교신저자：이병주, 602-739 부산광역시 서구 아미동 1가  부산대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   하인두암은 여러 두경부암 중 예후가 매우 불량한 암으로 알려져 있다. 이러한 하인두암은 수술, 항암화학요법, 방사선 조사 등을 단독 또는 병용하여 치료한다. 진행성 하인두암과 후두암의 수술시에는 필수적으로 발성장애와 연하장애 등의 기능적인 문제가 발생하므로 기능을 보존하기 위해 최근에는 cisplatin과 5-fluorouracil(5-FU)를 이용한 항암화학요법 후 방사선 조사를 시행한다.¹⁾²⁾ 
   Cisplatin은 하인두암을 포함한 두경부암에서 주로 사용되는 항암제이다.³⁾⁴⁾ Cisplatin은 백금 화합물로서 세포내로 이동하여 DNA base 내의 guanine과 adenine의 N-7번 위치에 결합하여 alkyl항암제와 유사한 DNA chain의 crosslinking을 초래하여 DNA의 구조의 변화와 비정상적인 염기짝을 형성하여 항암제의 약리학적 작용을 가진다. 이러한 항암제는 골수 억제, 신장장애, 신경손상, 구토, 오심, 식욕부진 등의 많은 부작용이 있다. 또한 cisplatin은 난소암, 고환암, 방광암, 식도암, 폐암 등 여러 다른 암에서도 널리 사용되고 있는 약제이다.⁵⁾
   기존에 많이 사용되어 왔던 5-FU와 cisplatin을 이용한 선행항암화학요법은 생존율을 향상시키지는 못하는 것으로 알려져 있어 진행성 두경부암의 치료에 있어서 새로운 치료약제가 절실히 요구되고 있다.⁶⁾⁷⁾ 그리하여 최근에는 docetaxel과 cisplatin 병합항암화학요법이 사용되고 있다.⁸⁾ Docetaxel은 paclitaxel과 같은 taxane 계열의 항암제로써 European Yew(Taxus baccata)의 잎에서 추출한 성분인 10-deacetylbaccatin-III으로부터 반합성한 항암제이다. Toxane 계열의 항암제는 tubulin polymerization을 향상시켜 안정화된 microbulules을 형성한다. 안정화된 tubulin은 여러 가지 생리적인 반응에 저항하며 세포내에서 축적되게 되고 이러한 일련의 반응에 의해 세포는 죽게 된다. Docetaxel의 구조는 paclitaxel와 거의 유사하며 또한 작용기전도 같이 tubulin에 작용한다.
   5-FU나 docetaxel과 병합요법으로 많이 사용되는 cisplatin의 가장 큰 문제점 중의 하나는 내성 암세포의 출현이다. Hamaguchi 등⁹⁾은 cisplatin 내성 난소암 세포주에서 adriamycin와 mitoxantrone에 비해 paclitaxel이 가장 교차내성이 적다고 하였다. 그러나 Pu 등¹⁰⁾은 cisplatin에 내성이 있는 방광암 세포주에서 paclitaxel에 대한 교차내성이 있다고 보고하였다. 두경부암에서 cisplatin에 대한 내성 세포주에 대한 연구는 일부 있으나¹¹⁾¹²⁾ 최근에 많이 사용하고 있는 docetaxel과의 교차내성에 대한 연구는 없다. 이에 저자들은 하인두암세포주(PNUH-12)과 후두암세포주(SNU 899)에서 반복적인 cisplatin 노출에 의해 cisplatin에 내성을 보이는 세포주를 확립하고 docetaxel과 5-FU에 대한 교차내성에 대해 연구하고자 한다. 

방     법

대  상 
   부산대학교 병원에서 확립한 하인두암세포주 PNUH-12¹³⁾와 한국세포주은행에서 구입한 후두암세포주 SNU-899¹⁴⁾를 사용하였다. 두경부암종에서 항암치료로 사용되고 있는 cisplatin(Dong-A Pharmaceutical Co., Seoul), 5-fluorouracil(Choongwae Pharmaceutical Co., Seoul), docetaxel(Aventis Pharmaceutical Co., Seoul)를 사용하였다. 

Cisplatin 내성 세포주의 확립
   PNUH-12는 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Gibco BRL) 배지에 10%의 fetal bovine serum(FBS, Gibco BRL), 100 units/ml penicilin과 100 μg/ml streptomycin(Gibco BRL)를 첨가하여 37℃, 5% CO₂가 공급되는 배양기에서 배양하였다. 배양된 세포는 2~3일에 한번씩 배지를 교환하였으며 세포가 90%의 합류를 이루면 Dulbecco's phosphate buffered saline(DPBS, Gibco BRL)로 세척한 후 0.05% trypsin-0.02% EDTA로 부착된 세포를 분리하여 계대배양하여 실험에 사용하였다. Cisplatin은 처음에는 0.2 μg/ml을 배지에 첨가하였고 계속하여 배양하여 첨가된 cisplatin에 대한 영향이 미미한 것으로 생각되면 점차 고농도로 하여 최고 1.2 μg/ml 까지 증량시켰다. 각각의 세포주에서 cisplatin 내성 세포주인 PNUH-12 R1과 SNU 899 R1을 확립하였다.

형태학적 관찰
   Cisplatin에 내성을 보이는 세포주와 원래 세포주 사이의 형태학적 변화를 위상차 현미경을 이용하여 관찰하였다.

성장 곡선
   PNUH-12(0.5×10⁴)와 SNU-899(1×10⁴)을 96-well plate에 세포를 심고 24시간 동안 배양하였다. 24시간 간격으로 6~7일 동안 MTT cytotoxic assay 방법을 이용하여 세포의 수와 활성도를 측정하여 성장곡선을 구하였다. 

세포독성검사(MTT cytotoxic assay)
   배양된 암세포들을 96 well plate에 well당 1×10⁴개 세포를 심고 하루 동안 배양 후 cisplatin과 docetaxel를 농도별로 첨가하고 37℃, 5% CO₂ 대기에서 48시간 배양 후 MTT측정법을 시행하였다.
   10 mg의 MTT 시약(3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium bromide；Sigma, St.Louis, MO)을 PBS 1 ml에 녹인 후 0.2 um의 syringer filter로 걸러 DMEM 배지로 10배 희석하여 사용하였다. 상층의 배지를 제거한 다음 MTT 용액을 100 ul씩 첨가하여 37℃에서 4시간 반응시킨 다음 상층을 제거한 후 DMSO(dimethyl sulfoxide；Sigma, St.Louis, MO)를 100 μl 넣어 실온에서 10분간 흔들어 ELISA 분석기로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. MTT측정법을 3회 시행하여 평균값을 구하였으며 항암제를 처리한 후 48시간 후 50%의 성장억제를 보이는 농도를 IC₅₀로 하였다. 
   약물에 대한 상대적 내성의 정도는 다음의 공식에 의해 비교하였다.

   약제 내성=   IC₅₀ resistant cell line
   약제 내성= --------------
   약제 내성=    IC₅₀ parent cell line

결     과

형태학적 관찰
   Cisplatin에 내성이 있는 PNUH-12 R1과 SNU 899 R1은 원래의 모세포와 위상차 현미경하에서는 형태학적으로 차이는 없었다.

성장 곡선
   Cisplatin에 내성이 있는 PNUH-12 R1과 SNU 899 R1은 원래의 모세포에 비해 성장이 늦었다(Fig. 1).

Cisplatin에 대한 내성
   Cisplatin에 내성이 있는 PNUH-12 R1는 PNUH-12을 비교하였을 때 cisplatin에 2.0배의 내성이 있었다(Table 1 and 2, Fig. 2). Cisplatin에 내성이 있는 SNU 899 R1는 SNU 899을 비교하였을 때 cisplatin에 3.5배의 내성이 있었다(Table 1 and 2, Fig. 3).

Docetaxel와 5-FU에 대한 교차 내성
   PNUH-12 R1은 PNUH-12에 비해 Docetaxel에 대해서는 3.8배의 내성이 있었고, 5-Fu에 대해서는 1.4배의 내성이 있었다(Table 1 and 2, Fig. 2). SNU 899 R1은 SNU 899에 비해 docetaxel에 대해서는 6.7배의 내성이 있었고, 5-FU에 대해서는 15배의 내성이 있었다(Table 1 and 2, Fig. 3). 

고     찰

   두경부암의 치료는 방사선 조사와 수술이 기본적인 치료 방법이나 이러한 치료는 많은 부작용이 있을 수 있다. 원격전이를 감소시키거나 기능을 보전하기 위해 항암화학요법이 많이 사용되고 있다. Cisplatin은 두경부암을 포함하여 많은 고형암에 효과가 있으나, 부작용으로 신장독성, 신경독성, 심한 구토, 이독성 등이 있다. 종양이 cisplatin에 반응을 잘하여도 다시 재발하는 경우가 있고, 이러한 경우에는 반복되는 cisplatin치료에 반응을 하지 않는다. 항암제의 효과를 극대화하기 위해서는 내성기전의 정확한 이해와 교차내성에 대한 연구가 필요하다.
   Cisplatin에 대한 내성에 대한 정확한 기전에 대해서는 아직 많은 논란이 있다. Cisplatin에 내성을 가지는 기전은 몇 가지로 제시되고 있다. 1. 항암제의 세포내의 농도의 감소 등 같은 보호 또는 해독기전(protective and detoxification mechanism), 2. glutathione과 metallothioneins 등의 thiols 물질의 세포내 증가, 3. DNA에 접근하는 항암제의 감소에 의한 DNA cross-linking의 감소, 4. 손상된 DNA의 치유능력의 증가 등이다.¹⁵⁾
   Cisplatin에 대한 내성이 수십배 이상 되는 세포주를 확립할 수도 있으나 임상에서 관찰되는 항암제의 내성은 대개 3~6배 정도로 보고하고 있다.¹⁶⁾¹⁷⁾ Cisplatin 항암화학요법 후 재발한 암이나 cisplatin에 내성을 보이는 암에서 최근 taxane 계열의 항암제를 난소암, 고환암, 두경부암 등에서 사용하고 있다. 이에 저자들은 cisplatin에 2배와 3.5배의 내성을 가지는 세포주를 확립하였으며, 이는 형태학적으로 모세포와는 차이가 없었고, 모세포에 비해 성장속도는 늦었다. 
   Cisplatin 내성 세포주에 대한 여러 가지 항암제에 대한 교차내성에 대한 연구가 있다. Kelland 등¹⁸⁾은 난소암에서 cisplatin과 carboplatin에 대한 반응성은 세포마다 다양하여 그 차이가 약 71배까지 차이가 있으나 paclitaxel과 docetaxel에 대한 반응성의 차이는 적어서 각각 5.6배와 2.2배였다고 하였다. 또한 cisplatin에 내성이 있는 세포주에서 paclitaxel과 docetaxel에 대한 교차내성은 없다고 하였다.¹⁸⁾ Hamaguchi 등⁹⁾은 cisplatin에 내성이 있는 난소암에서 여러가지 항암제에 대한 교차내성의 비교에서 adriamycin, mitoxantrome, melphalan, etoposide에 비해 paclitaxel이 가장 교차내성이 적다고 하였다. 그러나 Pu 등¹⁰⁾은 cisplatin에 내성이 있는 방광암 세포주에서는 paclitaxel에 대해 교차내성이 심했으나, 오히려 paclitaxel에 대해 내성이 있는 방광암 세포주에서는 cisplatin에 대해 교차내성이 없다고 하여 상반된 결과를 보고하였다. 
   Mese 등¹¹⁾은 구강암 세포주에서 유래한 cisplatin에 3.1배와 2.7배 내성이 있는 세포주A431/CDDP1과 A431/CDDP2에서 carboplatin에 교차내성이 있었으나 adriamycin과 5-FU에 대해서는 교차내성이 없었다고 하였다. 그리고 내성이 생기는 기전은 세포내에 cisplatin의 농도의 감소와 연관성이 있는 것으로 보고하였다. 그러나 Beketic-Oreskovic 등¹²⁾은 후두암 세포주(HEp2)에서 cisplatin을 지속적으로 노출시킨 경우와 급작스럽게 노출시킨 경우 두가지로 cisplatin 내성 세포주을 확립하였다. Cisplatin를 지속적으로 노출시켜서 내성이 확립된 세포주에서는 5-FU에 대해 교차내성이 있었으나, 급작스럽게 cisplatin에 노출시켜서 내성이 확립된 세포주에서는 5-FU에 대해 교차내성이 없었음을 보고하며, 항암제의 종류도 중요하지만 노출되는 방법에 따라서도 교차내성의 정도가 다르다고 하였다.¹²⁾ 본 연구에서 확립된 PNUH-12 R1과 SNU 899 R1는 cisplatin의 반복적인 노출에 의해 형성된 세포주로서 모두 docetaxel에 대한 교차내성이 확인되었으나 5-FU에 대한 교차내성은 PNUH-12 R1에서는 미미하였으나 SNU 899 R1에서 교차내성이 cisplatin 내성보다 강하였다. 이러한 결과는 5-FU에 대한 내성은 노출 방법에 따라 차이가 난다는 Beketic-Oreskovic 등¹²⁾의 연구와는 다른 결과이다. 
   Lee 등⁸⁾은 두경부암 환자에서 cisplatin과 docetaxel을 이용한 항암화학요법의 결과를 보고하였는데, 국소 진행성 두경부암 환자 21명 중 15명(71%)에서 완전반응, 4명(19%)에서 부분반응을 보여 국소 진행성 환자에서 반응율은 90%이었다고 하였다. 그러나 cisplatin과 5-FU 항암요법 후 재발성 두경부암 환자 11명에서 cisplatin과 docetaxel을 이용한 항암화학요법을 시행하였을 때 1명(9%)에서 완전반응, 2명(18%)에서 부분반응을 보여 전이성과 재발성 환자의 반응율은 27%로 매우 불량하다고 하였다.⁸⁾ 본 연구의 in vitro의 결과와 이러한 임상결과을 비교하여 볼 때 두경부암에서 cisplatin에 내성이 있는 암세포는 docetaxel에도 교차내성이 있는 것으로 생각되었다.

결     론

   Cisplatin에 내성이 있는 하인두암세포주 PNUH-12 R1과 후두암세포주 SNU 899 R1을 확립하였다. PNUH-12 R1은 docetaxel에 대한 교차내성이 있었으나 5-FU에 대해서는 교차 내성이 없었다. 그러나 SNU 899 R1은 docetaxel과 5-FU 모두에 대해 강한 교차내성을 보였다. Cisplatin에 내성이 있는 세포에서 docetaxel과 5-FU에 대한 교차내성의 정도가 다르므로 이에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각되었다. 

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