교신저자：이규석, 140-757 서울 용산구 한강로3가 65-207  중앙대학교 의과대학교 이비인후과학교실
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서     론

   최근 흔히 사용되는 nonsteroidal anti-inflammatory drugs(이하 NSAIDs)가 인체의 여러 장기에서 발생하는 일부 종양의 발생을 억제한다는 여러 보고에 따라 이에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. NSAIDs의 약리학적 작용은 arachidonic acid가 prostaglandin(PG)로 전환되 는 과정에서 속도제한 효소로 작용하는 cyclooxygenase(COX)와 다른 효소들을 억제하여 PGE2와 6-keto PGF1α 의 생성을 감소시키며,¹⁾ 종양에서 PG와 COX의 억제는 세포증식과 종양세포에 대한 면역작용과 세포고사(apoptosis)를 증가시켜 종양의 진행을 억제하는데 중요한 역할을 한다.^2)3)4)5)6) 
   COX는 COX-1과 COX-2 등 두 개의 isoform이 존재 하며 COX-1은 대부분의 조직에서 외부 자극과 상관없이 house-keeping 유전자에 의해 지속적으로 발현되나,⁷⁾⁸⁾ COX-2는 정상적으로는 발현되지 않고 성장인자, 발암유 전자, 발암물질과 cytokine 등 여러 세포 외적인 자극에 의해서 조기에 즉각적으로 COX-2 유전자로부터 유도 합 성된다.⁹⁾ COX-2 유전자는 대장, 위, 피부와 유선암종에서 높이 발현되었고, 각종 악성 종양에서의 COX-2 유전자의 발현은 주변의 정상조직세포에 비해 종양세포에서 COX-2 유전자가 과발현되고 두경부영역에서도 후두암종등에서 75%로 과발현되었다.^10)11)12)13)
   선택적인 COX-2 억제제의 항암기전에 대하여는 아직 완전히 밝혀지지 않았으나 위장관암세포주에 대한 연구 에서 COX-2의 부산물인 PG-E₂가 세포고사를 억제하고 bcl-2 유전자를 증가시킨다고 보고하여 이러한 과정을 억제하여 종양의 형성을 억제시키는 것으로 알려져 있다.³⁾ 저자가 사용한 선택적 COX-2 억제제인 Meloxicam은 비 스테로이드계의 에놀릭산유도체로, 최근에 대장암^14)15)16)과 폐의 비소세포성암¹⁷⁾의 세포주를 이용한 시험관내 감수성 검사에서 효과가 있는 것으로 보고되어 있지만, 인체 두경 부암세포주를 이용한 이종이식을 통한 항암효과에 관하여는 아직 연구된 바 없었다.
   이에 저자는 인체의 구강편평세포암에서 배양된 세포주 로, COX-2가 과발현되는 것으로 알려져 있는 KB세포주를 누드마우스에 이종이식 배양시킨 후, 선택적 COX-2 억제제인 Meloxicam을 복강 내 주사하여 이러한 COX-2 억제제가 종양세포의 증식능과 세포괴사에 미치는 영향을 비교 관찰하여 항암화학요법제로서의 가능성을 알아보고자 본 연구를 시행하였다.

재료 및 방법

세포주
   실험에 사용한 종양세포주로는 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank)에서 사람의 구강편평상피암 세포주 인 KB cell을 분양 받아 사용하였으며 KB cell은 1999년 Goshi Nishimura 등에 의해 COX-2가 과발현됨이 증명된 세포로서 기본 배지는 RPMI 1640에 10% 우태혈청을 첨 가하여 사용하였다.

실험동물
   실험에 사용된 동물은 BIO Genomics에서 구입한 생후 5주이며 체중이 평균 28 gm 내외의 수컷 누드마우스(Crj：BALB/c-nu/nu mice, male) 30마리를 중앙대학교 생화 학 연구소에서 일주일간 적응기간을 거친 후 사용하였다.

사용약물
   실험에 사용된 Meloxicam(상품명 Mobic(r))은 Boehringer Ingelheim에 자문을 구하여 원성분을 구입하였고 구조식은 4-hydroxy-2-methyl-N-(5-methyl-2-thiazolyl)-2H-1, 2-benzothiazine-3-carboxiamide-1, 1-dioxide로 DMF(dimethylformamide), UH-AC62XX 에 녹여서 사용하였다. 

실험동물의 이종이식과 약물처리
   누드마우스는 먼저 편평세포암 세포주를 1×10 7/ml을 등쪽 피하지방층에 접종한 뒤 대조군(10마리)과 약물 투여군 A(10마리)군, 약물투여군 B(10마리)군으로 나누 어 A군에는 세포주 투여 1주일 후부터 3주간(21일) 주 4회 Meloxicam을 10 mg/kg의 농도로 하루에 한차례 복 강내 주사하였고 B군에게는 같은 시기에 같은 빈도로 Meloxicam을 40 mg/kg의 농도로 하루에 한차례 복강내 주 사하였으며 대조군, 약물투여군 모두에서 종양세포를 접종 한지 4주 후 종양조직을 얻었다. 

조직표본 작성
   모든 누드마우스는 편평세포암 세포주를 접종한 4주 후 경추분리하여 쥐를 희생시킨 다음 접종부위 조직을 떼어 내었다. 조직은 이등분하여 일부는 냉동 질소(Liquid nitrogen)에 보관하고 나머지는 10% 중성 포르말린에 24시 간 고정시킨 후 파라핀 블록을 제작하고 통상적인 H & E 염색을 실시하여 형태학적인 소견을 관찰하였다. 

종양의 성장 측정
   각각의 누드마우스에서 KB cell을 접종한 1주, 2주, 3주 후에 등쪽 표피에 자라는 종양의 장경과 단경을 측정하여 mean tumor volume=(장경×단경2)/2(mm3)로 측정하였고 4주 후 떼어낸 종양조직의 tumor weight(gm)를 측정 하였다. 

세포고사(Apoptosis)와 증식능(Proliferative index)
   Apoptosis는 terminal deoxynucleotidyl transferase- mediated cUDP nick end labeling(TUNEL) 방식을 사용 하여 측정하였으며 ApopTaq Plus(Oncor. Gaithersburg, MD) 제품을 사용하여 면역화학적 염색이 된 세포를 저배 율상(×100) apoptosis가 가장 활발한 부위를 선택한 후 400배 시야에서 1,000개의 세포 중 apoptosis를 보이는 세포수를 세어 백분율(%)로 나타내었고 괴사부위는 피하 였다. 세포증식지수(PI)는 anti-human Ki 67 rabbit monoclonal 항체(Immunoteck, Marseille, France)에 면역 조직학적 염색 후 400배 시야에서 1,000개의 세포중 Ki 67에 대한 면역 조직화학 염색에서 핵에 강한 양성반응을 나타내는 세포를 세어 백분율로 나타내었다. 

통계 처리
   세군 간의 각 결과를 SPSS Ver6.0과 분산 분석(ANOVA) 을 이용하여 하였으며 p값이 0.05미만인 경우를 통계적으 로 유의한 것으로 간주하였다. 

결     과

종양의 성장
   대조군과 투여군에서 종괴의 성장 mean tumor volume은 종양세포 접종 3주 후부터 즉, Meloxicam 투여 2주 후부터 대조군에 비하여 투여군에서 통계학적 유의하게 종양 성장의 억제를 보였으며(Table 1) Meloxicam 투여 3주 후 종괴를 누드마우스로부터 분리하여 측정한 mean tumor weight 평균치는 대조군(control)은 1.968 gm이었 으며, Meloxicam을 세포주접종 후 1주일부터 3주(21일)간 주 4회 10 mg/kg의 농도로 하루에 한차례 복강내 주사한 A군에서는 1.602 gm, 같은 시기에 같은 빈도로 40 mg/kg 의 농도로 하루에 한차례 복강내 주사한 B군에서는 1.238 gm으로 종양의 성장이 대조군에 비하여 통계적으로 유의 하게 억제되었다(p<0.05)(Table 2, Fig. 1).
   누드마우스의 무게는 접종 전 평균 28.55 gm±1.72 였 으며 Meloxicam 투여 3주 후 대조군은 26.62±2.12, A 군은 24.88±3.14, B군은 25.15±2.88로 군 간의 통계학적 차이는 없었다. 

세포고사와 세포증식 지수 
   Apoptotic index는 TUNEL에 면역조직학적 양성반응을 보이는 세포를 백분율로 나타내어 대조군에서 1.4740%로 관찰되었으며 A군에서는 6.7820%, B군에서는 6.9260% 로 통계학적으로 유의하게 증가되었으며(p<0.01)(Table 3, Fig. 2), 세포증식지수는 Ki 67항체에 대한 면역조직학적 양성반응을 보이는 세포를 백분율로 나타내어 대조군에서 30.0400%로 관찰되었으며, A군에서는 23.1000%, B군에 서는 17.3600%로 치료용량에 비례하여 유의하게 감소 되었다(p<0.01)(Table 4, Fig. 3). 

고     찰

   종양의 치료에 있어서 보조적 화학요법은 매우 효과적이 며 중요한 위치를 차지하고 있고 가능하면 부작용이 적은 새로운 약물의 개발이 계속 연구되고 있어 본 저자는 최근 개발된 선택적 COX-2 억제제인 Meloxicam의 투여가 누드마우스에 이종이식된 구강편평세포암의 성장에 미치는 영향을 살펴보고자 하였다.
  COX-2의 발현이 종양세포에서는 어떻게 표현되는지 아직 확실하지는 않지만 형질전환된 세포에서 PG의 생성 이 증가되며, 이 경우 PG가 COX-2 발현의 전사인자로 작용하여 COX-2가 발현되고, 과발현된 COX-2의 생물 학적 작용에 의해 종양이 진행된다고 하였다.⁸⁾ 위암, 대장 암, 식도암과 같은 소화기계 악성 종양에서 COX-2가 과 발현 되었음이 이미 보고 되었고^2)12)19) 이러한 COX-2의 과발현이 종양의 형성, 전이에 관련되어 있다는 것을 근거로 COX-2 억제제를 이용하여 이러한 종양의 성장을 억제 하려는 시도가 이루어지고 있다.
   COX 억제제는 항염제, 진통 해열제로 수년간 사용되어 왔으며 최근에는 선택적 COX 억제제도 다양하게 개발되고 있으나 항암화학요법 치료제로는 최근에 대장암에 대한 치 료만이 개발되어왔으며,¹⁶⁾ Sulindac이나 NSAIDs는 대장용 종의 발생을 억제하는 것으로 보고되었다.⁵⁾ 이러한 비 특 이적 COX 억제제는 대장암의 항암화학요법에 상당한 효 과가 보고 되었지만 또한 위장관 출혈이나 궤양을 유발하는 부작용도 상당하다고 알려져 있다.¹⁴⁾ 이러한 NSAIDs가 유발하는 부작용의 이유로는 COX-1 효소의 억제로 인하 여 PG의 세포보호(cytoprotection) 효과가 감소하기 때문으로,²⁰⁾ 이러한 부작용을 극복하기 위하여 선택적 COX-2 억제제가 개발되었으며 1995년 Tsujii에 의해 악성종양 에서 COX-2의 역할이 알려지기 시작한 후로 대장암과 다른 암에서 선택적 COX-2 억제제의 항암화학요법 치료제 로서의 가능성이 연구되어 왔고,⁹⁾¹⁵⁾ 이 중 저자가 사용한 Meloxicam은 COX-1 IC₅₀ 3.27 μM, COX-2 IC₅₀ 0.25 μM COX-1에 비하여 13.1배의 COX-2 억제 효과가 있 다고 보고된 약물이다.⁷⁾

   두경부영역에서 COX-2의 발현율에 대하여는 1999년에 처음으로 발표되어 식도 편평세포암종에서 COX-2의 발현 이 발현정도와 암종의 분화정도와 밀접한 관계가 있다고 보고되었으며,²⁾ 저자는 2001년에 두경부암종 중 후두암종 에 대한 COX-2의 발현을 관찰하여 정상점막에서는 10% 미만의 발현율을 보인데 반해 후두암종에서 75%의 발현율 을 보이는 것으로 보고하였고 후두암의 경우 역시 분화도 및 병기와 밀접한 관계가 있음을 관찰하여 보고하였다.¹⁰⁾ 
   저자가 사용한 세포주는 두경부암세포주 중 이종이식 종양 형성능력이 있고 COX-2를 과발현하는 암세포주를 선택 하여 본 연구를 진행하였다. 
   본 연구결과 선택적 COX-2 억제제인 Meloxicam은 누드 마우스에 이종이식된 인형구강종양조직에서 apoptosis를 증가시키고 종양세포의 증식능을 감소시켜 종양의 크기를 감소시키는 효과를 나타내었다. 그 중 apoptotic index는 10 mg/kg의 Meloxicam을 투여한 군에서도 통계학적 으로 의미 있는 증가를 보여(p<0.01) 소량으로도 Meloxicam이 apoptosis를 유발하는 것을 관찰할 수 있었다. Ki 67을 이용한 세포증식능의 관찰에서도 Ki 67에 면역조직 학적으로 염색되는 세포가 모든 군에서 관찰되었지만 Meloxicam을 투여한 군에서는 용량에 비례하여 염색되는 세 포가 감소하는 양상을 보여 Meloxicam의 투여와 증식능의 감소에 밀접한 관계가 있음을 관찰할 수 있었다. 또한 apoptosis의 발현과 증식능의 억제 기전에 대하여서는 추가적으로 COX-2의 부산물인 PGE₂와 6-keto PGF_1α 의 변화와 bcl-2 유전자 발현 변화, intreleukin-6, haptoglobulin등의 종양증식과 관련이 있는 인자들의 연구가 필요하다 생각된다.
   본 실험에서 저자는 선택적 COX-2 억제제가 COX-2가 과발현되는 두경부암에서 종양의 억제작용을 확인하였으며, 임상적으로도 종양의 근본절제술 후에 시행하는 항암 요법 의 한 약물로서 사용할 만한 가치가 있는 것으로 생각되며 향후 임상실험 및 추가 실험을 통하여 약물작용 기전과 안정성이 입증되어야 할 것으로 생각된다.

결     론

   COX-2 억제제인 Meloxicam은 인형 구강편평상피세 포암 세포주인 KB cell을 누드마우스에 이종이식 후 종양 발현을 본 실험에서 종양조직의 증식을 억제한다고 판단 되며 암종의 근본 절제술 후에 시행하는 항암요법의 한 약물로 사용 가능성이 있다고 생각되며 이에 대한 억제기 전과 다른 두경부암에 대한 실험 등의 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다.

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