교신저자：권순영, 425-707 경기도 안산시 단원구 고잔1동 516  고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   갑상선암은 전체 암 중에서 약 1~1.5%를 차지하는 드문 질환이지만 내분비계에서는 가장 흔한 암이며, 조직학적으로는 유두상 암종, 여포상 암종, 수질성 암종, 역형성 암종 등 크게 4가지로 구분된다.¹⁾²⁾
   갑상선암의 진단을 위하여 현재 초음파촬영, 신티그래피와 세침흡인세포학검사 등이 수술 전에 시행되는데, 이들 검사 중 세침흡인세포학검사가 가장 중요한 역할을 하며 이를 이용하여 유두상 암종, 역형성 암종, 수질성 암종의 진단이 어느 정도 가능하다.¹⁾ 그러나 여포상 암종의 진단은 불가능한 것으로 알려져 있으며, 그 이유는 여포상 암종과 여포상 선종의 감별에 필요한 피막이나 혈관의 침습여부확인이 세침흡인세포학검사에서는 가능하지 않기 때문이다.¹⁾³⁾ 또한 갑상선암은 종류에 따라서 많은 변이가 존재하여 수술 후의 조직학적진단 시에도 어려움이 있으며, 유두상 암종의 여포상 변이(follicular variant of papillary carcinoma)는 그 흔한 예이다.¹⁾²⁾ 그러므로 갑상선질환의 진단에 도움이 되는 종양 표지자를 찾기 위한 많은 연구들이 있어왔고, 그 중 galectin-3가 양성종양과 악성종양을 구별하는데 유용하다는 보고가 여러 차례 있었다.^{2)3)4)5)6)7)8)} Galectin-3는 31 Kda의 분자량을 갖는 β-galactoside binding protein계열의 하나로 세포성장, 세포유착, 발암성 형질전환, 전이, 세포고사(apoptosis) 등에 관여한다고 알려져 있다.^3)9)10)
   본 연구에서는 갑상선종양에서 galectin-3의 면역조직화학적검사를 시행하여 종양별 차이를 검토하고, 이것이 갑상선종양의 진단 및 갑상선암의 조직학적 분류에 도움이 되는지 밝히고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   1998년 1월부터 2003년 3월까지 고려대학교병원 이비인후-두경부외과에서 갑상선종양으로 수술 받은 환자 중 파라핀에 포매 된 갑상선 조직의 사용이 가능한 57예를 대상으로 하였다. 수술 후에 보고된 조직학적 진단을 종양분류의 기준으로 하였고, 각각 유두상 암종 19예, 여포상 암종 8예, 수질성 암종 1예, 역형성 암종 1예, 여포상 선종 16예, 결절성과형성 12예였다.
   성별은 남자 14예, 여자 43예이었고, 수술당시 연령분포는 21세에서 79세로 평균 45.8세이었다. 갑상선암은 모두 29예로 이들의 병기는 American Joint Committee on Cancer(2002)의 분류에 따라 재분류 하였다. 원발병소의 분류는 T1 6예, T2 12예, T3 11예이었고, 경부 림프절의 분류는 N0 25예, N1 3예, N2 1예였으며, 원격전이는 없었고, 임상적 병기는 stage I 19예, stage II 4예, stage III 5예, stage IV 1예이었다.

방  법

면역조직화학적 염색
   면역조직화학적 염색을 위해 10% 중성 포르말린에 고정한 후 파라핀에 포매한 조직을 4 μm 두께로 박절하여 양전하를 띤 슬라이드(Probe On Microscope Slides, FisherBiotech, U.S.A.)에 부착시키고 60℃의 항온기에서 한시간 가온한 뒤 xylene으로 5분간 탈 파라핀을 3회 반복 시행한 후 순차적으로 낮은 농도의 알코올로 함수 시킨 다음 증류수로 수세하였다. 내인성 과산화효소의 활성을 억제 시키기 위해 3% 과산화수소수를 사용하여 10분간 처리한 후 증류수와 Tris 완충용액(Tris 3.025 g. 1 M NaCl 40 g. 1 M HCl 22 ml in H2O 5 ℓ, pH 7.4)에 세척하였다. 항원회복을 위해 압력솥에 citrate 완충용액(sodium citrate 14.7 g. 1 M HCl 27 ml in H2O 5 ℓ, pH 6.0)에 넣고 가열하여 끓기 시작할 때 슬라이드를 넣고, 압력이 최고(103 kpa)에 도달한 후 2분간 더 끓인 다음, 찬물에 담가 압력을 낮춘 후 슬라이드를 꺼내 Tris 완충용액에 담갔다. Galectin-3에 대한 1차 monoclonal antibody(Novocastra laboratory antibody)를 dilution reagent solusion(Zymed, U.S.A)에 1：100으로 희석하여 100 μl씩 처리하고 1시간 동안 반응시켰다. 일차항체 반응 후 Tris 완충용액으로 수세하여 1차항체를 제거하고, LSAB 2 system peroxidase(DAKO, Carpinteria, U.S.A)를 이용하여 2차항체 biotinylated link anti-mouse and anti-rabbit immunoglobulin을 가하고 30분간 반응시켰다. 슬라이드를 다시 Tris 완충용액에 세척한 후 과산화효소가 결합된 streptavidin-HRP를 이용하여 실온에서 30분간 반응시키고 Tris 완충용액으로 10분간 수세하였다. 발색제인 3-amino-9-ethylcarbazole(AEC)를 떨어뜨려서 2~3분 정도 반응시킨 후 증류수에 씻어 Mayer`s hematoxylin으로 5분간 대조염색하고, 탈수과정을 거쳐 봉입하였다. 양성 대조군으로는 역형성 대세포 림프종 조직을 사용하였고, 음성 대조군에서는 일차항체 대신 생리식염수를 이용하여 동일한 방법으로 염색하였다.

결과 판독
   염색결과 판독은 병리전문의에 의하여 과거의 조직병리학적, 임상적 정보 없이 시행되었으며, 광학현미경 시야에서 종양세포의 세포질이 갈색으로 염색될 때 양성으로 판독하였다. 또한 양성으로 판독된 표본에 해당하는 hematoxylin-eosin 염색 표본을 검토하여 종양세포의 분포를 재확인하였다. 이후 면역조직화학적 염색에서 염색된 부분이 종양세포가 차지한 부분의 몇 %를 차지하는가에 따라 galectin-3의 발현정도를 정하였다. 염색이 되지 않았을 경우는 -, 염색된 부분이 종양세포의 10% 미만일 경우는 +/-, 10%부터 50%까지는 1+, 50%를 초과할 경우는 2+로 표시하였다.

통계학적 분석
   양성종양과 악성종양에서 두 그룹간 galectin-3발현정도의 차이 및 임상적 조직학적 요소별 galectin-3발현정도의 차이를 Fisher's exact test로 비교하였으며, p값이 0.05 이하인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.

결     과

종양별 면역조직화학적 염색 결과
   연구대상 57예 중 면역조직화학적 염색에 음성반응을 보이는 예는 없었으며, 염색의 발현정도는 +/-부터 2+까지 다양하게 관찰되었고, 종양별로 발현정도의 분포에 어느 정도 차이가 있었다(Table 1).
   유두상 암종은 19예 중 2+가 17예, 1+가 2예로 모든 종양 중 가장 높은 galectin-3 발현을 보였다. 유두상 암종의 면역조직화학적 염색은 종양 세포들 거의 대부분이 염색되는 형태로 나타났으며, galectin-3가 세포질 내에서 고르게 발현되는 것으로 관찰되었다(Fig. 1A). 여포상 암종은 8예 중 7예에서 1+나 2+의 높은 galectin-3 발현을 보였으며, 1예에서만 +/-의 약한 반응을 보였다(Fig. 1B). 특히, 여포상 암종은 galectin-3가 종양세포의 세포질 내에 고르게 분포되는 형태였으나 종양세포의 피막 또는 혈관침습부위에서는 galectin-3 발현이 상대적으로 강하게 나타났다. 수질성 암종 1예와 역형성 암종 1예는 각각 2+의 높은 발현정도를 보였으며 galectin-3가 세포질 내에서 고르게 관찰되었다. 여포상 선종은 16예 중 +/-가 5예, 1+가 8예, 2+가 3예로 다양한 발현정도를 보였으며(Fig. 1C), 결절성과형성은 12예 중 8예에서 +/-의 낮은 발현정도를 보였다(Fig. 1D). 여포상 선종과 결절성과형성에서는 galectin-3가 발현되지 않는 세포가 상대적으로 많이 관찰되었다.
   Galectin-3발현정도를 양성종양인 여포상 선종과 악성종양의 두 그룹으로 나누어 Fisher's exact test로 비교하였을 때 p<0.001로 통계적으로 유의하게 악성종양에서 발현정도가 높았다. 여포상 암종과 여포상 선종의 galectin-3발현정도의 비교에서는 p=0.7729로 발현정도에 차이가 없었다. 유두상 암종과 여포상 암종의 비교, 유두상 암종과 여포상 선종의 비교, 유두상 암종과 결절성과형성과의 비교에서는 모두 p<0.05로 통계적으로 유의하게 유두상 암종의 galectin-3발현정도가 높았다(Table 2).

임상적 및 조직학적 특징과 Galectin-3 발현과의 연관성
   유두상 암종 19예에서 예후에 영향을 미치는 피막외 침습 유무, 종양의 크기, 경부 림프절전이유무, 원격전이유무, 병기별로 그룹을 나누어 galectin-3발현의 차이를 비교하였으나, 통계적으로 유의한 차이는 없었다(Table 3).
   여포상 암종 8예를 AMES 점수의 조직학적 특징인 minimally invasive type과 widely invasive type의 구분을 포함하여 TNM 체계별로 galectin-3발현정도를 비교하였으나, 통계적으로 유의한 차이는 없었다(Table 4).

고     찰

   지금까지 갑상선의 양성종양과 악성종양을 구분하기 위하여 수많은 종양표지자들이 연구되어 왔으며, 최근 galectin-3가 양성종양과 악성종양을 구별하는데 유용하다는 보고가 있다.^{2)3)4)5)6)7)8)} Galectin-3의 종양발생 및 전이과정에서의 정확한 역할은 아직 밝혀지지 않았지만, 이미 역형성 대세포 림프종, 유방암, 직장암, 흑색종, 갑상선암에서 galectin-3의 발현이 보고되었다.⁶⁾¹⁰⁾ Galectin-3는 β-galactoside binding protein으로 두개의 functional domain을 가지고 있는데 그 중 하나인 C-terminus는 carbohydrate binding domain이고, 다른 하나인 N-terminus는 9개 아미노산서열의 일렬 반복 구조이다.^1)10)11) Galectin-3는 단량체(monomer)로 발견되지만 당질리간드(carbohydrate ligand)에 결합되었을 때는 세포 형질막에 있는 glycoprotein counter receptor의 교차결합을 매개할 수 있다. 그리고 이를 통하여 세포표면 당질(glycoprotein)의 재조직 또는 결합을 유발하고 신호전달개시를 일으키며 이런 과정을 통하여 세포의 유착, 세포의 성장, 세포고사의 유발 또는 억제를 조절한다고 알려져 있다.^1)3)10)12)
   본 연구의 결과 전예에서 면역조직화학적 염색에 +/-이상의 양성반응을 보였고, 그 중 유두상 암종은 다른 종양과 달리 매우 높은 발현정도를 나타내었다. 그리고 표본수가 적은 역형성 암종과 수질성 암종을 제외한 다른 종양의 galectin-3의 발현정도는 다양한 분포를 보였다(Table 1). 양성종양과 악성종양의 두 그룹간 비교에서 galectin-3의 발현정도는 통계적으로 유의하게 악성종양에서 높았으며, 유두상 암종이 여포상 암종보다 높았다(Table 2). 이것은 갑상선종양에서 galectin-3의 발현이 악성종양에서 강하고 양성종양 및 정상조직에서는 약하거나 발현되지 않아, galectin-3가 갑상선암의 진단에 유용하다는 대부분의 다른 연구결과와 일치한다.^{1)2)3)4)6)9)13)}
   본 연구에서 관찰한 여포상 암종의 galectin-3의 발현은 종양의 피막 또는 혈관침습부위에서 상대적으로 강하게 나타났으며, 이는 이미 알려진 galectin-3의 세포간 유착기능이나 세포-세포외기질간 유착기능에 부합되며, Beesley 등²⁾과 Saggiorato 등¹⁴⁾의 연구결과와도 일치한다.
   Galectin-3가 여포상 암종과 여포상 선종의 감별진단시의 유용성에 대해서는 연구자들마다 차이가 있다.^4)5)8)14) Martins 등¹⁵⁾은 galectin-3는 양성종양에서도 발현되고, 특히 여포상 선종과 여포상 암종에서 galectin-3의 발현에 유의한 차이가 없다고 하였다.¹⁶⁾ 본 연구도 이와 동일한 결과를 얻었으며, 이는 galectin-3를 갑상선암의 종양자표지자로 이용 시 주의해야 할 사항으로 사료된다.
   Cvejic 등¹⁶⁾과 Orlandi 등¹⁷⁾은 여포상 선종에서 galectin-3가 발현되는 기전으로 하나의 가설을 제시하였다. 일부 여포상 선종에서는 전형적인 악성종양의 특징인 이형성세포병소를 가지는데 이것에 의해 galectin-3가 발현된다는 가설이다.^4)16)17)18) 이에 따르면 galectin-3 양성인 여포상 선종 중 일부는 암으로의 전환 단계일 가능성이 있으며, 여포상 선종에서 galectin-3의 발현이 전환단계의 암을 표시할 수 있다는 것을 의미한다. 본 연구의 여포상 선종 16예에서는 galectin-3가 발현된 부위와 이형성세포병소로 판단되는 부위가 모두 일치하지는 않았다. 그러나 이 결과는 앞으로의 연구에서 더 확인할 필요가 있으며, 양성종양에서 galectin-3가 발현되는 기전 중 하나일 가능성을 암시한다고 사료된다.
   Fernandez 등¹⁹⁾과 Coli 등⁴⁾은 이형성세포병소가 없는 갑상선조직에서 염증부위의 여포세포가 강한 galectin-3 발현을 보인다는 것을 관찰하고, 이는 염증세포가 분비한 시토카인(cytokine)의 영향으로 galectin-3가 새로 생성되거나 여포세포주위로 침윤된 림프구의 영향으로 galectin-3의 투과성이 증대된다고 하였다. 본 연구의 결절성과형성에서도 림프구침윤이 동반된 염증부위의 galectin-3발현이 상대적으로 강하게 관찰되는 것을 확인할 수 있는 경우도 있었으나, 그렇지않은 경우도 많아 이들의 주장과는 차이가 있었다.

결     론

   갑상선종양에서 galectin-3의 면역조직화학적 염색결과 galectin-3는 유두상 암종의 종양 표지자 역학을 할 수 있으나, 여포상 암종과 여포상 선종의 감별에는 도움이 되지 않는다고 판단된다.

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