교신저자：장용주, 135-736 서울 송파구 풍납2동 388-1  울산대학교 의과대학 서울아산병원 이비인후과학교실
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서     론

   바이러스에 의한 급성상기도염은 빈도가 매우 높은 질환으로 특히 이비인후과 영역에서는 중이염이나 부비동염의 합병증을 일으킨다는 점에서 임상적으로 중요한 영역이라 할 수 있다.¹⁾ 이러한 바이러스성 상기도염 환자에서 가장 흔히 발견되는 바이러스들에는 rhinovirus, corona virus, influenza virus, parainfluenza virus, adenovirus 등이 있으며, 이들 중 리노바이러스에 의한 감염이 50% 이상을 차지한다.²⁾ 리노바이러스는 그 지름이 30 nm인 RNA 바이러스로 picornavirus과에 속하며 비강과 비인강의 상피세포층에서 일차적인 감염을 일으켜 증상을 형성하는 생리학적 변화와 연속적인 염증반응을 촉발한다.³⁾ 기도상피세포층에서 리노바이러스 감염은 여러 생리학적 변화를 불러오는데 이들 중 특히 혈관투과성의 증가가 뚜렷하다. 혈관투과성은 감염 후 매우 빠르게 증가하여 바이러스 감염 3일째 최대에 이른다. 또한 리노바이러스 감염에서는 점액, 장액선의 과다분비가 나타나며 이로 인한 점액섬모수송의 저하가 나타난다.⁴⁾ 리노바이러스는 조직학적으로 상피세포를 파괴하지는 않지만⁵⁾ 섬모운동마비(ciliostasis)와 같은 기능장애를 일으키며, mucin과 plasma fibrinogen의 증가로 인한 진한 점액덩어리(mucous plug)를 만들며, 이 또한 점액섬모수송의 장애에 기여한다.⁶⁾ 리노바이러스 감염시 이비인후과적인 합병증의 형성에 큰 기여를 하는 요소인 점액섬모수송의 장애는 이상 설명된 생리학적 변화에 의하여 비롯되는 것으로 이해된다.
   기관점막상피세포층의 점액섬모청소능의 형성에는 이상 언급된 여러 요소들 이외에도 상피세포층의 이온 통로의 정상적인 기능 수행여부가 중요한 역할을 한다.⁷⁾ 이는 비강기도를 포함한 기관강 내의 수분은 상피세포를 통한 능동적인 이온수송에 의하여 조절되기 때문이다. 기도상피세포는 나트륨(Na+)이온을 흡수하고 클로라이드(Cl-) 이온을 분비하는 능력을 갖고 있다. 이러한 상피세포층의 이온 통로기능에 이상이 오면 상피세포를 통한 수분의 분비작용에 변화가 오고, 그에 따라 점막층의 부종성 변화, 점액섬모수송의 장애 등이 유발되어 점막의 정상적인 기능수행에 이상이 나타나게 되는 것이다.⁸⁾ 그러므로 비점막상피세포에 감염되어 비강점막에서 혈관투과성의 증가 등을 통한 점액섬모청소능의 이상을 일으키는 리노바이러스 감염은 상피세포층에서 이온통로의 기능에도 장애를 줄 수 있지 않을까 하는 의문의 제기가 가능하다.
   그러나 지금까지 리노바이러스 감염이 비점막 상피세포의 이온통로의 기능을 반영하는 전기생리학적인 특성에 미치는 영향에 대하여는 연구된 바가 없다. 그러므로 본 연구에서는 리노바이러스 감염시 나타나는 점액섬모수송능의 저하의 기전에 대한 이해를 넓히고자, 리노바이러스 감염이 상피세포층의 전기생리학적인 기능에 어떠한 영향을 주는가를 연구함으로써 간접적으로 상피세포 이온통로에 미치는 리노바이러스 감염의 역할을 규명하고자 하였다. 그러한 연구목적의 수행을 위해 본 연구에서는 transepithelial resistance와 short circuit current라는 개념을 이용하였다. Transepithelial resistance는 상피세포층의 tight junction의 형성 정도를 반영하므로 상피세포층의 방어막 기능과 구조적 통합성을 나타내는 지표로의 의의를 갖는다. short circuit current는 상피세포층을 통한 능동적인 이온수송의 지표로 사용될 수 있는 전기생리학적인 개념으로, 전반적인 조직의 대사 정도와 활력도를 나타낸다.⁹⁾ 이러한 short circuit current는 상피세포층에서 작용하는 이온들의 능동수송의 총합을 표현하며 이것의 형성에는 특히 상피세포층을 통한 Na⁺의 능동적인 흡수, Cl^-의 능동적인 배출이 중요한 역할을 하고 있다.¹⁰⁾ 그러므로 본 연구에서는 배양된 기관상피세포에서 실험적으로 이루어진 리노바이러스-16에 의한 감염 후에 transepithelial resistance와 short circuit current의 어떠한 변화가 나타나는가를 연구하여, 리노바이러스 감염에 의하여 나타나는 기도상피세포의 전기생리학적인 변화를 파악하고자 하였다.

재료 및 방법

방  법
   사체로부터 얻어진 사람의 기관상피세포를 air-liquid interface 방법으로 배양하여 합류를 이룬다. 합류에 도달한 세포를 두 군으로 나누어 한 군은 대조군으로(n=10), 나머지 군은 리노바이러스-16 passage 5 감염군(n=10)으로 정한다. 그리고 각 실험군에서 transepithelial resistance, short circuit current, 및 바이러스 역가(viral titer)를 비교분석한다.

기관상피세포의 배양
   배양은 공저자가 발표했던 방법대로 했으며 그 방법은 다음과 같다.¹¹⁾ 사체로부터 얻어진 기관상피점막을 protease에 담가 4°C에서 10~16시간 처리한다. 일정시간 경과 후 점막을 작은 조각으로 자르고 원심분리하여 분리된 세포들을 human placental collagen(15 μg/cm²)를 도포한 0.4 μm의 크기를 갖는 구멍이 있는 filter support(Corning star；Cambridge, MA)에 10⁶ cells/cm²의 농도를 넣는다. 세포는 air-liquid interface 방법으로 합류에 이르도록 하였고 일반적인 세포배양에서와 같이 5% CO₂, 37°C에서 배양되었다. 배양액은 DMEM/F12에 2% Ultroser G serum을 섞고 penicillin(10⁵ U/L), streptomycin(100 mg/L), gentamicin(50 mg/ml), amphotericin B(2.5 mg/L)의 항생제가 추가된 성분으로 구성되었다. 세포는 분주 후 3~5일에 합류에 도달되었으며, 세포배양액이 측기저부로부터 점막면으로 소통되지 않는 것으로부터 합류 여부를 쉽게 판단할 수 있었다. 합류가 이루어진 후에는 배양용기의 측기저부에만 배양액을 공급하였다. 세포배양액은 2~3일에 한 번씩 교환하였고, 세포는 분주 후 8~12일에 실험에 이용되었다.

배양된 상피세포에 대한 리노바이러스의 감염
   실험에 이용된 바이러스는 감기환자로부터 얻어진 리노바이러스-16, passage 5였고 이것은 Schnurr 박사의 연구소(Richmond, CA)에서 제공된 것이었다. 바이러스 감염을 위해 합류를 이룬 기관상피세포에서 세포의 측기저부 배양액을 제거하고 0.4 ml의 2% Ultroser G serum 이 포함된 DMEM/Ham’s F-12 배양액으로 교환한다. 다음에는 100 μl 의 Eagle's MEM with Ham's F-12(E-H) 배양액에 섞인 바이러스를 10⁵ TCID50/ml의 양으로 세포의 점막표면에 점적하여 고루 퍼지게 한다. 실험대조군에서는 동일한 양의 E-H 배양액만 점적한다. 이러한 상태로 33°C 조건에서 60분 배양한 후, 점막표면의 바이러스 함유액을 제거하고 0.5 ml의 신선한 배양액으로 2회에 걸쳐 세척한다. 그 후에 세포들은 2% Ultroser G serum substitute, penicillin(10⁵ U/L), streptomycin(100 mg/L), gentamicin(50 mg/ml), amphotericin B(2.5 mg/L)가 첨가된 DMEM/Ham’s F-12 배양액에서 33°C 조건으로 48시간 배양된다.
   측기저부의 배양액은 48시간 후에 제거하고 점막면은 무균처리 된 인산완충용액으로 세척하여 바이러스 역가를 측정하기 위하여 보관한다.

Transepithelial resistance의 측정
   Chopstick voltmeter를 이용하여 측정한다. 이 chopstick voltmeter는 voltmeter/current passer에 연결된 두 개의 전극으로 구성된다. 전극은 에탄올에 담그어 소독하며, 사용 직전에 무균처리 된 인산완충용액에서 보정을 한다. 측정시에는 200 μl의 sterile PBS를 점막면에 위치시키고 두 개의 전극을 점막면과 측기저부에 놓은 상태에서 transepithelial potential difference(Vt)를 측정한다. 그 후 current pulses를 적용시키면 Vt 변화로부터 transepithelial resistance의 계산이 가능하다. 이 transepithelial resistance는 바이러스 감염 전과 감염 48시간 후에 2회 측정하여 virus 감염 전후의 수치가 비교되었다.

Ussing chamber를 이용한 short circuit current의 측정
   세포배양이 이루어진 막을 원형으로 잘 잘라낸 후에 ussing chamber에 위치시킨다. Ussing chamber를 이용한 측정은 바이러스 감염 48시간 후 chopstick voltmeter로 transepithelial resistance를 측정한 이후에 행해진다. Short circuit current는 Krebs-Henselelt solution에서 측정되는데 K-H 용액의 구성은 118 NaCl, 5.9 KCI, 2.5 CaCl₂, 1.2 MgSO₄, 1.2 NaH₂PO₄, 25.5 NaHCO₃, 및 5.6 glucose으로 이루어진 것이다. K-H 용액은 37°C로 유지되었고 95% O₂-5% CO₂(pH 7.4)의 혼합가스가 지속적으로 공급되는 가운데 측정이 행해졌다. 

바이러스 역가의 측정
   우선 96 well 세포배양용기에 human fetal diploid lung(HFDL) cells을 분주하여 합류를 이루도록 한다. 그 후 10배씩 차례로 희석된 바이러스를 함유한 시료 50 μl를 150 μl 의 E-H media에 혼합하여 각각 특정 농도별로 4개로 만들어 배양용기에 분주한다. 세포배양용기는 7일 동안 33°C에서 배양하며 1주 후에 도립현미경 하에서 세포변성효과(cytopathic effect)의 발생여부를 판별한다. 이러한 과정으로 한 농도에서 50% 이상의 HFDL 세포에서 세포변성효과를 보이는 희석배수를 결정하여 TCID 50을 결정한다.

결     과

   대조군에서는 E-H 배양액을 48시간 처리하기 전의 transepithelial resistance는 평균 943 Ω.cm² 이었고 48시간 배양 후의 Rte는 703 Ω.cm²으로 평균 변화량은 240 Ω.cm²이었다. HRV-16 감염군에서는 감염 전 927 Ω.cm², 48시간 후에는 664 Ω.cm²였으며 그 변화량은 263 Ω.cm²이었다. 이상의 결과는 실험군과 대조군에서 감염 전후의 transepithelial resistance가 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았음을 나타낸다(Table 1).
   Ussing chamber를 이용한 short circuit 측정에서는 rhinovirus passage-5, 대조군 모두에서 baseline short circuit current의 유의한 차이를 보이지 않았다. 대조군에서의 baseline short circuit current는 6.3 μEq.cm^-2.h^-1, 감염군에서는 7.2 μEq.cm^-2.h^-1 이었다. Sodium 통로차단제인 amiloride를 투여하면 Isc의 저하가 나타나고 그것의 평균 감소량은 대조군에서 4.5 μEq.cm^-2.h^-1, 감염군에서는 5.3 μEq.cm^-2.h^-1 이었다. Foskolin을 투여하면 상피층 chloride 통로의 활동이 상승되어 Isc의 증가가 나타나며 그 변화량은 대조군에서 18.2 μEq.cm^-2.h^-1, 감염군에서 17.6 μEq.cm^-2.h^-1 이었다. 두 실험군에서 baseline short circuit current 뿐만 아니라 amiloride와 foskolin에 의한 변화량에는 통계적으로 유의한 차이가 없었다(Table 2).
   이상과 같은 전기생리학적인 변화가 의의를 갖기 위해서는 감염군에서는 실제적인 바이러스 감염이 발생되었고 대조군에서는 감염이 일어나지 않았음이 확인되어야 한다. 감염 여부의 판단은 배양 48시간 후에 얻어진 상층액과 측기저부 배양액에 대한 바이러스 역가의 측정을 통해 가능해진다. 대조군 배양액의 상층액과 측기저부액 모두에서는 바이러스 역가가 <10^1.05로 확인되어 리노바이러스에 의한 감염이 없었음을 확인할 수 있었다. 감염군에서는 측기저부 배양액에서는 유의한 역가의 검출이 불가능하였고, 점막면 세척액에서는 10^3.1 TCID 50의 바이러스 역가가 검출되어 상피세포층에서 바이러스의 감염이 있었고 그에 따라 바이러스의 방출이 있었음을 알 수 있었다(Table 3).

고     찰

   상피세포층을 통한 이온수송은 전기를 발생시켜 transepithelial potential difference(Vte)를 형성하고 이 때 Ussing’s short-circuit current technique는 Vte를 구성하는 이온수송과정을 반영할 수 있다.¹²⁾ 이러한 Ussing의 기법에서는 상피세포층 양쪽에 연결된 외부의 회로를 이용해 Vte를 0으로 만든다. 이 회로에서 형성된 전류를 short circuit current라고 하고 이것은 상피층을 통하여 움직이는 모든 능동적 이온수송의 합과 같다.¹³⁾ 이러한 short circuit current를 형성하는 이온수송과정은 특정한 이온수송의 차단제를 이용하여 간접적으로 측정하든지 방사선 동위원소 추적자 ²²Na, ³⁶Cl, ⁴²K를 이용하여 구할 수 있다.¹⁰⁾ 대부분의 기도상피층에서는 능동적인 Na⁺의 흡수와 능동적인 Cl^-의 분비, 또는 두 과정의 조합이 Isc의 대부분을 형성하며, 다른 이온들의 능동수송과정은 상대적으로 미미한 역할을 담당함을 나타낸다. Cl^-의 능동수송은 기관강을 전기적으로 음전위를 띠게 하여 tight junction을 통한 기관강으로의 Na⁺의 수동적인 이동을 유도한다. 이러한 점막면으로의 염기의 이동은 삼투압 구배를 형성하여 점막면으로 수분을 이동시킨다. 반대로 Na⁺의 능동적인 흡수는 기관강에서 수분의 흡수를 유발한다. 이러한 상피세포층을 통한 이온수송과 관계된 수분의 이동은 섬모주변의 sol 층의 두께, 그리고 점액성분의 gel의 조성에 변화를 불러일으켜 점액섬모청소능의 효율성에 영향을 주게 된다.¹⁰⁾ 리노바이러스 감염은 호흡기도상피층에서 점액섬모수송능의 저하를 불러오며 이로 인하여 부비동염이나 중이염이 속발하게 된다.¹⁴⁾ 이상과 같이 호흡기 점막의 점액섬모청소능의 형성에 상피세포의 이온통로의 정상적인 기능수행이 중요한 역할을 하고 있음에 비추어 리노바이러스에 의한 감염에 의하여 이온수송에 어떠한 변화가 나타날 것인가에 대한 의문은 자연스럽게 형성될 수 있다. 그러나 지금까지 리노바이러스에 의한 상피세포의 전기생리학적 변화에 대하여서는 국내외적으로 연구된 바가 없었다.
   이러한 배경에서 실시된 본 연구결과 배양된 기관상피세포에서 리노바이러스 감염은 대조군에 비해서 transepithelial resistance와 short circuit current에 유의한 변화를 일으키지 않았다. 이는 리노바이러스 감염에서 혈관투과성이나 점막하선에서의 분비가 증가되는 등의 생리적인 변화가 나타나지만, 상피세포층 자체의 투과성이나 이온통로들의 기능에는 아주 뚜렷한 영향을 주지 않을 수 있음을 나타내는 결과이다. 물론 transepithelial resistance나 short circuit current가 각각의 Na⁺ 통로나 Cl^- 통로의 기능적 변화를 완전하게 반영할 수 없음을 감안한다면 그러한 결론은 매우 조심스럽게 내려져야 할 것이다. 그러나 이러한 결과는 상피세포층에서 리노바이러스 감염이 발생될 때 매우 제한된 수의 세포에서만 감염이 일어나고,¹⁵⁾ 조직학적 연구에서도 세포 간의 폐쇄소대(tight junction) 등의 구조에 영향을 줄 정도로 심한 변화가 나타나지 않는다는 기존의 연구결과를 참고한다면 설명 가능한 현상이다.⁵⁾ 이러한 본 연구의 결과는 리노바이러스 감염에서 나타나는 점액섬모청소능의 장애의 형성에 있어 상피세포층의 이온통로들의 기능이상은 중요한 역할을 수행하지 않을 것이라는 결론을 가능하게 한다. 그러나 상피세포층에 존재하는 여러 이온통로들의 기능적인 총합을 나타내는 short circuit current에서 유의한 변화가 없다고 해도 CFTR, ENaC 등 상피세포층에 존재하는 여러 이온통로 들의 각각의 발현 증감 여부는 각 이온통로단백질의 mRNA 수준, 단백질 수준에서의 발현정도에 대한 연구 등을 추가적으로 실시하여야 구체적인 결론의 도출이 가능하게 될 것이다.
   본 연구의 실험모델은 배양된 기관상피세포였다. 그러나 실제 임상에서 리노바이러스 감염은 비인강과 비강점막에서 가장 뚜렷하므로¹⁶⁾ 실제적인 임상상황을 정확히 반영하기 위하여서는 배양된 비강점막상피세포에서 리노바이러스 감염의 효과를 연구하는 것이 바람직할 것이다. 그러므로 본 연구결과의 의의가 더욱 뚜렷해지기 위해서는 비강점막상피세포에서의 실험실적 연구, 또는 실제 감기 환자에서 nasal potential difference와 같은 in vivo적인 전기생리학적인 방법론을 이용한 추시 또한 필요하리라 생각된다.

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