교신저자：장용주, 138-736, 서울 송파구 풍납동 388-1  울산대학교 의과대학 서울아산병원 이비인후과학교실
교신저자：전화：(02) 3010-3712 · 전송：(02) 489-2773 · E-mail：jangyj@amc.seoul.kr

서     론

   바이러스성 상기도염은 다양한 바이러스 병원체에 의해 발생하는데 가장 흔히 발견되는 바이러스는 rhinovirus(RV)이다. RV에 의한 감염이 50% 이상을 차지하므로 RV 감염은 인간에게 가장 흔한 급성 감염이라 할 수 있다.¹⁾ RV 감염은 주로 비강점막과 비인강점막의 상피세포층에서 일어나며 IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, RANTES, MIP, IL-11, GM-CSF 등의 cytokine 분비를 증가시킨다.²⁾³⁾
   상피세포에서 RV의 주된 수용체는 intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)인데 기도상피세포에서는 그 표면에 ICAM-1이 발현되므로 RV 감염의 표적이 된다. RV 감염의 90% 정도는 ICAM-1과의 결합에 의해서 이루어지고 RV 감염에 의해서 호흡상피세포의 ICAM-1 발현이 증가한다고 알려져 있다.⁴⁾ 또한 ICAM-1은 혈관내피세포나 호흡상피세포에서 발현되어 백혈구에서 발현되는 leukocyte function-associated antigen-1과의 상호작용에 의하여 백혈구가 국소염증이 있는 위치로 이동하는데 관여한다. 이러한 다양한 작용을 수행하는 ICAM-1은 단순한 RV의 수용체로서의 역할 뿐만 아니라 RV 감염에 수반되는 기도상피세포의 염증 반응에서 중요한 역할을 하며 RV 감염의 예방 및 치료를 위해 ICAM-1 발현의 증가를 억제하기 위한 다양한 연구가 진행되고 있다.⁵⁾
   에탄올 섭취는 소화기관을 비롯한 여러 장기에 질병을 일으키고 면역활동의 변화를 가져오며 다양한 만성 질환을 악화시킨다.⁶⁾ 그럼에도 불구하고 에탄올 섭취가 기도상피세포의 병태 생리나 바이러스성 상기도염에 대한 감수성에 미치는 영향에 대한 연구는 미미한 실정이다. 에탄올은 섭취농도에 따라 위장관 상피세포 tight junction의 구조 및 기능의 가역적인 변화에서부터 표면상피세포의 파열 및 박리에 의한 세포사 및 점막의 손상에 이르기까지 상피조직의 다양한 변화를 일으키며 또한 에탄올 섭취 후 생성된 free radical은 NF-κB의 활성화를 통해 ICAM-1을 증가시키고 증가된 ICAM-1과 백혈구 침윤이 알코올 유발성 간질환의 병태생리에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다.⁷⁾
   Lopez-Souza 등⁸⁾은 기관상피세포 배양을 통한 RV 감염 연구에서 상피세포의 분화정도에 따라 바이러스의 감염에 대한 감수성이 변화하고 분화가 미성숙하고 transepithelial resistance(TR)이 낮을수록 RV 감염이 증가한다고 하였다. 최근의 다른 연구에서는 고농도의 에탄올은 표면상피세포의 파열 및 박리를 통한 세포사를 초래하여 점막의 손상을 일으키지만 저용량의 세포독성이 없는 에탄올은 가역적인 tight junction의 손상 및 TR의 감소를 야기함이 보고되었다.⁹⁾¹⁰⁾
   본 연구에서는 에탄올이 기도점막상피세포에서 ICAM-1 발현의 변화 및 tight junction을 포함하는 연접 복합체(junction complex)의 손상을 초래하여 RV 감염에 영향을 줄 것 이란 가정을 하였다. 그러한 가정을 확인하기 위하여 기도상피세포 세포주인 A549 세포에 에탄올을 처리한 후 RV 감염을 유발하여 에탄올이 RV 감염에 어떠한 영향을 미치는가를 알아보고자 하였다. 또한 RV 감염의 병태생리학적 변화가 상피세포층의 방어막기능과 구조적 통합성을 나타내는 지표인 TR의 변화와 동반되는가를 연구하고자 하였다. 

대상 및 방법

바이러스 
   Rhinovirus-16(RV-16)(ATCC, Rockville, MD)을 PBS(phosphated buffered saline)로 희석하여 -70℃ 냉동고에 실험 시까지 보관하였다. 

세포의 배양 
   A549(alveolar epithelial type II respiratory cells, ATCC, Rockville, MD) 세포는 10%의 fetal bovine serum (GIBCO, Grand Island, NY)이 포함된 F-12K(GIBCO, Grand Island, NY)를 기본 배양액으로 하여 배양하였다. 바이러스 역가(viral titer)의 측정에 사용된 MRC-5(human fetal lung fibroblast)는 2 mM L-glutamine, 20 mM HEPES, 100 units/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 0.25 μg/ml fungizone을 포함하는 minimum essential media(MEM)(GIBCO, Grand Island, NY)를 기본 배양액으로 하여 10% fetal bovine serum을 첨가하여 95%의 공기, 5% CO₂, 37℃의 항온, 항습 조건에서 배양되었다.

A549 세포에 대한 에탄올의 세포독성 측정 
   96 well plates에 A549 세포를 well당 8×10⁴ 씩 넣고 배양하여 24시간 후 배양액을 제거하고 여러 농도의 에탄올(0%, 7.5%, 10%, 11%, 12%, 13%, 15%, 20%)을 100 μl씩 넣어 60분간 처리한 후 PMS(phenazine methosulfate)와 MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(carboxymehyoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt] 용액을 혼합한 시약을 20 μl씩 첨가하였다. 0% 에탄올이란 PBS 만을 넣어준 것을 말하며 각 에탄올 농도는 배양액에 적당한 양의 에탄올을 넣어 미리 만들어 둔 각각의 에탄올 용액을 사용하였다. 어두운 곳에서 4시간 더 배양한 후 자외선 분광 광도계(Molecular Devices, Menlo Park, CA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였으며 재현성을 확인하기 위해 4회 반복 시행하였다(Fig. 1).

A549 세포에 대한 RV-16 감염
   실험군은 에탄올군과 에탄올+RV군으로 설정하였으며 에탄올군은 A549 세포에 여러 농도의 에탄올(0%, 1%, 3%, 5%, 7.5%, 10%)을 처리하였으며 에탄올+RV군은 여기에 RV-16을 감염시켰다. 각 실험군에서 A549 세포를 6 well plates에 well당 8×10⁵ 이 되도록 분주하고 10% F-12K 배양액 2 ml를 넣고 배양하였다. 24시간 후 배양액을 제거하고 다양한 농도의 에탄올(0%, 1%, 3%, 5%, 7.5%, 10%) 1.6 ml에 60분간 처리한 후 에탄올을 제거하고 PBS 1 ml로 3회 세척하였다. 0% 에탄올이란 PBS 1.6 ml만을 넣어준 것을 말하며 각 에탄올 농도는 배양액에 적당한 양의 에탄올을 넣어 미리 만들어 놓은 각각의 에탄올 용액을 사용하였다. 그 후 에탄올군에는 well당 10% F-12K 배양액을 넣고 3일간 항온 항습 조건에서 배양하였다. 에탄올+RV군에는 다양한 농도의 에탄올로 처리한 후 well당 PBS를 200 μl씩 넣고 RV-16을 1 MOI(multiplicity of infection) 감염시키고 4시간 후 PBS 1 ml로 3회 세척하였다. 이후 3일간 항온 항습 조건에서 배양하였다. 배양 3일째 세포배양액을 수집하여 ELISA와 바이러스 titer 측정을 하였으며, 세포는 ICAM-1 유세포분석에 사용하였다(Fig. 1). 

ICAM-1에 대한 유세포분석 
   세포를 PBS 1 ml로 세척한 후 0.25% trypsin-EDTA 100 μl를 넣고 37℃에서 5분간 방치하였다. 10% F-12K 배양액 1 ml를 넣고 1,800 rpm에서 원심 분리하였다. 그 후 PBS 3 ml를 넣고 세척한 후 원심분리하고, 침전된 각 실험군 세포에 항 ICAM-1항체(mouse monoclonal anti human CD 54- FITC, Serotec, UK)를 4 μl씩 넣었다. 항원항체반응은 빛이 들어가지 않도록 조심하며 4℃에서 30분간 반응시켰다. PBS로 두번 씻고, 1% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)/PBS로 고정시켰다. 시료를 FACScan 분석기(Becton Dickinson, Ontario, Canada)를 이용하여 유세포분석을 측정하였다.

바이러스 역가의 측정
   MRC-5 세포를 96 well plates에 한 well 당 3×104의 수로 10% MEM 배양액 100 μl에 넣고 배양하였다. 다음날 상층액을 버리고 5% MEM 125 μl를 각각의 well에 넣었다. 그 위에 에탄올+RV군에서 얻은 상청액(supernatant)을 5% MEM으로 10배씩 희석(10-1배 농도에서 10-7배 농도까지)하여 25 μl씩 넣었으며 각 농도 당 4개의 well에 분주하였다. CPE(cytopathic effect)가 나타나는 시점까지 5일부터 2주까지 매일 관찰하였으며 광학현미경(OLYMPUS BX 40, Japan) 100배 시야에서 세포를 관찰하였다. 바이러스 역가는 각 희석배수의 4개 중 2개 이상의 well에서 CPE가 나타나는 가장 높게 희석된 농도(50% tissue culture infectious dose [TCID50])로 정하였으며 이 희석농도의 역 로가리즘(inverse logarithm)으로 표시하였다. 

IL-1β, IL-6, IL-8 측정을 위한 ELISA 
   실험한 배양액을 수집하여 ELISA를 시행하였다. IL-1β, IL-6와 IL-8의 양은 ELISA kit(Biosource, Nivelles, Belgium)를 이용하여 분석하였다. 배양액을 100 μl씩 일차항체가 깔려있는 ELISA plate에 넣고 각각의 well에 항 IL-1β, 항 IL-6, 항 IL-8 conjugate를 50 μl씩 혼합한 후 horizontal shaker에서 700±100 rpm으로 흔들어 주었다. 그 후 세척 용액으로 3회 세척한 후 발색용액(tetrametylbenzidine in DMF)을 각 well 당 200 μl 넣고, 빛이 없는 상태에서 700±100 rpm으로 30분간 반응시켰다. 그 후 stop 용액(1.8N H2SO4)을 50 μl 넣고 자외선 분광 광도계(Molecular Devices, Menlo Park, CA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 

A549 세포에서 transepithelial resistance(TR)의 측정 
   A549 세포를 3 μm pore, 1.13 cm², 12-well plate (Transwell, Costar)에 well 당 2×10⁶ 씩 분주하고 10% F-12K를 넣고 배양하였다. Chopstick voltmeter(Millicell ERS；Millipore Product, Bedford, MA)를 이용하여 TR을 측정하였다(Fig. 2). 배양 24시간 후에 TR을 측정하고 배양액을 제거한 다음 여러 다른 농도의 에탄올(0%, 1%, 3%, 5%, 7.5%, 10%)에 60분간 처리한 후 다시 TR을 측정하였다(Fig. 1). 0% 에탄올이란 PBS 만을 넣어준 것을 말하며 각 에탄올 농도는 배양액에 적당량의 에탄올을 넣어 미리 만들어 놓은 에탄올 용액을 사용하였다.

통계처리 
   에탄올의 세포독성 측정을 위한 MTS 검사는 Kruskal-Wallis 비모수 검정을 이용하였고, 각 실험군에서 ICAM-1 평균형광강도(mean fluorescence intensity), cytokine 수준, RV-16 역가 및 TR의 차이는 Mann-Whitney U-test를 이용하여 비교하였으며 p<0.05를 유의수준으로 하였다.

결     과

A549 세포에 대한 에탄올의 세포독성 
   살아있는 세포에서만 선택적으로 나타나는 MTS 환원반응의 흡광도를 측정하였을 때 에탄올 농도가 11% 이하일 경우에는 의미있는 감소가 없이 유사한 수준으로 나타나 세포의 생활력(viability)에 이상이 없는 안정적인 상태를 유지하는 것으로 나타났다. 한편 13% 이상의 에탄올 농도에서는 흡광도가 크게 감소하여 고농도의 에탄올이 A549 세포에 대해 세포독성을 나타냄을 알 수 있다(Fig. 3). 

ICAM-1의 발현 
   ICAM-1에 대한 형광강도는 에탄올군과 에탄올+RV군에서 0% 에탄올 처리를 한 경우 각각 평균 10.18×10⁴ S/C units, 14.63×104 S/C units로 나타났다. 두 군 모두 에탄올 처리 농도가 1%, 3%, 5%인 경우에서 ICAM-1 발현이 0% 에탄올 처리 에탄올군과 비교하여 증가하였고 7.5%와 10%의 농도로 처리한 경우 발현의 증가 폭이 더욱 컸다. 그러나 에탄올 처리농도1%, 3%, 5% 간의 의미있는 증가는 보이지 않았다. 0% 에탄올 처리를 한 경우를 제외하고 에탄올군과 에탄올+RV군간의 의미있는 차이는 없었다(Fig. 4). 

에탄올+RV군에서 에탄올 처리에 따른 RV-16 역가 
   MRC-5 세포주의 배양을 이용한 바이러스 역가 검사에서 에탄올+RV군에서 0% 에탄올 처리를 한 경우 역가는 평균 10^1.86 TCID₅₀ U/ml 이었다. 3%, 5%, 7.5% 에탄올로 처리했을 때 역가는 각각 평균 10^2.43, 10^2.64, 10^2.93 TCID₅₀ U/ml로 에탄올 농도가 증가함에 따라 증가하였다. 10% 에탄올로 처리했을 시 역가는 10^2.07 TCID₅₀ U/ml로 오히려 감소하였다(Fig. 5).

IL-1β, IL-6, IL-8의 농도 
   IL-1β, IL-6, IL-8 농도는 RV 역가 변화와 비슷한 결과를 보였다. 에탄올군에 비하여 에탄올+RV군에서 이들 cytokine의 농도는 유의하게 높았으며 에탄올+RV군에서 에탄올 농도가 증가할수록 증가하는 소견을 보였다. 특히 3%, 5%, 7.5% 에탄올 농도에서 의미있게 증가하였고 10% 에탄올 농도에서는 오히려 감소하는 소견을 보여 RV 역가와 동일한 결과를 보였다(Table 1).

A549 세포에서 에탄올 처리에 따른 TR의 변화 
   에탄올 처리를 하기 전 A549 세포의 TR은 124-133 Ω·cm² 이었고 60분간 에탄올(0, 1, 3, 5, 7.5, 10%) 처리 후에 측정한 TR은 123-132 Ω·cm²로 에탄올에 의한 TR의 변화는 없었다(Fig. 6).

고     찰

   에탄올 섭취는 소화기관을 비롯한 여러 장기에 질병을 일으키고 면역활동의 변화를 가져오며 다양한 만성 질환을 초래하거나 악화시키는 것으로 알려져 있다. 최근 에탄올이 호흡기 과민반응(hypersensitivity), 알레르기 및 천식에 미치는 영향에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있으며 급성 폐질환(acute lung injury)의 원인이 된다는 보고도 있다.^11)12)13) 그러나 에탄올이 가장 흔한 급성 감염인 RV 감염에 미치는 영향에 대한 연구는 거의 이루어지지 않았다.
   고농도(>40%)의 에탄올은 위장관 상피세포에서 표면상피세포의 파열 및 박리를 일으켜 세포사 및 점막의 손상을 초래하나 저농도 비세포독성 용량의 에탄올은 상피세포 tight junction의 구조 및 기능에 가역적인 변화를 일으킨다고 알려져 있다.⁹⁾ 이러한 상피세포 방어벽의 변화가 기도상피세포에서도 일어난다면 Lopez-Souza 등⁸⁾이 주장한 바와 같이 RV 감염의 변화를 유발시킬 수 있을 것이다. 
   본 연구에서는 살아있는 세포에서만 선택적으로 일어나는 MTS 환원반응을 이용한 세포독성검사를 시행하였다. MTS의 tetrazolium 환은 살아있는 세포에서 존재하는 dehydrogenase enzyme에 의해 mitochondria inner membrane의 외측에서 formazan으로 환원된다. 이 색조 반응을 분광흡광도계로 측정할 수 있고 490 nm에서의 formazan의 흡광도는 살아있는 세포의 수와 비례하여 나타난다.¹⁵⁾ 이번 연구에서 A549 세포는 에탄올 농도가 11% 이하일 경우에는 세포의 생활력에 이상이 없는 상태를 유지함을 추정할 수 있었으나 13% 이상의 에탄올 농도에서는 흡광도가 크게 감소하여 고농도의 에탄올이 A549 세포에 대해 세포독성을 나타냄을 알 수 있었다. 이 결과를 그대로 기도상피세포에 적용할 수는 없다. 왜냐하면, 위장관의 경우 에탄올이 직접 상피세포에 작용하여 효과를 보이나 호흡기 점막에서는 혈중 농도의 증가에 의한 효과여서 아무리 농도가 높아도 0.1~0.2% 정도라고 추정할 수 있기 때문이다. 그러나 실험실적 조건에서 에탄올 농도가 높을 때 세포독성을 보일 수 있다는 것을 증명했다는데에 의미가 있을 것이다.
   저자는 에탄올 처리가 RV 감염을 증가시키는 기전을 ICAM-1 발현의 증가와 상피세포 장벽 tight junction의 손상에 의한 TR의 저하에 의할 것이라고 예상하였다. A549 세포에서의 에탄올 처리는 에탄올군과 에탄올+RV군 모두에서 ICAM-1의 발현을 증가시켰으나 RV 역가 상승과는 일치된 결과를 보이지는 않았다. 또한 같은 농도의 에탄올로 처리된 경우 발현된 ICAM-1은 에탄올군과 에탄올+RV군 간에 의미 있는 차이가 없었다. 
   두 가지 결과에서 에탄올에 의한 ICAM-1의 증가가 RV 감염을 증가시킨다는 것을 증명할 수 없었다. 또한 RV 감염이 추가적인 ICAM-1 증가를 가져온다는 것을 증명할 수 없었다.
   본 연구에서 ICAM-1 발현의 증가는 에탄올 처리에 의한 것으로 생각할 수 있으며 에탄올 처리 후 RV-16 감염이 ICAM-1 발현에 영향을 주는지 알 수 없었다. 기존의 위장관에서의 연구에서는 RV-16 감염에 의해 ICAM-1 발현이 증가하였다고 보고하고 있고⁷⁾ 기도상피세포에서도 ICAM-1이 RV 감염 후에 그 발현이 증가한다는 결과를 보인 연구도 있다.¹⁴⁾ 알코올 유발성 간질환의 병태생리에서 에탄올 섭취에 의해 NF-κB의 활성화 및 ICAM-1의 증가가 발생하는 것으로 보고된 바 있으나⁷⁾ 에탄올이 기도상피세포에 미치는 영향에 대한 연구는 없었으며 본 연구에서 처음으로 기도상피세포에서도 에탄올에 의해 ICAM-1 발현이 증가된다는 사실을 알 수 있었으나 RV 감염과 ICAM-1 발현과의 연관성은 알 수 없었다. 
   바이러스 역가는 에탄올 처리 농도가 증가할수록 역가가 증가하여 7.5% 농도에서 최대치를 나타냈고 10% 처리 농도에서는 오히려 감소하였다. 에탄올 처리 농도가 상승할수록 바이러스 역가가 증가하는 것은 바이러스의 증식과 발산이 증가함을 의미하며 비강 분비물에서 배출되는 바이러스의 양은 증상의 강도와 비례하므로 에탄올 처리가 초래하는 기도상피세포의 변화는 바이러스성 상기도염으로의 이환을 조장하고 그 증상도 더욱 심화시킬 것으로 추정된다. 10% 에탄올로 처리한 경우 RV 감염도 증가할 것으로 예상되지만 오히려 cytokine의 분비 및 바이러스 역가가 7.5% 농도로 처리한 경우보다 감소하였다. 이는 비록 MTS 세포독성검사에서 A549 세포가 11% 이하의 에탄올 농도에서는 안정한 것으로 나타났지만 세포독성검사의 경우에는 배양된 A549 세포의 수가 상대적으로 많아 세포의 밀도가 보다 조밀하였으며 따라서 상피세포 간 결합이 보다 성숙된 상태였을 것으로 생각되며 RV 역가 측정등에서는 10% 농도의 에탄올이 A549 세포에 대해 세포독성을 나타내었을 것으로 추정된다. 따라서 cytokine의 증가 및 바이러스 역가의 상승이 약화되었을 것이다.
   RV 감염 시 호흡상피세포에서는 IL-1β, IL-6, IL-8 등의 cytokine이 증가하는데 이들은 다양한 염증반응의 매개체가 되어 바이러스성 상기도염에서 나타나는 비폐색, 비루, 인후통 등의 주요 증상을 일으킨다. IL-1β는 중요한 proinflammatory cytokine으로 특히 ICAM-1 생성을 증가시키며 여러 염증반응을 조장한다.¹⁶⁾ IL-6와 IL-8은 호중구의 화학주성을 포함한 여러 생리현상을 일으켜 RV 감염 시 나타나는 병태생리에 중요한 역할을 한다.¹⁷⁾ 본 연구결과에서 이들 cytokine은 RV 감염과 유사한 증가 양상을 보여 RV 감염이 이들 cytokine 분비를 증가시켰다는 것을 알 수 있었다.
   Voltmeter로 측정한 TR은 대장 암종에서 유래한 Caco-2 세포의 경우⁹⁾와는 달리 에탄올 처리 후에도 의미 있는 변화를 보이지 않았다. 그러나 이번 연구에서와 같이 TR에 유의한 변화가 없다고 해서 상피세포의 투과성이나 물리적 방어막의 기능에 전혀 영향을 주지 않았다고 단정짓기는 힘들다. 본 연구에 사용된 전기생리학적인 개념인 TR은 상피세포층에 존재하는 여러 연접복합체 단백질과 이온통로 들의 기능적인 총합을 나타낼 뿐이며 각각의 단백질들의 미세한 기능을 완전하게 반영할 수 없음을 감안해야 한다.^18)19)20) 따라서 tight junction을 형성하는 여러 단백질 중 주된 역할을 하는 zonular occludens-1이나 세포간 결합을 매개하는 단백질인 E-cadherin 등의 분포와 생리적 기능의 변화등에 대한 추가적인 연구를 통하여야 에탄올이 상피세포층의 방어막기능에 주는 영향에 대한 확정적인 결론을 내릴 수 있을 것이다. 

결     론

   A549 세포에서 에탄올 처리는 RV-16 역가를 상승시키며 이에 따른 IL-1β, IL-6, IL-8의 분비를 증가시킨다. 에탄올은 ICAM-1 발현을 증가시키나 이는 RV-16 역가 상승과 일치하지는 않아 ICAM-1과 RV 감염간의 상관관계는 알 수 없었다. TR은 에탄올 처리 후에도 의미 있는 변화가 없어 RV-16역가 상승과 관련하여 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

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