교신저자：이건희, 130-702 서울 동대문구 회기동 1  경희대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   비용종은 염증성 점막이 부종성 종물을 형성하여 비폐색, 점액분비, 두통 등을 유발하는 비점막과 부비동의 만성 염증성 질환으로 비강에서 발견되는 종물 중 가장 흔하다. 빈도는 대개 약 1~4% 정도로 알려져 있고 천식, 낭성 섬유화, 아스피린 과민증과 동반되어 흔히 나타나나 원인은 명확히 알려지지 않고 있는 다인자 질환이다.¹⁾
   조직학적으로 상피세포의 분화이상을 동반하고 기저층이 비대되어 있으며, 섬유화된 세포들과 더불어 부종이 발견되는 것이 특징적이며 배세포가 감소하고 호산구, 비만세포, 림프구, 중성구 등의 유입이 발견된다. 이 중 상피세포, 섬유아세포, 림프구, 비만세포 등이 여러 염증반응을 조율하는 시토카인과 chemokine의 생산에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.¹⁾
   그동안 상피세포와 섬유아세포는 구조세포로서 주변의 환경을 형성하는 것으로 알려져 왔으나, 최근 여러 연구에서 그 기능이 알려지고 있다. 각각의 세포의 기능에 대한 실험들은 비교적 많이 이루어졌으나 세포 간의 상호작용에 대한 연구는 거의 없는 실정이다.
   이에 저자들은 본 실험에서 상피세포와 섬유아세포의 동시배양 모델을 개발하고 세포 간의 상호작용에 의한 시토카인 발현의 차이를 간략히 비교해 보고자 하였다.

대상 및 방법

검체 수집
   환자의 동의하에 내시경 부비동 수술 중 얻은 비용을 생리식염수와 항생제(gentamicin)를 혼합한 용액에 깨끗하게 씻은 후 실험실로 이송하였다. 실험실에서 같은 환자의 비용을 절반으로 나눈 후 한쪽은 상피세포의 배양을, 다른 쪽은 섬유아세포의 배양을 위해 사용하였다.
   실험은 모두 3명의 환자의 검체에 의해 이루어졌고 알레르기가 있거나 후비공비용의 경우는 제외하였다.

섬유아세포의 배양
   채취된 비용을 1 mm³ 크기로 절단하여 배양용 접시에 1 cm 간격으로 놓고 5분간 실온에서 유착시킨 후 Dulbecco’s Modified Eagle's medium(DMEM, Gibco, Grand Island, NY, USA)과 10% fetal bovine serum(FBS)을 첨가하여 배양하였다. 단층을 형성하면 배양액을 제거한 후 phosphate buffered saline(PBS)로 세척하고 0.05% trypsin-0.02% ethylene diamine tetraacetic acid(EDTA)로 37℃에서 5분간 처리하여 세포들을 분해하였다. 그 후 분해된 세포를 얻어 다시 2% FBS와 DMEM액을 넣은 상태에서 배양하였다.²⁾

상피세포의 배양
   채취된 비용을 F12 용액과 penicillin(Pc) 100 IU/ml, streptomycin(SM) 100 μg/ml, amphotericin-B(Ampho- B) 2 μg/ml의 혼합액에 넣어 소독한 후 1% dispase에 넣고 실온에서 하룻밤 방치한 후 0.125% trypsin/EDTA in F12로 37℃에서 10분간 처리한 다음 10%(Vol/Vol) FBS로 처리하여 중화시킨다. PBS로 세척한 후 상청액을 모아 1,500 rpm, 5분, 실온에서 원심분리한 후 10 cm Petri dish에 실온에서 1시간 동안 방치한 다음 상층액을 모아 원심분리하였다. 얻어진 세포들을 bronchial epithelial growth medium(BEGM, Clonetics, Walkersvill, MD, USA)에 hydrocortisone 21-hemisuccinate(0.5 μg/ml), insulin(5 μg/ml), transferrin(10 mg/ml), epinephrine hydrochloride(0.5 μg/ml), 3,3',5-triido-L-thyronine (6.5 ng/ml), gentamicin sulfate(50 μg/ml), amphotericin B(50 ng/ml), EGF(25 ng/ml), All-trans RA(10^-7 M), Bovine serum albumin(1.5 μg/ml), Bovine pituitary extract(1% vol/vol)(Clonetics, Walkersvill, MD, USA)에 suspension한 후 200 μM mesh에 여과시킨 다음 10⁶ cells/ml의 농도로 Petri dish에 분주하였다.³⁾ 이후 이틀에 한 번씩 배양액을 교체해 주며 단층을 형성할 때까지 배양하였다. 단층이 형성되면 세포를 transwell insert(Costar Corp., Cambridge, MA, USA)에 5×10⁴개씩 분주하여 다시 배양을 하였다.

상피세포와 섬유아세포의 동시배양
   상피세포가 transwell insert에서 융합을 이루고 섬유아세포가 plate의 바닥에서 융합을 이루었을 때 plate 위에 transwell insert를 얹어 동시배양을 시행하였다(Fig. 1). 이 때 배지는 두 세포가 모두 생존할 수 있는 Pc 100 IU/ml, SM 100 μg/ml, Ampho-B 2 μg/ml, glutamine 150 μg/ml, transferrin 5 μg/ml, insulin 5 UI/ml, epidermal growth factor(EGF) 25 ng/ml, endothelial growth supplement 15 μg/ml, triiodothyronine 200 pM, hydrocortisone 100 nm(Clonetics, Walkersvill, MD, USA), 15% FBS를 함유한 Ham's F-12(Gibco, Grand Island, NY, USA)를 사용하였고 단일세포배양의 검체를 위해서도 각 각 같은 배지를 사용하였다.

반정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(Semiquantitative RT-PCR)
   동시배양세포와 개별배양세포 간의 차이를 알아보기 위해 반정량적 연쇄중합반응을 이용하였다. 상피세포를 transwell에서 배양한 것과 섬유아세포를 plate에서 배양한 것 그리고 두 세포를 각각 배양한 후 동시배양하여 48시간이 지난 후 각각의 세포에서 RNA를 추출하였다. TRIzol(Life Technologies, Gaithersburg, MD) 시약을 이용하여 각각의 조건에서 전체 세포의 RNA를 추출하여 SUPERSCRIPT^TM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis(Life Technologies)를 사용하여 역전사는 50분 동안 42℃에서 oligodT 선택으로 각 조건에서 RNA 5 μg을 사용한 후 15분 동안 70℃에서 효소로 비활성화시켰다. cDNA의 농도를 비교하기 위해 β-actin에 대한 희석 중합효소 연쇄반응(dilutional PCR)에 각 조건에서 cDNA를 6번 연속적으로 희석시켜 사용하였다. PCR 조건은 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분이었다. 점적 농도계(spot densitometer) 분석으로 각 표본들의 희석률을 결정하였고 pIgR과 β-actin mRNA 발현의 비교를 위해 20, 25, 30, 35, 40 cycle까지 동량의 cDNA를 사용해서 반정량적 중합효소 연쇄반응을 시행하였다. 증가된 물질은 2% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다. 보정된 cDNA양에 의해 중합효소 연쇄반응으로 Interleukin(IL)-6, IL-8, eotaxin의 mRNA 발현을 측정하였다. 발현을 위한 primer의 염기서열과 산출물의 크기는 Table 1과 같다. 각각 시토카인의 반응조건은 IL-6와 IL-8은 94℃ 1분, 60℃ 1분, 72℃ 1분이었고 eotaxin은 94℃ 1분, 65℃ 1분, 72℃ 1분이었다.

결     과

   동시배양모델에서 상피세포와 섬유아세포는 48시간까지 모두 건강하였고 실험에 사용하기에 아무 이상이 없었다(Fig. 2). IL-6 mRNA의 발현은 상피세포에 비해 섬유아세포에서 강하게 발현하였고 단독으로 배양된 섬유아세포와 상피세포에 비해 동시배양된 세포들에서 각각 발현이 증가하였다. 이것은 각 시간대별 검체에서 모두 일정하였다(Fig. 3). IL-8 mRNA도 섬유아세포에서 상피세포에 비해 강하게 발현되었으며 단독으로 배양된 세포에 비해 동시배양세포에서 강하게 발현되었고 동시배양시간이 길어질수록 그 발현이 더 증가하는 것을 볼 수 있었다(Fig. 4). Eotaxin mRNA의 발현은 섬유아세포에서 미약하게 나타났으며 상피세포에서는 그 발현을 볼 수 없었고 동시배양세포와 단독배양세포 간의 차이를 볼 수 없었다(Fig. 5).

고     찰

   비용종에서 시토카인의 발현은 염증반응을 시작하는 단계에 작용하는 IL-1, IL-6, IL-8과 기질의 섬유화와 기저막의 비후와 관련된 transform growth factor-β가 보고되었고, 알레르기 병태생리에 작용하는 eotaxin, IL-4, IL-5 등이 발현하여 염증이 원인이라는 설과 알레르기 병인론이 모두 가능성을 보이고 있다.⁴⁾ 또한 GM-CSF(granulocyte myelocyte colony stimulating factor)와 stem cell factor 등의 발현도 입증되어 유입된 염증세포의 분화와 생존기간에 좋은 환경을 유지하는 것으로 생각된다. 특히 구조세포의 주된 세포인 상피세포와 섬유아세포의 역할은 이러한 환경을 유지하는데 무엇보다 중요하다고 하겠다.⁵⁾
   호흡기 상피세포는 이전에는 여러 질환의 목표세포로 생각하였으나 많은 연구를 통하여 더 이상 단순히 목표세포만은 아니라는 것이 밝혀졌다. 알레르기 질환에서 상피세포는 세포증식, 수용체와 ligand(접착 분자, IgE 수용체, MHC class II molecule)의 발현의 증가, 전사인자의 활성화, 염증 매개물 생산의 증가에서 알 수 있듯이 활성화된 상태이다. 또한 상피세포는 다양한 매개물(lipid mediators, 활성 산소, metalloprotease, growth factors, 시토카인 등)을 생산한다.⁶⁾ 그러므로 상피세포에서 기원하는 시토카인과 chemokine들은 염증 세포의 specific subsets을 활성화하며 기도 미세환경의 생존을 연장하여 진행 중인 염증반응을 증폭시킬 수도 있다. Eotaxin, RANTES(regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted protein), MCP-3(monocyte chemoattractant protein-3), MCP-4(monocyte chemoattractant protein-3), IL-6, TARC(thymus-and-activation-regulated chemokine) 의 발현은 정상군에 비해서 진행중인 알레르기 환자의 상피세포에서 발현이 증가되어 있다. 여기에는 IL-1β, TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-9, IL-13 등의 상호작용에 의해 일어난다고 생각된다.^7,8) 게다가 상피세포 내에서 eotaxin과 eotaxin-2는 eotaxin의 생산을 스스로 증가시키고, 이것은 상피세포가 eotaxin의 생산을 증가시키는 자가조절 기전이 존재하는 것을 암시하기도 한다.⁸⁾ 또한 상피세포는 바이러스 감염 후에 발생하는 면역반응에도 관여한다. in vitro 실험 결과에서 호흡기 상피세포는 rhinovirus 또는 RS 바이러스 감염에 반응하여 pro-inflammatory 시토카인(IL-1, IL-6, IL-11, IFN-α, IFN-γ, GM-CSF)와 chemokines(eotaxin, eotaxin-2, IL-8, IL-1β)을 생산하는 것이 증명되었다. 이것은 바이러스 감염 후에 발생하는 알레르기 질환의 악화의 병인으로 생각된다.⁹⁾ 본 실험에서도 상피세포는 IL-6, IL-8의 분비가 현저하였으며 그 발현은 동시배양모델에서 현저하였다.
   섬유아세포는 조직을 유지하는 구조세포로 알려져 있으며 염증에 반응하여 다양한 extracellular matrix protein을 분비하여 회복과정에 관여한다. 최근 연구에 따르면 섬유아세포는 접착분자를 발현하고 많은 inflammatory 시토카인과 chemokines을 생산함이 알려졌다. 천식의 경우 섬유아세포를 TNF-α로 자극하면 RANTES와 eotaxin을 분비한다.
   또한 IL-4는 TNF-α와 상승작용을 일으켜 섬유아세포에서 eotaxin 분비를 촉진하며 심지어 그 양이 상피세포보다 더 많다.¹⁰⁾ TNF-α 또는 IL-4로 자극되면 섬유아세포는 eosinophil activating chemokine(MCP-3, MCP-4) mRNA를 발현하고 IL-4와 IL-13로 자극되면 IL-6, MCP-1의 분비가 증가한다.¹¹⁾ 또한 섬유아세포는 GM-CSF와 stem cell factor를 분비하여 여러 가지 염증세포들의 분화, 활성, 생존에 관여하는데 그 분비가 알레르기와 비알레르기에서 차이를 보인다.¹²⁾ 본 실험에서 섬유아세포는 실험된 모든 시토카인을 분비하였으며 IL-6와 IL-8은 동시배양모델에서 더 현저한 발현을 보였다.
   비용연구에 있어서 생체실험(in vivo)은 윤리적으로 문제가 있어 거의 어렵고, 실험실적 연구(in vitro)가 주를 이루며 검체를 직접 배양하는 조직배양(organ culture)과 세포배양(cell culture)이 주를 이루어왔다. 조직배양은 조직전체의 반응을 볼 수 있다는 장점이 있으나 효과기세포(effector cell)에 대한 구분이 불명확하며 연구에 필요한 자극을 줄 때 모든 조직에 자극이 감으로 인해 오히려 생리적이지 못한 면이 있고 배양 가능기간이 1주 정도에 불과하고 실험마다 조직을 얻어야 하는 문제를 가지고 있다. 반면 세포 배양은 세포를 분리함에 따르는 세포 본성의 변화가 문제가 되며 한가지 세포에 대한 반응만을 봄으로써 전체적인 현상을 이해하는데 부족함이 있다.
   본 실험에서 개발된 동시배양모델은 두 가지의 서로 다른 세포를 한 검체에서 배양하여 transwell을 사용하여 상호작용할 수 있도록 동시배양을 시도한 것으로 두 세포가 생존이 가능한 배지를 설정하여 동시배양 7일까지도 두 세포에 특별한 변화를 보이지 않아 향후 세포 간의 상호 작용을 알아보는 데 좋은 실험모델이 될 것이라고 생각된다. 이 모델은 세포와 세포 간의 상호작용을 알 수 있고, 세포들 사이에 배지가 있어 여기에 여러 가지 물질의 자극이 가능하고 심지어 다른 염증세포를 이용하여 3가지 세포의 상호작용을 알아볼 수 있다는 장점이 있다. 반면 단점은 비용이 많이 들고 세포 간의 성장속도를 맞추어 동시배양 시기를 결정해야 하고 분비된 단백의 측정이 용이하지 않다는 면이 있겠다. 동시배양에서 여러 가지 반응이 나타나는 것은 세포 간에 직접적인 접촉이 없으므로 주로 분비물에 의한 반응으로 생각되며 본 모델에서 세포 간에 서로 반응하는 것을 볼 수 있었다. 세포간 반응에 대해서는 향후 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다.

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