교신저자：김민식, 137-710 서울 서초구 반포동 505  가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
교신저자：전화：(02) 590-2762 · 전송：(02) 595-1354 · E-mail：entkms@catholic.ac.kr

서     론

   두경부암은 세계적으로 다섯 번째로 많이 발생하는 암이며 해마다 거의 400,000명의 새로운 환자가 발생하는 악성종양으로 알려져 있다. 조기진단 기술의 발전과 새로운 치료 방법의 발전에도 불구하고 두경부암 환자의 생존율은 현저히 증가하지 않았으며 또한 아직까지 분자생물학적 발생 기전도 명확히 보고되고 있지 않다. 이러한 두경부암의 원인으로 종래에 알려진 환경적 영향과 함께 최근에는 후생학적 변화(epigenetic alteration)가 관련이 있다고 알려지고 있다.^1,2)
   DNA의 메틸화는 DNA 염기서열의 변화 없이 유전자 발현을 조절하는 후생학적변화로 인체에서 자연적인 DNA의 변형으로 구아노신(guanosine)이 있는 사이토신(cytosine) 염기에 영향을 주는 현상이다.³⁾ 이러한 DNA 메틸화가 암의 발생에 기여한다는 사실이 밝혀지고⁴⁾ 암의 발생 시 발암 유전자(oncogene)⁵⁾ 및 그 외의 유전자의 특정 부위에서의 메틸화가 주로 촉진제(promoter)부위의 CpG island 부위에서 발생하는 DNA 메틸화의 특성이 알려져 있다.^6,7)
   CpG island는 짧은 CpG 풍부한 지역(rich-region)으로 유전자의 촉진제부위와 관련있고 약 27,800개 정도가 사람에게 존재하며 60%의 CpG island는 유전자의 5' 말단전이지역에서 발견된다. 대부분의 CpG island는 대부분 비메틸화 되어있어 유전자가 발현될 때 여러 가지 다양성을 부여하는데 조직의 종류에 따라 그 정도가 달라 발현의 차이를 보이며 암 세포 내에서는 광범위 저메틸화(hypomethylation)로 인해 돌연변이 발생률, 염색체 불안정(chromosomal instability)을 증가시키며 유전자 특이 촉진제(gene-specific promoter)의 과메틸화(hypermethylation)는 주로 유전자의 비발현에 관련이 있다.^8,9)
   암세포 내에서의 CG가 적은 이질염색질(heterochromatin)지역 내의 비전사유전자(non-coding gene)에는 메틸화변화가 아주 작은 영향을 미치나 CG 풍부역의 전사 유전자(coding gene)에 근처에 위치하는 CpG island와 non-island CpG 지역은 주로 저메틸화된 CpG island에서 과메틸화를 나타내며 과메틸화된 non-island CpG에서 저메틸화를 나타내어 메틸화 변화의 다양성을 나타낸다. 이러한 암세포의 메틸화 변화는 암세포의 다양한 진행과정에서 특징을 나타낼 것이다.¹⁰⁾
   아직까지 두경부암 진행과 메틸화와의 관계는 많이 알려지지 않아 이러한 암발생의 진행과 발전에 어떠한 역할을 하는지 알아내는 것이 메틸화 연구의 중요한 포인트이다. 이러한 변화를 살펴보기 위해 유전자지역을 non-island CpG 와 CpG island 지역으로 나누어 경향을 살펴보았다.
   한편 암의 발생과 관련된 이형 접합성 소실(loss of heterozygosity)은 거의 모든 고형암에서 가장 흔하게 나타나는 유전자 변형이다. 염색체 소실 범위는 암세포의 침습과 전이 정도 및 예후와 밀접한 관련성이 있으며 고위험(high- risk) 혹은 저위험(Low-risk) 유전자형으로 유전자 병기 기준을 제시하기도 한다. 이러한 변화는 두경부암에서 가장 흔하게 발견되는 유전적 변이로 타장기에서도 암 억제 유전자(tumor suppressor gene)들이 위치하는 것으로 알려진 부위의 염색체 소실은 높은 빈도로 발견되었다. 염색체 소실의 경우 염색체 소실 개수는 같거나 유사하여 특정 유전자의 개별적인 소실보다는 전체 염색체의 소실 범위가 예후와 관련이 있으며 다양한 암 진행에 있어서 중심적 역할을 한다고 알려지고 있다. 특히 특정 유전자의 개별적인 소실보다는 전체 염색체의 소실 범위가 더욱 의미가 있음을 여러 연구들에서 보고하고 있다.^15,16)
   본 연구에서는 다른 여러 암에서 여러 변이가 밝혀진 유전자 지역 중 non-island CpG 유전자 지역 p16 down 0.7 kb, p16 upstream 1.0 kb, MYBPC2 upstream 1.2 kb, BGLAP upstream 4.5 kb, MSLN upstream 0.8 kb, TFF2 upstream 0.2 kb, hMLH1 upstream 1.0 kb 7개의 유전자 지역과 CpG island가 있는 유전자 지역 ST14 upstream 0.3 kb, Runx3 upstream 0.5 kb, Runx3 upstream 1.7 kb, KIAA downstream 0.4 kb, hMLH1 upstream 0.7 kb, GHGB upstream 0.3 kb, Rb1 upstream 0.4 kb, Runx2 upstream 0.7 kb 8개 지역 총 15개 지역을 이용하여 메틸화 양상을 조사하였으며 빈번하게 염색체 소실을 보이거나 암억제 유전인자가 위치한다고 알려진 염색체 3p, 4p, 5q, 8p, 9p, 13q, 17p, 및 18q에서 염색체 소실의 빈도를 알아 보았다.

대상 및 방법

대상 환자 및 종양 조직
   2004년 9월부터 2005년 8월까지 두경부암으로 절제술을 시행 받은 환자들 중 29예를 대상으로 하였다. 가톨릭 대학교 생물 윤리 심의 위원회의 허가와 공여자의 서면 동의를 받고 수술중 공여자의 종양 조직 및 정상 점막 조직을 사용하였다.
   29예 중 5예를 제외하고 모두 남자였으며 평균 연령은 57.45±10.7세(25~74세)였다.
   29예 중 1예를 제외하고 모두 편평 세포암종으로 일차 종양의 위치는 편도 7예, 후두 9예, 혀 8예, 기타 4예였다. 술후 조직학적 국소병기는 American Joint Committee on Cancer 분류(2002)에 따라 T1 4예를 제외하고 모두 T2 이상이었으며 경부 림프절 병기는 N1, N2_a, N2_b예를 제외하고 모두 N0이었다(Table 1).
   이형 접합성 소실분석을 위하여 29예 모두에서 종양 조직과 정상 점막조직을 각 한 부분씩 얻어 총 58병소의 조직을 얻었다. 메틸화 분석은 17예에서 종양조직과 정상 점막 조직을 각 한 부분씩 얻어 총 34병소를 모아 시행하였다.

DNA 추출
   포르말린 고정, 파라핀 포매조직을 7 μm두께로 절단하여 슬라이드에 고정한 후 정상세포와 종양세포의 구분을 위해 hematoxylin-eosin 염색을 하여 40배율의 입체 현미경 아래에서 정상 조직 슬라이드에서 정상 점막 조직 한부위와 종양 조직 슬라이드에서 종양 조직 한부위를 미세절제(microdissection)하였다. 미세 절제한 단일 표본 조각은 1 μl Tween 20-Proteinase K 조직용해액에 용해하였다. 조직용해액에 용해된조직은 37℃에서 3시간 50℃에서 9시간 방치하였고 사용직전까지 4℃에 보관하였다.
   메틸화 분석을 위한 DNA의 bisulfite 변형에 사용하기 전 보관된 DNA 1 μl 이용하여 microsatellite primer set인 D19S226(forward, 5'-CCA GCA GAT TTT GGT GTT GTC TA-3'；reverse, 5'-ACA GAG CCA GAG CCA GTA GGA GT-3'；amplicon size, 164 bp)으로 증폭시켜 DNA의 질을 확인하였다.

이형 접합성 소실 분석
   PCR을 통한 주형 DNA의 증폭은 이전에 기술된 조작법으로 방사성 동위원소(alpha-32P dCTP, PerkinElmer, Boston, MA, U.S.A.)를 이용한 "다중, 고온시작법"(multiplex hot-start method)을 적용하였다. 각 PCR 과정은 두 쌍의 primer를 사용하여 주형-시발체 혼합액을 가역한 후 dNTP와 Taq DNA 중합효소(Takara Taq, Takara, Shiga, Japan)를 첨가하였다. Thermocycler(iCycler, Bio- Rad, Hercules, CA, U.S.A.)에서 주형 DNA 1 μl를 다음과 같은 방법으로 32회 시행하여 증폭하였다. 10 μl의 반응 혼합물을 94℃에서 1분간 denaturation, 58~64℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 1분간 elongation을 진행한 후 증폭된 PCR 산물중 5 μl를 이용하여 7M Urea가 포함된 polyacrylamide gel에서 1,500 volt로 3시간 전기영동한 후 radioluminograph scanner(BAS 2500, Fuji Photo Film Co. Ltd. Kanakawa, Japan)를 이용하여 확인하였다. 전기영동상의 대립유전자 배열 신호의 선택 강도를 측정하기 위해 TINA image software(Raytest Isotopenmegerate GmbH Straubenhardt, Germany)의 신호 강도 측정 기능을 이용하였다.
   이형 접합성 소실은 8개의 염색체 완(3p, 4p, 5q, 8p, 9p, 13q, 17p, 및 18q)에서 염색체 소실을 확인하였다. 이형 접합성 소실 분석은 유전자불안정(microsatellite instability)이 없는 경우 정상 DNA의 이형 대립유전자 신호의 상호 비율에 대한 종양 DNA의 대립유전자 신호의 상대적 비율을 계산하여 단측성 염색체소실을 판정하였다. 염색체 결손을 의미하는 신호 강도의 감소는 정상 대립유전자 신호 강도와 비교할 때 상대비 환산값 0.65에서 가장 구분이 잘 되었다. 이환산값은 이형 접합성 소실을 결정하는 최저 경계선으로 적용되었으며, 완전한 소실을 보인 대립유전자 신호는 육안으로 식별이 가능하였다(Table 4B).

메틸화 분석

Sodium bisulfite를 이용한 DNA 변형
   용해된 조직액 90 μl에 3 M NaOH 10 μl를 넣어 91℃에서 15시간 denaturation시킨 후 2.3M sodium bisulfite 1,040 μl와 10 mM hydroquinone을 넣은 후 50℃에서 12시간 방치한다. Wizard DNA purification resin(Promega Corp., Madison, WI)을 이용하여 제조자의 설명에 따라 정제하였다. 변형된 DNA에 100% 에탄올 2.5와 1 μl의 연어 정소 DNA를 첨가하여 침전시키고 침전물은 70% 에탄올로 세척한 후 말려서 5 mM Tris buffer(pH 8.0) 35 μl에 녹였다.

DNA 증폭 및 메틸화-비메틸화 비율 분석
   DNA증폭은 단측성 염색체 소실 분석 때와 동일한 PCR 반응물 및 기기, 조건에서 시행하였다. Bisulfite로 처리하여 변형된 DNA 1 μl를 방사성동위원소(alpha-32P dCTP, PerkinElmer)로 표지하고 "다중, 고온시작법"으로 32회 증폭하였다. PCR 산물 중 6.5 μl를 7.5% polyacrylamide gel에 가한 후 EtBr 염색을 하여 확인하였다.
   메틸화와 비메틸화 각각 두 개의 대조 DNA를 다양한 농도로 혼합(총량의 PCR농도는 20 ng/μl로 유지)한 후 증폭시켜 얻은 메틸화 및 비메틸화 띠의 상대적 강도에 따라 표준 곡선을 구하였다. 주형-시발체 혼합액에 메틸화 및 비메틸화 대조 DBA의 구성 비율은 일정한 직선상(linearity)을 보여주었으며 대조 MSP 띠의 표준 곡선을 근거로 메틸화 및 비메틸화 띠의 상대적인 비율을 완전 비메틸화(U, 0~20%가 메틸화로 구성), 불완전 비메틸화(Um, 21~40%가 메틸화로 구성), 균형적 메틸화(UM, 41~60%가 메틸화로 구성), 불완전 메틸화(uM, 61~80%가 메틸화로 구성), 완전 메틸화(M, 81~100%가 메틸화로 구성)의 5단계(grade)로 구분하였다(Fig. 1).

비메틸화 및 메틸화 특이 PCR 시발체
   포르말린 고정 조직에서 DNA는 500 bp 이하의 작은 조작으로 되어있으며 이를 안정적으로 증폭하기 위하여 150 bp 이하의 작은 조각까지도 용이하게 확인할 수 있는 MSP 시발체를 ST14, p16, MYBPC2, MSLN, TFF2, MAGE, KIAA, Runx3, BGLAP를 도안하였다(Table 2A). 시발체 염기서열은 MethPrimer software(http://www.urogene. org/methprimer/)(Li and Dahiya, 2002)를 이용하였다(Table 2).

결과 분석 및 통계 분석
   정상 점막과 종양 조직의 메틸화-비메틸화 구성비율의 변화 양상 및 정도를 알아보기 위하여 메틸화-비메틸화 구성 비율의 변화를 저메틸화 변화는 U1(한 단계 변화, 예를 들면 UM → Um 또는 Um → U)에서 U4(네 단계 변화, M → U)까지, 과메틸화 변화의 경우 M1(예를 들면 UM → uM 또는 uM → M)에서 M4(U → M)까지, 각각 4단계로 분류하였으며 정상 점막에 대한 종양 조직의 메틸화 비메틸화 구성 비율의 변화와 임상 병리적 인자와의 상관관계 및 이형 접합성 소실과의 상관관례는 Window용 SPSS version 12.0을 이용하여 분석하였다.

결     과

메틸화 분석
   전체 29예 중 17예로 부터 17개의 종양 조직 및 17개의 정상 점막조직을 얻어 메틸화 특이 PCR을 시행하였다. 15개의 유전자를 이용하여 non-CpG island(7곳)와 CpG island(8곳)를 구분하여 메틸화 양상을 조사하였다.
   17개의 종양 조직 각각의 유전자 15곳에서 상응하는 정상 점막에 대한 종양 조직의 메틸화 변화를 살펴본 결과 전체 206곳 중 저메틸화 변화(U1-U4에 해당)는 42곳(20.38%), 과메틸화 변화(M1-M4에 해당)는 43곳(20. 87%), 메틸화 변화가 없는 경우는 121곳(58.73%)에서 발견되었다. 메틸화 변화를 보인 85곳 중 52곳(61.9%)을 U1 또는 M1에 속하는 약한 변화를 보였으며 메틸화-비메틸화 구성 비율이 완전 비메틸화에서 완전 메틸화(M4)로 또는 완전 메틸화에서 완전 비메틸화(U4)로 변화하는 심한 변화는 보이지 않았다.
   CpG island가 있는 지역과 non-island CpG 지역으로 나누어 살펴본 결과 non-island CpG 지역의 경우 저메틸화 변화가 34곳으로 37.3%를 나타냈으며 과메틸화의 변화는 26곳(28.5%)을, 메틸화 변화가 없는 것으로는 31곳(34%)을 보였다. CpG island 지역의 경우 저메틸화 변화가 8곳(6.9%)을 나타냈으며 과메틸화의 변화는 17곳(14. 7%)을, 메틸화 변화가 없는 곳은 90곳(78.2%)을 나타냈다. Non-island CpG 지역의 경우 저메틸화가 우세한 경향을 나타냈으며 CpG island 지역의 경우는 과메틸화가 우세한 경향을 나타냈다(Table 3, Fig. 2).
   메틸화 변화를 병기와 관련하여 살펴본 결과 병기가 진행될수록 non-island CpG 지역의 p16 두지역, TFF2, hMLH1upstream 1.7 kb에서는 저메틸화 경향이 관찰되었다. 이중 p16 유전자와 hMLH1upstream 1.0 kb 유전자는 림프절 전이 시에도 저메틸화 경향을 보였다. 다른 non-island CpG의 경우 별다른 변화를 관찰할 수 없었다. CpG island Runx3 upstream 1.7 kbp에서는 병기가 진행될수록 과메틸화가 발견되었으며 림프절 전이 시에도 과메틸화 현상을 나타내었다. BGLA, MSLN, TFF2, ST14 유전자의 경우 변화는 관찰되었으나 병기와 림프절과의 별다른 관계는 관찰되지 않았다(Table 5, Fig. 3).

이형 접합성 소실의 분석
   29예의 병소에서 얻은 정상점막, 종양 조직 각각 29개를 비교한 결과 유전자불안정성(microsatellite instability)은 발견되지 않았다. 29예의 병소에서 3예를 제외한 나머지 26병소에서 1개 이상의 염색체 소실이 있었으며 8개 염색체 모두에서 염색체 소실이 보이는 병소는 3예 였으며 염색체 평균 소실 개수는 4.79±2.2개 이었다. 총 232 개의 139개의 염색체에서 대립유전자 소실이 관찰되었으며 개별 염색체의 소실빈도를 분석해보면 3p(19/29), 4p(14/15), 5q(16/13), 8p(19/10), 9p(19/10), 13q(20/9), 17p(17/12), 18q(15/14)로 분석되어 3p, 8p, 9p, 13q 염색체에서 가장 소실이 빈번하게 관찰되어 지금까지의 보고와는 달리 8p 염색체완의 소실도 많이 나타났으며 4p, 5q, 18p 염색체에서 소실이 가장 드물게 발견되었다(Table 4).
   병기별로 염색체 소실 변화를 알아본 결과 stage I의 경우 평균 6±2.16개의 소실을 보인반면에 stage II는 평균 4.86±2.478개 stage III는 평균 6±1.633개 마지막으로 stage IV의 경우 4.07±2.235개의 소실을 보였다(Fig. 4A).
   염색체소실을 림프절 전이의 유무에 따라 나누어 확인해 보았다. 림프절 전이가 없는 경우에는 5.53±2.1개의 소실을 보였으며 림프절 전이가 있는 경우 4.0±2.49의 소실을 보였다(Fig. 4B).

고     찰

   다양한 생물학적 고유 기능을 갖는 정상 세포들이 암세포로 전환되어 임상적으로 발견될 수 있는 악성 종양으로 발전되기 위해서는 복잡하고 다양한 과정을 거치게 되는데, 이러한 악성화 과정에는 단일 염색체 변이가 아닌 순차적이고 많은 유전자들의 변이에 의한다. 여기에 관여하는 유전자 변이는 암유전자의 증폭에 의한 활성화와 암 억제 유전자의 변이에 의한 암억제 기능 소실에 의한 것으로 여러 연구에 의해 밝혀졌다.¹¹⁾
   모든 포유류의 DNA에서의 3~4%의 사이토신(cytosine)은 모두 메틸화되어 있는 상태이다. 이러한 사이토신의 대부분은 CpG라고 하는 부분에서 5-메틸사이토신의 형태로 발견된다. 국소적인 CpG 지역의 DNA 메틸화의 증가와 감소의 범위는 종양 세포에서 발견이 되며 이것은 종양 발전과 관련이 있다. 이러한 메틸화의 변화는 종양발전에서 후생학적 변화와 관련이 있는 것으로 밝혀졌다.³⁾ 특히 CpG island라고 하는 지역은 작은 CpG들이 풍부한 지역으로 약 0.5~2 kb 정도의 크기로 유전자의 촉진제 근처에서 발견된다. 이 CpG island는 유전자의 발현과는 상관이 없다고 알려졌으나 최근 몇몇 촉진제와 관련된 CpG island의 저메틸화와 과메틸화가 여러 종양에서 유전자와 관련이 있는 것으로 밝혀졌다.¹²⁾
   메틸화의 변화는 메틸화 특이 PCR(MSP；Methylation specific PCR)기술의 발전으로 종양 내에서의 촉진제 지역의 메틸화와 관련된 유전자의 발현과 관련된 연구가 활발히 이루어지고 있다. 메틸화 특이 PCR은 짧은 시간 안에 끝나 간단하며 각 유전자마다의 특이성을 나타낼 수 있으며 1,000개의 비메틸화된 전사(copy)안에서 1개의 메틸화된 전사(copy)를 찾아낼 만큼 매우 민감하여 메틸화 연구에 핵심적인 역할을 하고 있다.¹³⁾
   일반적으로 고형암은 전사 유전자(cording gene) 근처의 GC-풍부역에서 저메틸화된 CpG island의 과메틸화 변화와 과메틸화된 non-CpG island의 저메틸화 변화를 흔히 보인다.¹⁴⁾ 본 연구에의 경우에도 이러한 암에서의 메틸화 변화가 과메틸화 변화, 저메틸화 변화, 변화가 없는 경우 등 다양한 변화로 나타났다. 전체적인 과메틸화와 저메틸화 변화는 크게 차이가 나지 않았으나 non-island CpG의 경우 저메틸화의 경향을 나타냈으며 CpG island의 경우 과메틸화의 경향을 나타내어 일반적인 고형암의 경향을 나타내었다. 그 정도에 있어서는 완전 비메틸화된 CpG island가 완전 메틸화의 변화를 보이거나 또는 완전 메틸화된 non-island CpG가 완전 비메틸화 변화를 보이는 심한 변화는 관찰되지 않았으며 주로 1단계와 2단계 정도의 변화만을 보이는 약한 변화가 주를 이루었다(Fig. 2).
   CpG의 메틸화가 염색질을 농축시켜 결과적으로 전사인자의 접근을 막아 발현을 억제하는 반면 광범위한 저메틸화 변화는 세포 증식 및 이동과 관련하여 전사능(transcriptional activity)의 비정상적인 상승을 초래하여 암종의 진행에 관여하기 때문에 병기와 관련하여 암전구 단계 및 초기암에는 과메틸화가 저메틸화가 진행암과 관련이 있다고 보고되고 있다.¹⁵⁾
   Hong 등은 위장관암에서 메틸화의 변화와 이형접합성 소실과의 관계에 관한 실험을 시행하여 non-island CpG에서 이형접합성 소실이 많은 군에서의 p16, hMLH1 유전자의 경우 메틸화가 감소하여 저메틸화 경향을 타나냈으며 염색체 소실이 적거나 없는 경우 그리고 8개 염색체 모두 소실이 된 군은 염색체 소실이 많은 군과는 달리 메틸화가 증가한다고 하였다.¹⁰⁾
   본 연구에서 메틸화경향을 살펴보면 non-island CpG 지역의 p16 두 지역을 분석한 결과 저메틸화 경향이 모두 나타났으나 p16 down stream 0.7 kb의 경우 염색체 소실과 관련 없이 모두에서 저메틸화가 관찰되었으나 p16 upstream 1.0 kb의 경우 염색체 소실이 평균 이상인 경우에서 더 많은 저메틸화 현상이 관찰되었다. 이들은 림프절 전이와의 관계에서도 림프절 전이가 있는 경우 저메틸화 경향이 림프절 전이가 없는 경우보다 많이 나타났다. hMLH1 유전자의 경우 CpG island 지역 upstream 0.7 kbp 지역은 변화를 관찰할 수 없었으나 non-island CpG 지역의 upstream 1.0 kbp 지역의 경우 염색체 소실이 평균 이하였던 예들은 변화가 없었으나 평균 이상이었던 예에서는 저메틸화 경향을 나타내었다. 이는 CpG island의 유무에 따라서도 같은 유전자의 메틸화 변화 현상이 다르다는 것을 보여주는 현상으로 사료된다. 림프절 전이 시 저메틸화 경향을 hMLH1 upstream 1.0 kbp에서 나타났다. 이 두 유전자의 저메틸화 현상은 두경부 암에서도 저메틸화가 염색체 불안정성을 증가시키며 병기의 진행과 림프절 전이와도 관련이 있는 것으로 사료된다. 그러나 non-island CpG의 MSLN 유전자는 전체적으로 과메틸화의 경향을 나타내며 병기나 림프절 전이와는 관련이 없었다. 이러한 현상으로 보아 단순한 non-island CpG 내에서의 광범위한 저메틸화 변화 양상은 가지지만 유전자의 변화는 저메틸화 과메틸화로 다양하게 변화되는 것으로 생각된다. CpG island의 Runx3 upstream 1.7 kb는 과메틸화 경향을 나타내어 CpG island 내에서 일어나는 저메틸화된 유전자가 과메틸화되는 현상으로 사료되며 Runx3 upstream 0.5 kb 지역은 변화가 없었으므로 같은 유전자이지만 그 유전자의 촉진제 위치에 따라 차이를 보였다. 이는 유전자 내에서 메틸화의 부위도 유전자 위치에 따라 많은 변화가 있는 것으로 사료된다(Table 5, Fig. 3).
   메틸화는 사람 안에서의 중요한 epigenetic한 변형으로 메틸화 안에서의 패턴변화는 암의 진행과정에서 아주 중요한 역할을 한다.³⁾ 상유전자 변화(epignetic modification：hypermethylation or hypomethylation)에 의한 유전자의 발현 조절은 정상 조직에서도 일어나며 특징적으로 조직의 종류에 따라 다른 양상(cell-type-specific manner)을 보여 준다. CpG island의 정상적인 메틸화는 정확하게 몇 가지의 역할이 확인되었다. 대표적인 것은 여성에서의 성염색체 X염색체의 비 발현으로 여성이 갖고 있는 한 쌍의 X염색체 중 한쪽의 X염색체에 존재하는 모든 CpG island는 메틸화되어 한쪽 염색체로부터의 유전자들의 발현이 억제됨으로써 X를 하나 갖고 있는 남성과 균형을 맞추게 된다. 또 생식 세포 특이 유전자(germline-specific gene)의 경우 예를 들면 MAGE과 LAGE 등 유전자들은 남성과 여성의 생식세포 발생과정에서만 제한적으로 발현되다가 분화한 성체 조직에서는 CpG island가 메틸화되어 발현되지 않으며 조직 특이 유전자(tissue-specific gene)와 같은 과정에서의 CpG island의 메틸화는 인체 조직에 따라 특이적으로 CpG island의 메틸화가 발생해 발현이 조절되는 것으로 밝혀지고 있다. 이러한 일련의 과정은 CpG island의 비 발현 또는 과 발현으로 특이성을 부여 받게 되는 것이다. 결국 CpG island의 메틸화 현상은 특수한 목적으로 유전자 발현을 조절하는 특수한 분자적 네트워크로 발달된 메커니즘이다. 이러한 DNA의 메틸화 작용이 발암 과정에서에서 아직 정확히 발견되지는 않았으나 그중 광범위한 genomic 저메틸화는 발암 과정 중 다음과 관련이 있을 것이라고 생각된다. 첫째 염색체의 불안정을 유발하여 발암 과정에 영향을 주며¹⁶⁾ 둘째 각인 유전자의 소실을 일으키게 되는데 각인 현상이 일어나는 이유는 생식세포 발생단계 초기에 해당 유전자의 CpG island가 선택적으로 메틸화되어 발현을 막는 것으로 결과적으로는 메틸화되지 않은 대립유전자만 발현됨으로써 유전자용량(gene dosage)을 조절하게 된다.¹⁷⁾
   한편 이형 접합성 소실은 종양의 원인이 되는 결함이 있는 유전자의 나머지 대립유전자에 변이가 일어나서 주변의 유전 표지자가 소실되어 나타나는 것으로 이 부위에 암억제 유전인자가 존재함을 의미한다.¹⁸⁾ 이형 접합성 소실은 여러 예후 인자들과의 연관성을 조사함으로써 암의 발생 및 진행과의 관련성을 알아 볼 수도 있다.¹⁹⁾
   두경부암에서의 이형 접합성 소실은 3p, 8p, 9p, 10q, 11p, 13q, 17p, 18p에서 보고되었으며 가장 빈번한 소실은 3p, 9p21, 17p13이다.²⁰⁾ 본 연구에서 이용된 염색체는 지금까지 연구되어 보고된 암억제 유전인자가 위치하는 염색체들로 각각의 염색체에서 5개(8q, 17p에서는 6개)의 극소위성 표지자를 실험하였고 2개 이상의 소실을 보인경우를 본질적인 소실로 의미 있는 유전자 변이로 고려하였다.
   본 실험에서는 지금까지의 두경부 암에서의 연구 보고와 비슷하게 3p, 9p, 13q 염색체 완에서의 소실이 가장 빈번하였으며 괄목할만한 점은 8p 염색체 완의 소실도의 이들과 같이 많이 나타났다. Cho 등의 두경부암을 이용한 염색체 소실 분석의 결과에서도 8p 염색체 완의 소실이 가장 많은 것으로 나타났다.¹⁵⁾ 그러므로 8p 염색체 완도 두경부암에서 중요한 역할을 한다고 보여 지며 이에 대한 연구도 이루어져야 한다고 사료된다(Table 4A).
   Kwon 등은 염색체 소실을 이용한 이면성 조직형을 보이는 식도암에 대한 연구에서 평균 7개의 염색체 소실이 관찰되었으며 특이한 점은 침윤암에서 보다 오히려 초기암인 상피내암에서 이형 접합성 소실의 빈도가 더 높은 결과를 보여 암의 진행을 위해서는 적정 범위의 유전적 변이가 필요하며 그 이상의 변이가 일어난 경우는 오히려 더 이상 암의 진행이 이루어지지 않고 상피내암으로 머무르는 것으로 추측하였다.
   전체적인 염색체 소실은 초기 병기 상에서는 평균 5.7개의 소실을 보였으나 후기 병기 상에서는 평균 4.4개의 소실을 보여 병기에 따른 염색체 소실범위가 Kwon 등의 식도암에서과 비슷한 결과를 나타내었다. 또한 전체 29개의 예 중 14개의 예가 림프절 전이가 있는 것이었으며 평균소실이 3.8개 이었다. 그러나 림프절 전이가 없는 경우로 5.8개로 림프절 전이가 있는 경우보다 높은 소실 개수를 나타내었다(Fig. 4).
   이는 두경부 암에서도 암의 진행에 있어서도 적정 범위의 유전적 변이가 필요하며 그 이상의 변이는 암의 진행이 이루어지지 않는 것으로 추측되며 염색체 두경부암의 많은 부분의 원인으로 작용하는 환경적 요인이 함께 작용하는 것으로 사료된다.

결     론

   본 연구에서는 p16, hMLH1, Runx3 유전자에서 변화를 관찰하여 두경부암과의 연관성을 관찰할 수 있었으며 이형 접합성 소실에서 8q염색체에서 소실이 두경부암에서도 빈번하다는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 암의 조기진단을 위한 분자 생물학적 지표를 찾아 치료에 이용한다면 암환자의 생존율을 높이는데 크게 기여할 수 있을 것 이며 메틸화의 변화 분석과 이형접합성 소실 또한 하나의 중요한 종양의 발생 및 진행과 관련하여 중요한 지표가 될 수 있을 것이다.

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