교신저자：양훈식, 156-755 서울 동작구 흑석동 224-1  중앙대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
교신저자：전화：(02) 6299-1765 · 전송：(02) 825-1765 · E-mail：cauent@hanafos.com

서     론

   19세기 후반 aspirin이 처음 소개된 이후로 nonsteroidal anti-inflammatory drugs(NSAIDs)는 해열, 항염, 진통 작용이 우수한 약으로 많이 사용되어 왔다. 1960년대 Samuelsson 등에 의해 prostaglandin(PG) synthesis pathway가 소개되었고, 그 수년 후 Vane JR 등에 의해 cyclooxygenase(COX)에 작용하여 PG 생성을 억제하는 NSAIDs의 기전이 밝혀졌다. 1990년대에 들어와서 NSAIDs가 대장암의 발생을 억제한다는 보고 이후 최근 10년간 대장암, 방광암, 유방암, 피부암, 간암 등에서 NSAIDs의 효과에 대한 많은 연구가 이루어 졌다. 
   COX는 arachidonic acid가 PG와 다른 prostanoid로 전환되는 과정에서 속도제한 효소로 작용하게 되며, NSAID는 이러한 COX를 억제하여 PG E2와 6-keto PG F1α등의 생성을 감소시킨다.¹⁾ 종양에서 NSAID에 의한 PG와 COX의 억제는 세포증식을 감소시키고 종양 세포에 대한 면역작용 및 세포고사(apoptosis)를 증가시켜 종양의 성장을 억제하는데 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.²⁾ COX는 COX-1과 COX-2의 두 개의 isoform으로 나뉘어 진다. COX-1은 거의 모든 세포에 존재하며 외부 자극과 상관없이 house-keeping 유전자에 의해 지속적으로 발현되어³⁾ 다양한 생리학적 항상성 유지에 관여하는 것으로 알려져 있다. 반면에 COX-2는 촉발효소로서 정상적으로는 발현되지 않고 성장인자, 발암 유전자, 발암 물질과 cytokine 등 여러 세포 외적인 자극에 의해 COX-2 유전자로부터 발현된다.⁴⁾ COX-2 유전자는 인간과 동물의 많은 종양에서 관찰되며 특히 대장, 위, 피부와 유선암종 등의 각종 악성 종양에서 COX-2가 과발현된다고 보고되었으며, 두경부 영역에서도 후두암종 등에서 75%로 과발현된다고 보고되었다.⁵⁾⁶⁾ 또한 선택적 COX-2 억제제는 이러한 종양의 발생을 억제하고⁷⁾ in vivo, in vitro 실험에서 종양 세포의 성장 속도를 감소시킨다고 보고되어 왔다.⁸⁾⁹⁾
   선택적 COX-2 억제제의 항암 기전에 대하여는 아직 완전히 밝혀지지 않았으나 여러 가지 가능성 있는 기전들이 제시되고 있다. 현재까지 제시되고 있는 기전으로는 첫째, β-FGF, VEGF, PDGF 등의 혈관생성인자를 조절하여 혈관의 과형성을 억제하고, 둘째, 세포주기를 변화시키며, 셋째, PG에 의해 야기되는 면역 억제를 방해하여 종양에 대한 면역기능을 강화하고, 넷째, 세포고사를 촉진시켜 항암 작용을 나타내는 기전들이 보고되었다.¹⁰⁾ 특히 세포고사를 촉진하는 기전에 관하여서는 많은 다양한 연구가 진행되었고, COX-2의 항종양 효과의 가능성 있는 기전으로 받아들여지고 있다. 또한 COX-2를 과발현하는 세포에서는 세포고사가 억제되며, COX-2억제제는 이러한 종류의 세포들에서 세포고사를 촉진할 수 있는 것으로 보고되었다. 
   방사선치료를 포함한 다양한 종양치료에 있어서 종양 세포 파괴 기전으로 세포고사가 촉진되는 것이 증명되었다. 그리고 COX-2를 과발현하는 세포들은 이러한 종양 치료들에 의한 세포고사에 저항성이 있는 것으로 알려져 있다. 그중 방사선치료는 두경부암의 치료에 있어 수술적 방법, 항암화학요법과 함께 중요한 부분을 차지하는 방법이다. 하지만 역시 암종에 따라 방사선치료에 대한 저항성이 다르며, 특히 COX-2를 과발현하는 종양에서는 방사선치료에 대한 저항이 높은 것으로 보고되고 있다. 이는 COX-2에 의한 세포고사 억제 작용 및 세포 보호 작용에 의한 것으로 추측되고 있다.
   이에 저자는 COX-2를 과발현하는 것으로 알려진 인형 구강 편평세포암 세포를 사용하여 방사선치료와 선택적 COX-2 억제제의 병합요법을 시행하고 그 효과를 판정함으로써 선택적 COX-2 억제제 병합요법이 방사선치료에 상승효과를 나타낼 수 있음을 증명하고, 두경부 영역 암종의 방사선치료에의 활용 가능성을 알아보고자 본 연구를 시행하였다.

재료 및 방법

세포주
   실험에 사용한 종양세포주로 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank)에서 사람의 구강 편평세포암 세포주(human oral cavity squamous cell carcinoma cell line)인 KB cell을 분양 받아 사용하였다. KB cell은 1999년 Goshi Nishimura 등에 의해 COX-2가 과발현됨이 증명된 세포로서 기본 배지는 RPMI 1640에 10% 우태혈청을 첨가하여 사용하였고, 배양 용기에는 5% CO₂와 95% 공기가 공급되고 적절한 습도와 36.5℃의 온도가 유지되도록 하였다. 

실험동물
   실험에 사용된 동물은 Orient Co.에서 구입한 생후 5~6주령의 체중이 평균 18 gm 내외의 수컷 누드마우스(K P700 NU/NU B/C Mice, male) 40마리를 본원 조직학 연구소에서 일주일간 적응기간을 거친 후 사용하였다.
   누드마우스는 Auto control system(Green 퓨어택)에서 사육되었으며 온도 26.0℃, 습도는 45.0%로 유지하였다. 실험은 Clean bench 내에서 이루어 졌다.

사용약물
   실험에 사용된 Meloxicam(상품명 Mobic^®)은 Boehringer Ingelheim에서 자문을 구하여 구입하였다. 비스테로이드계의 에놀릭산유도체로 구조식은 4-hydroxy-2-ethyl-N-(5-methyl-2-thiazolyl)-2H-1, 2-benzothiazine-3-carboxiamine-1, 1-dioxide로 상품화된 제품을 구입하여 사용하였다.

세포주의 이종이식 
   인형 구강 편평세포암 세포주(KB cell)를 배양한 후 1×10⁷/ml을 누드마우스의 우측 대퇴부에 피하 주사하여 이종이식을 시행하였다. 

약물 투여 및 방사선치료
   이종이식 3주 후 누드마우스를 대조군(10마리), 방사선치료만 시행하는 A군(10마리), Meloxicam 치료만 시행하는 B군(10마리), 방사선치료와 Meloxicam 병합요법을 시행하는 C군(10마리)으로 나누어 치료를 시작하였다. Meloxicam 치료를 하는 B군과 C군에는 Meloxicam 20 mg/kg을 2주간 매일 복강 내 주사하였고 C군은 Meloxicam 치료 5일째부터 약물 투여 2시간 뒤에 방사선치료를 시행하였다. 
   방사선치료는 원자력 의학원 방사선 종양학과의 도움을 받아 시행하였다. Co-60 Teletherapy Unit(AECL, T780, Canada)를 이용하여 Field size 4×25 cm², Dose rate 42.895 cGy/min, Dose time 4.66 min, Total tumor dose 2 Gy/fr, Source-skin distance 70 cm으로 하루 2 Gy 용량으로 격일 간격으로 5회 시행하였다(총 10 Gy). 우측 대퇴부에만 국소 조사하였고, 다른 부위는 보호판을 이용하여 보호하였다. A군은 C군과 같은 방법으로 방사선치료를 시행하였다. 

종양의 크기 측정 
   종양의 크기는 이종이식 후 5일 간격으로 측정하였다. 장경과 단경 및 두께를 측정하여 mean tumor volume=(장경×단경×두께)/2(mm³)로 계산하였다. 

조직표본 작성
   모든 누드마우스는 이종이식 5주 후 경추 분리하여 쥐를 희생시킨 다음 접종부위 조직을 떼어내었다. 각각의 누드마우스에서 떼어낸 종양 조직은 이등분하여 일부는 냉동 질소(Liquid nitrogen)에 보관하고 나머지는 10% 중성 포르말린에 24시간 고정시킨 후 파라핀 블록을 제작하고 통상적인 H&E 염색을 실시하여 형태학적인 소견을 관찰하였다.

세포고사(Apoptosis)와 세포 증식능(Proliferation index) 측정
   세포고사는 TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated cUDP nick end labeling) 방식을 이용하여 측정하였고, TACS TM 2 Tdt DAB, in situ Apoptosis detection kit(Trevigen, USA) 제품을 사용하여 면역조직화학적 염색을 시행하고, 400배 시야에서 1000개의 세포 중 세포고사를 보이는 세포의 수를 세어 백분율(%)로 나타내었다. 
   세포 증식능은 Mouse monoclonal anti Ki-67 antibody(Zymed, USA)와 Super Picture Kit(Zymed, USA)를 이용하여 면역조직화학 염색을 시행하고 400배 시야에서 1,000개의 세포 중 Ki-67에 강한 양성 반응을 보이는 세포를 세어 백분율(%)로 나타내었다.

통계 처리
   대조군과 A, B, C 각 군간의 종양의 크기의 변화는 SPSS Ver 6.0의 paired T test를 이용하여 비교 분석하였으며, 세포고사와 세포증식능에 대한 결과는 student T test를 이용하여 비교 분석하였다. p값이 0.05 미만인 경우를 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다.

결     과

종양의 성장 비교
   대조군과 A, B, C 각 군의 종양의 크기는 이종 이식 후 5일 간격으로 측정하였고, 이종이식 20일(치료시작 전), 이종이식 25일(Meloxicam 투여 5회 후, 방사선치료 1회 후), 이종이식 30일(Meloxicam 투여 10회 후, 방사선치료 3회 후), 이종이식 35일(Meloxicam 투여 14회 후, 방사선치료 5회 후, 치료 종결) 4개의 결과를 비교하였다. Meloxicam과 방사선 병합치료를 시행한 C군에서 치료 전반에 걸쳐 가장 효과가 좋았으며, 치료 종결 후 종양의 부피가 가장 작았다. 방사선치료만 시행한 A군은 방사선치료 3회까지는 Meloxicam만 투여한 B군과 큰 차이가 없었으나 방사선치료 5회 시행 이후에는 통계학적으로 의미있게 차이를 보였다. Meloxicam만 투여한 B군은 Control과 비교하여 통계학적 차이를 보이지 않았다(Fig. 1).

면역조직화학적 염색

TUNEL assay
   세포고사지수는 TUNEL 방식을 이용하여 면역조직화학적 양성 반응을 보이는 세포를 백분율로 나타내어 대조군에서 6.93%였으며, A군에서 11.12%, B군에서 9.55%, C군에서 17.36%로 Meloxicam과 방사선의 병합치료를 시행한 C군에서 통계학적으로 유의하게 높게 측정되었다(p<0.05)(Table 1, Fig. 2).

Ki-67 staining
   세포증식지수는 Ki-67 항체에 대한 면역조직화학적 양성반응을 보이는 세포를 백분율로 나타내어 대조군에서 24.78%였으며, A군에서 17.04%, B군에서 15.07%, C군에서 14. 22%로 Meloxicam과 방사선의 병합치료를 시행한 C군에서 통계학적으로 유의하게 낮게 측정되었다(p<0.05)(Table 2, Fig. 3).

고     찰

   과거에 COX 억제제는 주로 해열, 항염, 진통제로 사용되어왔으나 1990년대부터는 Sulindac이나 NSAIDs가 대장용종의 발생을 억제하는 것으로 보고되는 등¹¹⁾ 대장암 및 다양한 종양에 대한 항암화학요법 치료제로서의 효과들에 대하여 연구되어 왔다. 이러한 비 특이적 COX 억제제는 대장암의 항암화학요법에 상당한 효과가 있는 것으로 보고되었지만 또한 위장관 출혈이나 궤양을 유발하는 등의 부작용도 많다고 알려져 있다.⁸⁾ NSAIDs가 유발하는 부작용의 이유로는 COX-1 효소의 억제로 인하여 PG의 세포보호(cytoprotection) 효과가 감소하기 때문으로,¹²⁾ 이러한 부작용을 극복하기 위하여 선택적 COX-2 억제제가 개발되었으며 1995년 Tsujii에 의해 악성 종양에서 COX-2의 역할이 알려지기 시작한 후로 대장암과 다른 암에서 여러 가지 선택적 COX-2 억제제의 항암화학요법 치료제로서의 가능성이 연구되어 왔다.¹³⁾¹⁴⁾ 이 중 저자들이 사용하였던 Meloxicam은 COX-1 IC₅₀ 3.27 μM, COX-2 IC₅₀ 0.25 μM으로 COX-1에 비하여 13.1배의 COX-2 억제 효과가 있다고 보고된 약물이다. Lee 등은 선택적 COX-2 억제제의 종양성장 억제 효과를 증명하기 위해 Meloxicam을 10 mg/kg, 40 mg/kg의 농도로 인형 구강편평세포암종을 이종 이식한 nude mouse의 복강 내 주사하여 Meloxicam이 종양 성장 억제 효과가 있으며 그 효과는 Meloxicam의 농도에 비례한다고 보고하였다.¹⁵⁾ 저자들의 실험에서는 20 mg/kg 농도의 Meloxicam을 이용하여 실험을 시행하였으나 대조군과 비교하여 Meloxicam만 단독으로 투여한 군에서 종양의 성장을 억제하는 효과는 관찰할 수 없었다. 이러한 결과는 투여 용량에 의한 것으로 판단되며, 투여 용량을 증가시키면 종양 성장 억제 효과가 나타날 것으로 판단된다. 
   NSAIDs, 즉 비선택적 COX 억제제는 in vitro, in vivo에서 종양 세포의 방사선 감수성을 증가시키는 것으로 다양한 문헌에서 보고되어 왔다.¹⁶⁾¹⁷⁾ 최근 일부에서 선택적 COX-2 억제제의 종양 세포에 대한 방사선 감수성에 관한 연구가 시행되었다. Milas 등은 in vivo 실험을 통해 선택적 COX-2 억제제인 SC-236이 방사선의 종양 성장 억제 효과를 유의하게 증가시킨다고 보고하였고,¹⁸⁾ Kishi 등은 이러한 효과를 확인하였다.¹⁹⁾ in vitro에서도 COX-2 억제제가 종양 세포의 방사선 감수성을 증가시킨다고 보고되었고 Peterson 등은 in vitro에서 clonogenic 세포생존분석을 시행하여 지속적으로 COX-2를 발현하는 U251(인형 신경교종세포)에서 SC-236이 방사선에 의한 종양 성장 억제 효과를 증가시킨다고 보고하였다.²⁰⁾ 각각의 연구에 사용된 방사선치료 용량은 여러 가지 조건에 따라 다양하였다. 저자들은 인형 구강편평세포암 세포인 KB cell을 사용하였고, Co-60 Teletherapy unit을 이용하여 하루 2 Gy의 용량으로 격일 간격으로 5회, 총 10 Gy의 용량으로 방사선치료를 시행하였다. 일반적으로 인간의 편평세포암의 방사선치료에 있어 치료 용량이 70 Gy인 것과 비교하면 적은 용량이지만, 본 연구가 종양의 관해를 목적으로 시행된 것이 아니라, 종양의 성장 억제 효과를 평가하고자 한 것이며, 실험 동물의 생존을 고려하여 10 Gy의 용량으로 방사선치료를 시행하였다.
   선택적 COX-2 억제제들의 방사선 감수성 증가 효과의 기전에 대하여서는 명확히 밝혀진 바가 없다. Hongryull Pyo 등은 COX-2를 지속적으로 발현하는 H460 세포(인형 폐암세포)를 이용한 실험에서 선택적 COX-2 억제제인 NS-398로 치료하였을 때 방사선 생존 곡선의 shoulder region이 감소되는 것을 관찰하였고, 이것은 선택적 COX-2 억제제가 H460 세포의 손상 후 회복기전을 저해하여 나타나는 결과로 보고하였다.¹⁰⁾ 또한 선택적 COX-2 억제제들의 방사선 감수성 증가의 기전으로 세포고사를 촉진한다는 가설에 대하여 살펴보면 COX-2 억제제가 COX-2를 발현하는 세포에서 세포고사를 촉진하며, mitomycin C와 sodium butyrate 같은 항종양 약물에 의한 세포고사를 촉진한다고는 알려져 있으나 방사선치료에 있어서의 효과에 관한 보고는 다양하다. Hongryull Pyo 등은 NS-398이 COX-2를 지속적으로 발현하는 RIE-S와 H460 세포에서 방사선에 의한 세포고사를 촉진시킨다고 보고하였으나, Kishi 등과 Peterson 등은 COX-2 억제제의 방사선 감수성 증가 효과가 세포고사와 연관되지 않는다고 보고하였다.^10)19)20) 이러한 결과의 차이는 각 실험에 다른 종류의 세포가 사용되었다는 점과 각각 다른 분석방법이 사용된 점 등 실험 과정의 여러 가지 차이 때문에 발생하는 것으로 판단된다. 저자의 실험에서는 in vivo에서 선택적 COX-2 억제제인 Meloxicam의 KB cell에 대한 방사선 감수성 증가효과를 세포고사지수(Apoptosis index)와 세포증식지수(proliferation index)를 이용하여 분석하였고, Meloxicam이 통계적으로 유의하게 세포고사(apoptosis)를 증가시키며 세포증식지수를 감소시키는 것을 관찰하여 그 기전에 세포고사가 관계됨을 증명하였다. 
   많은 인간의 종양들은 COX-2를 지속적으로 발현하는 것으로 알려져 있다. 또한 선택적 COX-2 억제제는 비선택적 COX 억제제가 가지는 일반적인 합병증, 예를 들면 위장관 합병증 등을 가지지 않는 독성이 적은 안전한 진통제이다. 따라서 이러한 선택적 COX-2 억제제들은 종양 환자들에게 사용하는데 있어서 좀 더 안전할 수 있으며 COX-2를 발현하는 종양의 방사선치료 효과를 증가시킬 수 있을 것이다. 게다가 Kishi 등과 Peterson 등은 COX-2 억제제가 쥐의 정상세포에서의 방사선 감수성에는 영향을 미치지 않는다고 보고하였고,¹⁹⁾²⁰⁾ 이것은 정상 조직에서는 COX-2의 발현이 없기 때문인 것으로 판단된다. 따라서 COX-2 억제제를 방사선 감수성 증강제로 사용할 때 그 치료 용량을 좀 더 증가시킬 수 있을 것으로 판단된다.
   결론적으로 선택적 COX-2 억제제는 인간의 종양 치료에 있어서 방사선 감수성 증강제로 이용가능할 것으로 생각되며, 치료 시작 전에 종양 세포에서의 COX-2의 발현을 측정함으로써 병합치료의 반응을 예측할 수 있는 분자생물학적 인자로 이용할 수 있을 것으로 생각된다.

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