한 연구는 발견할 수 없었다. 이전의 보고에 따르면 60세 이상의 연령군과 WHO type I의 군, Epstein-Barr virus 음성군에서는 c-kit 양성을 발견할 수 없었다고 보고하고 있으나, 본 연구에서는 EBV 검색은 실험실의 사정으로 시도하지 않았으며 연령과 WHO type에 따른 조직형은 c-kit 양성 발현과 관계가 없는 것으로 조사되었다. 생존율에 대한 연구에서는 이전의 연구와 마찬가지로 c-kit 단백의 발현이 기존에 알려진 예후인자들(병기, 조직형) 외에 예후인자적인 의미를 더하지는 않는 것으로 나타났다. 그러나 본 연구에서 생존율의 의미를 분석하기에는 환자의 수가 너무 적었으며 병기와 조직형 등의 예후인자가 통제되지 않은 상태였고 연구기간이 짧아 분석이 완료되지 않은 예가 많았기 때문에 생존율에 의미를 두기에는 한계가 있었으며, 향후 비인강암에서 생존율에 대한 대규모의 코호트연구가 필요할 것으로 생각된다.
   PCR-SSCP 실험을 통해 유전자 변이가 있는 것으로 나타난 4예들은 모두 면역조직화학적 염색에서 60% 이상의 염색을 보였으며, 이는 강한 양성을 보인 8예 중의 50%에서 유전자 변이를 보인 것으로, 유전자 변이가 있는 예의 염색률 평균은 77.5%로 유전자 변이가 없는 예의 염색률 평균인 24.3%보다 높았다. 유전자 변이가 있는 예와 없는 예를 각각 강한 양성을 보이는 군과 강한 양성을 보이지 않는 군으로 나누어 통계적 검증을 시행한 결과, 유전자 변이가 있는 군에서 면역조직화학적 염색상 강한 양성을 보이는 확률이 유의하게 높음을 알 수 있었다(p=0.014). 이를 통해 c-kit 발현율이 높을 수록 유전자 변이의 빈도가 높다고 유추할 수 있었다. Sequencing을 통한 연구에서 변이는 여러가지 domain에서 다양한 양상으로 관찰되었고, 유전자 변이로 인한 발병기전을 유추하거나 imatinib mesylate에 대한 치료 반응도를 예측하기에는 한계가 있었다.
   그러나 비인강암에서 c-kit가 발현된다는 것은 이 종양이 imatinib mesylate의 잠재적 치료대상이 될 수 있다는 것을 의미하며, imatinib mesylate의 치료효과는 mutant receptor에 좀 더 강한 억제효과를 가지므로 치료 반응에 대한 효과를 분석하려면 유전자 변이의 분석이 중요할 것으로 생각된다. 향후 다양한 oncogene, tumor suppressor gene 변이에 대한 연구를 통하여 비인강암의 병인의 이해를 높이며, imatinib mesylate의 치료가능성을 밝혀낼 수 있을 것으로 사료된다. 

결     론

   한국인의 비인강암 환자에서 c-kit 단백의 발현은 65%에서 관찰되었다. c-kit 단백의 발현도가 높을수록 c-kit DNA 변이도가 높은 것을 알 수 있었고, 위의 결과를 통해 비인강암도 imatinib mesylate의 잠재적 치료대상이 될 수 있을 것으로 생각된다.

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