교신저자：김광현, 110-744 서울 종로구 연건동 28  서울대학교 의과대학 이비인후과학교실
교신저자：전화：(02) 760-2448 · 전송：(02) 745-2387 · E-mail：kimkwang@snu.ac.kr

서     론

   갑상선암은 내분비 기관에서 기원하는 종양 중 가장 흔한 종양 중의 하나이다. 이는 조직학적으로 유두암과 여포암으로 대별되는데, 가장 흔한 종류는 유두암으로 같은 여포세포에서 기원한 종양이기는 하나 여포암과 크게 다른 병리학적 특징을 갖는다. 분화된 갑상선암은 완치율이 매우 높은 질환으로, 기본적인 수술적 치료와 방사성 요오드 치료만으로 10년 이상의 장기 생존율을 보인다. 진행된 경우에는 폐와 뼈에 전이될 수도 있고, 비교적 림프절 전이도 흔한 종양으로 알려져 있지만 이 역시 원발 종양의 크기가 크거나 환자가 고령인 경우를 제외하고는 경한 임상경과를 보이는 것으로 알려져 있다.¹⁾ 그러나 1~7%의 발생률로 매우 드물게 나타나는 갑상선암의 기관식도 침범은 환자의 나이, 원격전이 여부, 치료 전 종양의 크기나 종양의 완전 제거 여부와 함께 생존율에 있어 나쁜 예후인자이다.²⁾ 이러한 갑상선암의 침습성에 대해 예측할 수 있는 적절한 표지자가 있다면 갑상선암의 치료에 매우 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
   최근 들어 S100 칼슘결합단백들이 암세포에서 세포분화와 성장, 신호 전달 등을 조절하는 기능을 하며, 이로 인해 암의 전이과정에 중요한 역할을 담당하는 것으로 관심을 모으고 있다. 또한 신경세포와 여러 염증세포들에서 세포 성장, 세포간 교통, 에너지 대사, 세포 내 신호전달에 다양하게 관여한다. S100 칼슘 결합 단백은 1번 염색체의 q21위치에 존재하는 유전자로부터 발현되며 현재까지 최소한 17개의 유전자가 알려져 있다.³⁾
   S100A4는 이러한 S100가족(family)의 한 종류로 Davies 등은 전이성 생쥐 유선세포주에서 S100A4가 증가되어 있음을 보였고,⁴⁾ 여러 다른 연구들에서도 악성종양의 성장과 침습성에 중요한 역할을 수행하는 것으로 보고 되었다.⁵⁾ 여러 임상연구들에서도 전립선암, 방광암, 위암 등에서 종양의 공격적인 특성과 전이, 나쁜 예후와 관련이 있음을 보고한 바 있다.^6,7,8)
   S100A2는 다른 S100 유전자와 달리 p53에 의해 전사 과정이 조절되는 암 억제 유전자로 여겨지고 있다.⁹⁾ 더욱이 후두암, 전립선암 등 여러 암종에서 S100A2가 정상세포에 비해 하향 조절되어 발현되는 양상이 보고되고 있어 이러한 주장을 뒷받침하고 있다.^6,10) 그러나 최근 식도암이나 폐암에서는 S100A2가 나쁜 예후와 관련이 있다는 주장들이 대두되고 있다.^11,12,13)
   본 연구에서는 갑상선 유두암의 종양학적 특성과 S100A4 와 S100A2의 발현과의 관련성을 면역조직화학염색법을 이용하여 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

병리 조직
   1993년 1월부터 2004년 12월까지 본원에서 갑상선 종양으로 진단받고 수술을 시행 받은 환자들 중 재수술 예를 제외하고, 병리 조직을 구할 수 있었던 75명의 환자들을 대상으로 연구를 수행하였다. 환자들의 임상적인 정보와 병리 판독 소견을 얻기 위해 의무기록을 검토하였고, 수술 시 얻어진 병리 조직으로 만들어진 파라핀 블록을 이용하여 면역조직화학염색을 시행하였다. 실험대상의 조직 분포는 유두암이 65예였고 이중 3예가 여포양 변종이었다. 그 외 갑상샘종(Adenomatous goiter)이 4예, 여포암과 역분화암이 각각 3예씩이었다. 환자의 성별 분포는 남성이 8명이고 나머지 67명의 환자는 여성이었다. 성별의 분포가 고르지 않음으로 인해 발생할 수 있는 오류를 배제하기 위해 환자의 성별과 T 병기와의 교차분석을 시행하였고, 이는 통계적으로 차이가 없었다(p=.746). 연령 분포는 19세에서 77세로 평균 52.5세였고, 평균 추적관찰 기간은 48.6개월이었다. 이 기간 중 사망한 환자는 없었지만 8명의 환자들에서 추적관찰 도중 재발이 발견되었고, 이 중 국소 재발 3예, 경부 재발 2예, 원격 전이가 3예였다. 

면역조직화학염색
   면역조직화학염색을 위해서 파라핀으로 포매된 조직을 4μm 두께로 잘라 절편 슬라이드를 만들었으며 xylene에 30분간 탈 파라핀 과정을 거쳤다. 100%, 95%, 70%의 에탄올에 각각 3분씩 처리하여 함수화를 유도하였다. 일차 증류수에서 3분 세척 후 citrate buffer(pH 6.0) 용액에 담그고 전자레인지에서 20분간 가열하여 항원 회복(antigen retrieval)을 시행하였다. 내인성 과산화효소의 활성을 억제시키기 위하여 메탄올로 희석한 3% 과산화수소(H₂O₂)에서 4분간 반응시킨 후 phosphate buffered saline(PBS, 0.1 mol/L, pH 7.4)에 세척하였다. 비특이 결합을 줄이기 위한 봉쇄항체(blocking antibody)로 10% fetal bovine serum(FBS)을 사용하였으며 상온에서 15분간 반응 시켰다. 일차 항체로 S100A4(Dako, Copenhagen, Denmark), S100A2(Neomarkers, Fremont, CA, USA)에 대한 다클론 항체를 각각 1：800, 1：400으로 희석하여 도포한 뒤 4℃에서 12시간(over night) 반응시킨 후 PBS에 3번 세척하였다. 이차 항체(Dako, Strept ABComplex Duet, mouse/rabbit, Denmark)는 도포하여 상온에서 20분간 반응시킨 후 재차 세척하였다. 발색은 Diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB, Xymed)를 이용하였다. Counter staining을 위해서는 Mayer's-hematoxylin으로 염색하였고 universal mount를 이용하여 봉입하였다. 양성 대조군으로는 구개편도 비대로 수술을 시행 받은 정상인의 편도선 병리 조직을 이용하였으며 음성 대조군으로는 일차 항체를 제외한 모든 과정을 양성 대조군과 동일하게 처리한 표본을 사용하였다.

면역조직화학염색 결과의 판독
   병리 판독은 본 연구의 배경에 대해 알지 못하는 한 명의 병리학자에 의해 이루어졌다. 두 종류의 S100 단백 모두 세포질에 주로 염색되었고 핵에도 부분적으로 염색되는 양상이었으나, 뚜렷한 염색양상의 차이가 관찰되었다. S100A4는 한 슬라이드에 보이는 종양세포들 전체에 균일하게 염색이 되지만 그 강도가 여러 종양표본들에서 차이가 나는 양상이었다. 반면에 S100A2는 한 슬라이드 내부에서 일부 종양세포에는 진하게 염색되지만 다른 세포들은 주변배경과 같은 정도로만 염색되며, 각 슬라이드에서 진하게 염색되는 세포의 비율이 달라지는 양상을 보였다. 따라서 S100A4 단백의 염색결과는 세포질의 염색 정도(intensity)를 기준으로 거의 염색되지 않은 경우 (-), 약하게 염색된 경우 (+), 중간 정도로 염색된 경우 (++), 강하게 염색된 경우 (+++)의 4단계로 구분하였다. 반면 S100A2는 전체 세포 중 세포질에 양성으로 염색된 세포의 비율을 기준으로 전체 세포의 5%미만의 세포가 양성으로 염색된 경우 (-), 5~25%인 경우 (+), 25~75%인 경우 (++), 75% 이상인 경우 (+++)의 4단계로 구분하였다.
   종양의 침습성과 S100단백의 발현 정도에 대한 관련성을 보기 위해 종양의 중심부위와 주변부위에서 각각의 발현 정도를 따로 관찰하였다. 주변부위는 현미경 관찰 시 고 배율(×400) 시야에서 종양의 경계가 보이는 범위까지로 정하였고 이보다 안쪽인 경우는 종양의 중심부위로 정하였다. 종양의 중심부위와 주변부위에서 염색 정도나 염색된 세포의 비율이 다른 경우 대부분의 세포들이 중심부위와 비슷한 염색 정도를 보이고 종양의 경계에 가까운 부위에서만 다른 양상을 보였으므로, 종양의 전체적인 발현 정도의 판단은 중심부위를 기준으로 하였다.

통  계
   통계적 분석을 위해 SPSS version 12.0을 사용하여 chi-square test 선형 대 선형 결합(linear by linear association) 방법, Wilcoxon signed ranks test를 이용하였다. 통계학적 유의 수준은 p<.05으로 정하였다.

결     과

   정상 갑상선 여포세포에서는 S100A4가 발현되지 않거나 배경과 같은 정도로만 발현되었다(Fig. 1A). 각각의 조직학적 종류에 따른 S100A4의 발현은 Table 1에 정리된 바와 같다. 갑상샘종에서는 한 예에서만 (+)로 발현되었고 나머지 증례에서는 모두 S100A4가 발현되지 않았다. 여포암은 3예 모두에서 발현되지 않았고 유두암에서는 (-)에서 (+++)까지 다양한 정도로 발현되었다. 유두암 중 여포양 변종에서는 다양하게 발현되는 양상이었고 발현되지 않는 경우는 없었다. 역분화암 역시 다양한 양상으로 발현되었다(Fig. 1).
   유두암에서의 발현 양상과 종양의 여러 특징들을 Table 2에 정리하였다. 1 cm를 기준으로 종양을 두 그룹으로 나누어 S100A4의 발현과의 관련성을 보면, 미세암종과 비교했을 때 종양의 크기가 큰 경우 칼슘결합단백이 많이 발현되는 것을 알 수 있었다(p=.014). 그러나 수술로 절제된 갑상선 내부에 있는 종괴의 수와 S100A4의 발현 양상은 통계적으로 유의한 상관관계를 보이지 않았다(p=.941). 림프절 전이 여부 역시 S100A4 발현 양상과 통계적 유의성이 없었다(p=.220).
   하지만 갑상선 조직 외로의 침습을 보인 종양의 경우 S100A4의 발현이 통계적으로 의미 있게 높았다(p=.029). 또한 이러한 침습성과의 관련성은 종양의 주변부위와 중심부위에서의 S100A4의 발현 차이로도 확인되었다(p=.046, Fig. 2). 또한 원발 종양의 T병기가 높을수록 S100A4의 발현이 뚜렷하였다(p=.004). 재발한 8명의 환자의 경우, 초치료로 무병상태에 도달한 환자에 비해 S100A4 의 발현이 뚜렷하였다(p=.022). 하지만 재발군의 수가 너무 적어 각 군간의 관련성은 확인할 수 없었다.
   S100A2 역시 정상 여포세포와 3예의 여포암 모두에서 발현되지 않았다(Fig. 3). 갑상샘종 중에서는 S100A4에 양성으로 염색되었던 한 예에서만 (+)로 발현되었고 나머지 조직표본들은 모두 염색되지 않았다. 유두암에서는 S100A2발현을 보이지 않는 증례에서부터 (+++)까지 다양한 발현양상을 보였다. 여포양 변종 유두암과 역분화암에서 역시 다양하게 발현되는 양상이었고 발현되지 않는 경우는 없었다(Table 3).
   S100A2의 발현정도와 유두암의 여러 종양학적 특징들과의 관련성에 대해 통계적 분석을 시행하였다(Table 4). 종양의 크기가 큰 경우 미세암종에 비해 S100A2의 발현이 뚜렷하였다(p=.041). 하지만 종괴의 개수(p=.468)와 림프절 전이(p=.987)는 S100A2의 발현과 통계적인 상관관계를 찾을 수 없었다.
   원발 종양의 T 병기가 높을수록 S100A2가 과발현되는 경향을 확인할 수 있었고(p<.001), 침습성 유두암의 경우 S100A2의 발현이 의미 있게 높았다(p=.008). S100A2역시 종양의 중심부위와 주변부위에서의 S100A2의 발현 양상을 비교했을 때 주변부위에서의 S100단백의 발현이 두드러지는 것을 확인할 수 있었다(p=.001, Fig. 4). 또한 재발한 8명의 환자 중 5예에서 (+++), 3예에서 (++)로 재발이 없었던 환자에 비해 뚜렷하게 발현되었다(p=.004).

고     찰

   본 연구에서는 S100A4와 S100A2 모두 갑상선 유두암에서 종양의 크기, 종양의 갑상선 주위침습, T 병기, 술 후 재발여부와의 관련성을 확인할 수 있었다. 또한 유두암과는 달리 여포암과 갑상샘종에서는 발현이 되지 않았다. 이는 유두암의 여포양 변형과는 구별되는 양상이었다. 여포양 변형 유두암으로 진단되었던 병변의 세침흡인검사 결과의 50%가 여포암으로 보고되었던 Goodell의 연구에서 볼 수 있듯이 세침흡인검사 결과만으로는 여포양 변형 유두암의 진단에 어려움이 있다.¹⁴⁾ 이렇게 세침흡인검사로 여포암과 여포양 변형 유두암의 구분이 어려운 경우 S100A4와 S100A2를 이용한 면역조직화학염색은 진단적 단서를 제공할 수 있을 것으로 생각된다.
   S100A4와 종양의 공격적인 특징들과의 관련성은 전립선암, 방광암, 위암 등의 다양한 암종에서 여러 연구를 통해 보고된 바 있다.^6,7,8) 신세포암에서는 종양의 분화도 역시, 원격전이와 함께 S100A4의 발현지수와 비례하는 것으로 보고 되었다.¹⁵⁾ 대장암에서는 종양의 Duke 병기와 함께 림프절 전이와의 관련성도 확인되었다.¹⁶⁾ 또한 Grum-Schwensen 등은 S100A4 결핍 생쥐에서 발생한 유방암은 원격전이를 보이지 않는 것을 보고하였다.¹⁷⁾ 이번 연구 역시 이러한 연구들과 공통된 결과를 보였다. 본 연구에서 얻어진 결과 중 S100A4의 발현과 가장 뚜렷한 연관성을 보였던 갑상선 유두암의 특성은 갑상선 주위 조직 침습 여부였다. 또한 종양의 주변 부위에서 그 발현양상이 더욱 강하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이는 S100A4가 갑상선 유두암의 주변침습에 작용하리라는 것을 예측하게 해준다.
   그러나 본 연구에서는 림프절 전이 여부와 S100A4와의 관련성을 확인할 수는 없었다. 모든 전이된 림프절에서 칼슘결합단백의 염색양상을 관찰하지는 못했지만 일부 염색표본에는 림프절이 함께 포함되어 있었다. 부분적으로 확인된 전이 림프절의 염색양상은 침습성 암의 주변부위의 발현양상과 비슷한 염색 정도를 보였지만 전체적으로 림프절 전이 여부와 S100A4의 발현은 상관관계가 없었다. 이는 real-time reverse transcriptase-PCR과 Northern blot을 이용한 Zou 등의 연구에서 S100A4가 진행된 갑상선암의 림프절 전이와 함께 나쁜 예후와의 관련성이 있음을 보인 내용과는 상반되는 결과였다.¹⁸⁾ 또한 S100A4의 발현양상과 갑상선암의 관련성에 대해 보고한 Ito의 연구에서는 여러 다른 유두암의 임상적 특징들과 S100A4발현이 관련이 없는 것으로 보고하고 있다.¹⁹⁾
   S100A2는 S100A4와는 달리 암의 진행에 음성적인 작용을 하는 것으로 알려져 왔다. Lauriola 등은 후두암에서 S100A2 음성인 환자군에서 재발률이 높고 생존율이 낮음을 보고하였다.¹⁰⁾ 또한 전립선암에서는 종양 분화도가 좋을수록 발현율이 높아지는 양상을 보였다.⁶⁾ 이상의 결과들은 100A2가 암 억제 유전자라는 주장을 뒷받침한다.
   그러나 갑상선암에서의 연구 결과는 이들과 매우 대조되는 양상을 보인다. Ito의 연구에서는 대부분의 갑상선 유두암에서 발현되는 양상이었고, 역분화암에서 그 발현이 높게 나타났다.²⁰⁾ 일반적으로 양호한 예후를 보이는 갑상선 유두암이 역분화암으로 진행한 경우 매우 빠른 성장속도를 보이며 공격적인 진행 양상을 갖게 되는 것을 고려한다면, S100A2의 발현이 갑상선암의 경우에 종양의 나쁜 예후와 관련된다고 할 수 있을 것이다. 본 연구에서는 역분화암과의 관련성을 확인할 수는 없었지만, 향후 역분화암의 병리 표본수를 늘려서 추가적으로 그 관계를 확인해 볼 필요가 있으리라 생각된다.
   아직까지 S100A2 칼슘결합단백의 기능은 정확히 알려져 있지 않지만 갑상선암에서는 여러 다른 종양에서와 달리 암의 진행에 관여하는 것으로 생각된다. 많은 연구들에서 S100A2의 암 억제 유전자로서의 역할에 대해 보고하고 있지만, 근래에 갑상선암에서의 이번 연구 결과와 유사하게 암의 공격적인 진행 양상에 관여할 것으로 추측하게 하는 연구들이 보고되고 있다. 식도의 편평상피세포암에서 통계적으로 유의하지는 않았지만 림프절 전이나 원격전이와 S100A2의 과발현이 같은 경향을 보였다.¹¹⁾ 또한 나쁜 예후 인자의 하나인 고령과 연관성을 보인 것을 확인함으로써 식도의 편평상피세포암의 나쁜 예후와의 관련성을 제시하고 있다.¹¹⁾ 또한, Wang 등의 연구에서는 Kaplan-Meier분석을 통해 1기 비소세포성 폐암에서 S100A2 양성인 환자군에서 5년 생존율에서 나쁜 상관 관계를 보였고, 이는 다른 여러 임상 지표들과 비교했을 때 예후와 직접적인 관련성을 보였다.¹²⁾ 또한 마찬가지로 비소세포성 폐암에서 S100A2가 과발현된 경우 진행 경과 중에 원격 전이를 보이는 경향을 보고한 연구도 있었다.¹³⁾ 이 보고에서 연구자들은 S100A2가 종양세포의 혈관내피를 통한 이동에 중요한 역할을 할 것으로 추정하였으나 이는 좀더 근본적인 검증이 필요할 것으로 생각된다. 향후 이렇게 여러 종양에서 다른 임상 양상과 관련되는 S100A2에 대한 보다 구체적인 분자생물학적인 연구가 시행되어야 할 것이다. 또한 이번 연구에서 뚜렷하게 관찰되었던 두 칼슘결합단백의 다른 염색 양상은 이 두 단백질 모두 갑상선 유두암의 주변침습에 관여하지만 종양세포내에서 다른 세포전달 과정을 통해서 그 기능을 수행하리라는 가정을 가능하게 한다. 이에 대한 향후 연구 또한 필요할 것으로 생각된다.

결     론

   본 연구에서 S100A4와 S100A2의 발현은 갑상선 유두암의 크기나 병기와 비례함을 확인할 수 있었다. 특히 S100A4와 S100A2 두 칼슘결합단백은 갑상선 유두암의 주변 침습에 중요한 기능을 수행하리라 생각된다. 이는 향후 갑상선 유두암의 예후 예측에 S100A4와 S100A2 발현양상을 지표로 사용할 수 있는 근거가 될 수 있을 것이다.

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