교신저자：윤주헌, 120-749 서울 서대문구 신촌동 134  연세대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   코점막 상피는 점액의 대부분을 능동적으로 분비하며, 분비된 점액이 코안에서 분비되는 분비물질의 전해질 구성요소를 결정하게 된다. 코점막의 과다한 점액분비는 비염, 부비동염 등 다양한 코질환 및 부비동질환과 밀접한 관계가 있으며, 주로 분비촉진제와 염증매개물의 자극에 의해 점액이 분비된다.¹⁾
   분비촉진제는 분비성 유전자가 활성화되기 이전 분비의 초기단계에 세포 내에서 장액성 및 점액성 분비물의 분비를 자극하게 된다. 이러한 분비촉진제의 대표적인 예로는 세포외 triphosphate nucleotide를 들 수 있다. 세포외 퓨린(아데노신, ADP, ATP)과 피리미딘(UDP, UTP)은 세포표면의 수용체인 퓨린성 수용체를 통해 다양한 생리적인 반응을 조절하며 이온 수송,²⁾³⁾⁴⁾ 수분 수송,²⁾³⁾ 섬모운동,²⁾³⁾ 및 점액분비⁵⁾⁶⁾에 autocrine 및 paracrine 효과를 나타낸다. 따라서 염증이 있는 코점막 상피세포에서는 퓨린성 수용체가 분비 초기 단계에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.
   현재까지 아홉개의 G protein-coupled(P1, P2Y) 그리고 여덟개의 ligand-gated 퓨린성 수용체가 확인되었다.⁷⁾⁸⁾ ATP와 UTP는 세포표면의 ion-gated(P2X)와 G-protein-coupled(P2Y) 수용체와 상호 작용하여 세포의 여러 과정들을 조절한다. ATP는 P2Y2 및 P2Y11 수용체에 효과적인 촉진제인 반면 UTP는 P2Y2 및 P2Y4 수용체를 활성화시킨다.⁹⁾ 어떤 P2Y 수용체들은 주로 nucleoside diphosphate에 의해서 활성화된다. 예를 들어 P2Y1 수용체는 ADP에, P2Y6 수용체는 UDP에 의해 활성화된다.⁹⁾
   지금까지 다양한 세포와 조직에서 발현된 P2 수용체에 대한 연구가 활발하게 시도되고 있어, 악하선 선세포¹⁰⁾ 및 췌장도관세포¹¹⁾에서 퓨린성 수용체의 발현에 대한 보고는 있으나 코점막 상피세포에서의 발현은 매우 미흡한 실정이다.¹²⁾ 또한 기존에 보고된 내용들도 약리학적 접근법에 의하여 촉진물질 및 억제물질의 상대적 효능만을 측정하였기 때문에 기도내 P2 수용체의 특성은 아직 완전하게 밝혀지지 않았다.
   그러므로 본 연구의 목적은 첫째, RT-PCR과 Western blot을 이용하여 정상 사람 코점막 상피세포(normal human nasal epithelial cells)에 발현되는 P2X 및 P2Y 수용체의 mRNA 및 단백을 확인하고, 두 번째, 정상 사람 코점막 상피 세포에서 여러 촉진제 및 억제제를 이용하여 어느 P2X 및 P2Y 수용체가 기능적으로 활성화 되어있는 지를 알고자 하였다.

재료 및 방법

화학물질 및 용액 
   Fura-2-AM은 Molecular Probes(Eugene, OR, USA)에서 구입하였고, Pyridoxal phosphate-6-azophenyl-2´과 4´-disulfonic acid(PPADS)은 Tocris Cooksom (Bristol, UK)에서 구입하였다. ATP, UTP, UDP, 2-methylthioadenosine 5´-triphosphate(2MeS-ATP), 2´-and 3´-O-(4-benzoylbenzoyl)-ATP(BzATP), α, β-methylene-ATP(α, β-Me ATP) 및 caffeine을 포함한 다른 모든 화학물질은 Sigma에서 구입하였다. 관내강막과 기저외측막에 사용된 표준 관류용액은 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 10 mM D-Glucose, 그리고 10 mM HEPES(pH 7.4 with NaOH)을 함유한다.

세포배양 및 시료준비
   정상 사람 코점막 상피세포의 계대배양은 이전의 방법을 그대로 이용하였다.¹³⁾ 5.0×10⁴개의 Passage-2 정상 사람 코점막 상피 세포를 0.45-μm 직경의 pore를 가진 Transwell-clear culture insert(Costar Co, Cambridge, Mass, USA) 위에 배양하였다. 이 세포들을 합류를 이룰 때까지 배양하여 극성을 갖는 단층의 정상 사람 코점막 상피 세포로 만든 후에 현미경과 연결된 miniature Ussing chamber에 올려놓은 후 Fura-2 단독 또는 촉진제를 처치한 후 세포내의 칼슘치를 측정하였다.

Reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)
   P2X 수용체의 subtype인 P2X1, P2X2, P2X3, P2X4, P2X6, P2X7, P2XM과 P2Y 수용체의 subtype인 P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Y11, P2Y12의 유무를 확인하기 위하여 RT-PCR을 시행하였다. 각 gene product mRNA에 대한 oligonucleotide primer를 기존에 보고 된 염기서열에 근거하여 Gene Runner software version 3.00을 이용하여 제작하였으며 beta-2 microglobulin에 대한 335 bp PCR fragment를 형성하는 oligonucleotide amplimer는 Clontech Laboratories로부터 구입하여 사용하였고, Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler를 이용하였다. 총 RNA (1 g per 20 L reaction volume)를 random hexanucleotide primer와 Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase를 이용하여 역전사시켜 complementary DNA(cDNA)를 만들었다. PCR products는 50 ng/ml ethidium bromide를 함유하는 2% Seakem agarose gel(FMC, Rockland, ME, USA)에서 전기영동으로 분리하여 폴라로이드 55 필림으로 사진을 찍었다. 증폭된 산물의 genomic DNA contamination 여부를 검증하기 위하여 RT 반응에서 reverse transcriptase를 제외시킨 후 증폭되는 산물이 없음을 확인하였다. 또한 증폭된 P2 수용체에 대한 검증을 위하여 Gibco사의 dsDNA Cycle Sequencing System(GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD, USA)으로 sequencing을 병행하였다. PCR에서 사용된 P2X와 P2Y 수용체에 대한 magnesium chloride의 최적농도는 1.5 mmol/L이었다. 양성 대조군으로 P2X3와 P2X4 수용체는 human embryogenic kidney 293 세포를 사용하였고, P2XM 수용체는 골격근 세포, 그리고 P2Y12 수용체는 인간 혈소판 세포(human platelet cell)를 사용하였으며, 나머지 수용체는 정상 사람 뇌세포를 각각 이용하였다. 본 실험에 사용된 퓨린성 수용체에 대한 oligonucleotide primer와 PCR 반응조건은 Table 1과 2에 나열하였다.

세포내 칼슘[Ca²⁺] 측정
   단층의 세포군에서 세포내 칼슘치([Ca²⁺]i)를 측정하는 방법은 이미 과거에 보고된 방법을 변형하여 시행하였다.¹⁴⁾¹⁵⁾ 배양된 세포가 합류를 이룬 후에, 세포를 3 M Fura-2-AM을 함유한 배양액에 넣고 37℃에서 30분간 추가 배양하였다. Fura-2와 함께 배양된 정상 사람 코점막 상피 세포를 Zeiss Axiovert 35 현미경에 연결된 miniature Ussing chamber(AKI Institute, U. of Copenhagen, Denmark)에 올려놓고 측정하였다. Miniature Ussing chamber는 관내강막(위쪽)과 기저외측막(아래쪽)을 위한 light-absorbing polyacetal로 만든 두개의 half-chambers로 이루어져 있다. 이 두개의 half-chamber 사이에 단층의 정상 사람 코점막 상피 세포를 올바르게 위치시킨 다음 두개의 half-chamber를 밀착시킨 후 효과적으로 밀봉하여 위쪽의 관내강막과 아래쪽의 기저외측막을 분리하였다. 각각의 half-chamber에는 용액의 inlet과 outlet port를 가지고 있어 이를 통하여 촉진제 및 억제제를 함유한 용액을 통과시켰다. 기저외측막이 위치한 곳은 dental sticking wax(model Deiberit-502；Ludwig Bohme)을 이용하여 glass coverslip을 고정시키고 관내강막이 위치한 곳은 대기에 노출시켰다. 준비된 outlet과 inlet을 통하여 실험에 필요한 용액을 통과시키면서 Fura-2 fluorescence ratio 측정기(PTI Delta Ram, Photon Technology International, NJ, USA)로 세포내 칼슘의 변화를 상피세포의 중심점에서 기록하였다. Fura-2의 fluorescence 측정은 350 nm와 380nm에서 측정하여 결과는 350/380 fluorescence ratio로 표시하였다.

P2Y2와 P2Y6 수용체에 대한 Immunoblot 분석
   정상 사람 코점막 상피 세포들을 2x sample buffer[250 mM Tris-Cl(pH 6.5), 2% SDS, 4% -mercaptoethanol, 0.02% BPB, 10% glycerol]를 이용하여 용해시킨 후 동일한 양을 추출해 10% SDS-PAGE로 분리하고 polyvinylidene difluoride(PVDF；Millipore, Bedford, MA)막으로 transfer하였다. 이 막을 Tris-buffered saline[TBS, 50 mM Tris-Cl(pH 7.5), 150 mM NaCl]에 5% 탈지우유를 첨가한 용액에서 2시간동안 반응시켜 비특이적 반응을 억제하였다. 이 blot을 일차항체(P2Y2, P2Y6, 1：500, Alomone Labs, Jerusalem, Israel)로 하룻밤동안 반응시켰다. 항체를 제조할 때 사용하는 pre-immune 항원으로 대조 실험을 시행하여 일차항체의 특이성을 확인하였다. Blot을 TTBS(0.5% Tween 20 in TBS)로 세척한 후 anti-goat 이차항체(1：2000, Vector Lab., Burlingame, CA)에 상온에서 45분간 반응시키고 ECL(enhanced chemiluminescence) system(Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ)으로 발광시켜 필름에 현상하였다. 위와 같은 실험을 세 차례 반복하였고 모두 동일한 결과를 얻을 수 있었다.

결     과

RT-PCR에 의한 P2 receptor mRNA의 발현
   본 연구에서는 먼저 정상 사람 코점막 상피 세포에서는 어떤 P2X 및 P2Y 수용체의 mRNA transcript가 발현되는지 알아보았다. Fig. 1A에서와 같이 P2X 수용체의 7가지 subtype 중 P2X3, P2X4 그리고 P2X7 수용체의 mRNA만이 발현됨을 알 수 있었다(Fig. 1A). 또한, P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Y11 그리고 P2Y12 수용체의 mRNA 역시 정상 사람 코점막 상피 세포에서 발견되었다(Fig. 1B). 그러나 정상 사람 코점막 상피 세포에서 발현되는 이런 모든 P2 수용체의 mRNA가 세포내 칼슘 반응과 관련하여 기능적으로 의미가 있는지는 아직 알지 못한다.

코점막 상피세포에서 P2X 및 P2Y 수용체의 존재 여부
   P2 수용체의 촉진제인 ATP를 세 가지 다른 농도로 사용하여 P2 수용체가 정상 사람 코점막 상피 세포막의 관내강막(luminal membrane)에 존재하는지 아니면 기저외측막(basolateral membrane)에 존재하는지를 알아보았다. ATP를 관내강막이나 기저외측막에 주입하였을 때 두 경우 모두 비슷한 정도의 세포내 칼슘 증가를 초래하였다(Fig. 2A and B). 그러나 낮은 농도(1 M과 10 M)로 ATP를 주입하였을 때는 관내강막에 주입한 경우가 기저외측막에 주입한 경우보다 세포내 칼슘치가 약간 더 높게 증가함을 알 수 있었다.
   다음으로, 수용체에 대한 기능적 길항제를 이용하여 P2X와 P2Y 수용체가 세포막의 어느 면에 위치하는지를 알아보았다. Inositol 1,4,5-trisphosphate(IP3) 수용체를 억제함으로서 metabotropic P2Y 수용체의 세포내 칼슘 반응을 억제하는 것으로 알려진 40 mM 카페인을 이용하여 세포를 전처치한 경우 관내강막 혹은 기저외측막으로 ATP를 주입하였을 때 나타나는 세포내 칼슘 수치의 반응 정도는 급격히 감소하는 것을 볼 수 있었다(Fig. 2C and D). Ionotropic P2X 수용체의 비특이적 길항제인 10 M PPADS로 세포를 전처치한 경우에는 관내강막 혹은 기저외측막으로의 ATP 주입에 의한 세포내 칼슘치의 반응 정도에는 변화가 없었다(Fig. 2E and F). 이러한 결과를 볼 때 정상 사람 코점막 상피 세포의 관내강막 그리고 기저외측막에는 기능적으로 활성화된 상태의 P2Y 수용체는 존재하지만 P2X 수용체는 존재하지 않음을 알 수 있었다.

[Ca²⁺]i 반응을 일으키지 않는 촉진제
   기능적인 P2X와 P2Y1 수용체의 역할을 알아보기 위하여 정상 사람 코점막 상피 세포의 관내강막과 기저외측막에 존재하는 P2 수용체에 선택적으로 작용하는 촉진제를 사용하였다. 흥미롭게도 αβ-Me ATP(Fig. 3A and B)나 2MeS-ATP(Fig. 3C and D)를 정상 사람 코점막 상피세포에 적용하였을 때 이에 의한 세포내 칼슘 반응은 전혀 나타나지 않았다. αβ-Me ATP와 2MeS-ATP는 정상 사람 코점막 상피 세포에서 RT-PCR 분석에 의해 밝혀진 P2 수용체 중에서 P2X3, P2X4 그리고 P2Y1 수용체를 활성화 시킬 수 있다.⁸⁾

P2Y 수용체 촉진제의 효과
   P2Y 수용체가 활성화 되면 세포내 칼슘 유입이 증가하게 되므로 P2Y 수용체 촉진제가 세포내 칼슘 수치에 미치는 영향을 측정함으로써 P2Y 수용체의 존재여부와 세포내에서의 위치를 부분적으로나마 파악할 수 있다. 본 연구에서는 정상 사람 코점막 상피세포의 관내강막과 기저외측막에서 UTP (P2Y2, P2Y4, P2Y6 촉진제)¹⁶⁾와 UDP(P2Y6 촉진제)¹⁶⁾에 대한 반응을 분석하였다. 세포의 관내강막이나 기저외측막을 UTP로 처치하였을 때 세포내 칼슘 농도는 ATP로 자극하였을 때와 비슷한 정도로 증가하였다(Fig. 4A and B). 그러나 UDP(10 M)로 기저외측막을 자극하였을 때는 세포내 칼슘치의 증가가 관찰되지 않은 반면(Fig. 4B), 관내강막을 같은 농도의 UDP로 자극하였을 때는 정상 사람 코점막 상피세포에서 세포내 칼슘치가 현저히 증가함을 관찰할 수 있었다(Fig. 4A).
   다음으로, P2X7과 P2Y11 수용체를 활성화시킬 수 있는 100 M의 BzATP¹⁷⁾에 대한 반응을 정상 사람 코점막 상피세포의 관내강막과 기저외측막에서 살펴보았다. 관내강막에서는 BzATP를 투여하였을 때 세포내 칼슘치가 증가하는 반면, 기저외측막에서는 이러한 반응이 나타나지 않았다(Fig. 4C). 뿐만 아니라, 카페인으로 전처치하게 되면 BzATP에 의해 유발되는 세포내 칼슘치의 반응이 80%나 감소하는 점(Fig. 4D) 등으로 미루어볼 때, P2X7 수용체가 아닌 P2Y11 수용체에 의해 BzATP 유발 반응이 나타나는 것을 알 수 있다.

정상 사람 코점막 상피 세포에서 P2 수용체에 대한 Immunoblot 분석
   기능적으로 활성화된 퓨린성 수용체의 존재 여부를 알아보기 위하여 P2Y2 와 P2Y6 수용체에서 유도된 단백의 존재 여부를 Western blotting으로 분석하였다(Fig. 5). P2Y2 수용체의 경우, 추론되는 단백질 크기와 일치하는 35 kDa 정도의 밴드를 관찰할 수 있었다. 또한, 이전 연구에서 발표되었듯이,^18)19)20) P2Y2의 immunoblot에서는 55와 120 kDa의 추가적인 밴드들이 발견되었다. 최근 보고에서는 P2Y2 수용체에서 여러개의 밴드가 나타나는 것에 대한 설명으로 단백질의 전사후 조절(posttranscriptional modification), 수용체의 oligomerization이나 다른 단백질과의 heteromer 형성 등을 제시하였다.¹⁸⁾ P2Y6의 immunoblot시 이전의 보고에서처럼¹⁸⁾ P2Y6의 추론되는 크기와 일치하는 약 42 kDa에서의 뚜렷한 밴드와 약 68 kDa 주위에서의 희미한 밴드가 관찰되었다. 여기서, P2Y2와 P2Y6의 immunoblots에 대한 특이성은 항체를 만드는 데 사용한 펩티드 항원(peptide antigens)을 사용하여 확인하였다(Fig. 5, right columns).

고     찰

   점액 분비는 세포내 칼슘치와 밀접한 관련이 있다.^21)22)23) 분비 촉진제는 일반적으로 자극 후 5분에서 10분 이내에 이미 형성되어 있는 분비성 과립(granules)들의 세포외 방출(exocytosis)을 유도하게 된다.²¹⁾ 하지만, 염증 매개물에 의해 새롭게 합성되는 분비성 과립들의 세포외 방출을 위해서는 최소한 8시간에서 12시간이 소요된다.²²⁾ 이와 같이, 분비 형태는 두 가지로 존재한다고 볼 수 있다. 분비 촉진제는 분비의 초기 단계를, 그리고 염증 매개물은 분비의 후기 단계를 각각 유발하게 된다. 세포내 칼슘 관련 신호는 상피의 수분, 이온 분비와 더불어 점액 분비의 조절과 관련이 있으므로²³⁾ 본 연구에서는 강력한 분비 자극물질인 퓨린성 수용체 촉진제가 세포내 칼슘치에 어떠한 효과를 미치는지에 대하여 살펴보고자 하였다. 예를 들어, 최근 저자들은 퓨린성 자극이 정상 사람 코점막 상피 세포의 기저외측막에 존재하는 Na⁺-K⁺-2Cl^- cotransporter를 활성화시킴으로서 Cl^-에 의해 유발되는 수분 분비에 기여한다는 사실을 증명한 바 있다.²⁴⁾
   본 연구에서는 우선 RT-PCR을 이용하여 정상 사람 코점막 상피 세포에서 P2 수용체 subtype의 발현 형태를 분석하였다. 췌장 도관세포,¹¹⁾ 사람의 각질세포(keratinocyte),²⁵⁾ 그리고 쥐 수정체의 상피세포²⁶⁾ 등과 같은 여러 상피 세포에는 다양한 종류의 P2 수용체 subtype이 발현되어 있음이 이미 밝혀져 있다. 또한, 1HAEo-, 16HBE14o- 그리고 A549 세포와 같은 호흡 상피세포에서 기원하는 세포주(cell lines)에서는 P2Y2, P2Y4, P2Y6 수용체의 mRNA는 발현되나 P2Y1나 P2Y11 수용체의 mRNA는 발현되지 않음이 보고되어 있다.²⁷⁾ 이러한 결과는 P2 수용체의 발현 형태가 다른 장기의 상피세포 간에 차이가 있으며 심지어 상부와 하부 기도의 상피세포 사이에도 차이가 있을 수 있음을 시사한다.
   초기에는 P2 수용체의 발현 양상을 RT-PCR을 이용하여 연구하였으나 이 방법은 몇 가지 중요한 한계점을 가지고 있다. RT-PCR 방법으로는 양적인 결과를 얻을 수 없으며 세포내에서 중요한 역할을 하지 않는 매우 미미한 양의 신호조차도 감지될 수 있다. 이러한 이유로 인하여, 기능적으로 활성화되어 있는 P2 수용체의 발현 양상과 그들의 세포막에서의 위치를 파악하기 위해서 세포내 칼슘치를 측정하였다. 결과를 보면, P2 수용체는 정상 사람 코점막 상피 세포의 관내강막과 기저외측막에 모두 존재하는 것으로 나타났다. 이와 더불어, 카페인이 관내강막과 기저외측막에 모두에서 ATP의 작용을 억제하는 것을 관찰함으로서 P2Y 수용체가 기능적으로 활성화된 것이라는 것을 알 수 있었다. 그러나 본 연구에서는 PPADS가 ATP에 의해 유발되는 세포내 칼슘치의 증가를 억제하지 못하는 것으로 나타나, RT-PCR에서는 P2X3, P2X4, P2X7 수용체의 mRNA가 측정되었지만 실제로 정상 사람 코점막 상피세포의 관내강막과 기저외측막에는 기능적으로 활성화된 P2X 수용체가 존재하지 않음을 알 수 있었다. 이 점으로 미루어 보아 기능이 있는 P2X 수용체가 정상 사람 코점막 상피 세포에 아예 존재하지 않던지 아니면 적어도 세포내 칼슘치의 증가와 관련하여서는 그 역할이 극히 미약함을 알 수 있었다.
   본 연구에서는 또한 정상 사람 코점막 상피 세포의 관내강막과 기저외측막에서의 다양한 퓨린성 촉진제의 작용에 대하여 알아보았다(Fig. 3). 정상 사람 코점막 상피세포에서 P2Y 수용체가 기능을 하는지를 측정하는데 있어서의 난점은 대부분의 P2 수용체 촉진제가 다양한 P2Y 수용체와 교차 반응이 있다는 데서 시작된다. 하지만, P2Y1 수용체는 2MeS-ATP의 자극에 대해 상당히 민감하며 이 촉진제는 세포내 칼슘치를 증가시키는 효능이 높다.²⁷⁾ 10 M 2MeS-ATP로 세포를 처치한 후 관내강막과 기저외측막에 2MeS-ATP를 주입한 경우 모두 세포내 칼슘치에는 변화가 나타나지 않았다(Fig. 3B). 이러한 결과로 볼 때 P2Y1 수용체가 정상 사람 코점막 상피세포에서는 기능적으로 활성화되어 있지 않음을 알 수 있었다.
   세포내 칼슘치는 관내강막에 ATP, UTP 및 UDP를 주입하였을 때 상당한 증가를 나타냈다(Fig. 4A). 그러나 동일한 세 가지 촉진제를 기저외측막에 주입하였을 때는 ATP와 UTP에 대하여는 세포내 칼슘치가 증가되었지만 UDP에 대해서는 반응이 나타나지 않았다(Fig. 4B). ATP는 P2Y2와 P2Y11 수용체의 효과적인 촉진제이고, UTP는 P2Y2와 P2Y4 수용체, 그리고 UDP는 P2Y6 수용체의 촉진제이다.⁹⁾²⁸⁾ 일반적으로, P2Y4 수용체는 ATP보다 UTP에 대하여 훨씬 더 민감하게 반응한다.²⁸⁾ 세포내 칼슘치 증가의 효능을 측정하는 실험을 하였을 때, UTP(관내강막 2.8±1.2 μM, 기저외측막 19±4 μM)과 ATP(관내강막 2.3±0.9 μM, 기저외측막 23±5 μM)의 ED 50 사이에는 의미 있는 차이를 보이지 않았다. 관내강막과 기저외측막에서 ATP와 UTP가 동일한 효능을 보인다는 것은 정상 사람 코점막 상피 세포에서 P2Y4 수용체가 P2Y 수용체 중 핵심적 역할을 하는 수용체가 아니라는 것을 나타낸다. UDP는 관내강막에서만 칼슘 신호를 유발하므로 P2Y6 수용체가 정상 사람 코점막 상피 세포의 관내강막에만 발현된다고 할 수 있겠다. 그러므로 위의 결과를 볼 때, 정상 사람 코점막 상피 세포의 관내강측에는 P2Y2와 P2Y6 수용체가 모두 존재하지만 기저외측에는 P2Y2 수용체만이 존재함을 알 수 있다. 또한, 특이 항체와 억제 펩티드(blocking peptides)를 사용한 immunoblotting을 통해 정상 사람 코점막 상피 세포에서 P2Y2와 P2Y6 수용체의 단백의 발현을 확인하였다(Fig. 5).
   마지막으로, 저자들은 100 μM 농도에서 P2Y11 수용체의 선택적인 촉진제로 작용하는 BzATP를²⁹⁾ 정상 사람 코점막 상피 세포의 관내강막과 기저외측막에 주입하였을 때 나타나는 반응을 분석함으로서 P2Y11 수용체의 존재 여부를 알아보고자 하였다. 세포내 칼슘치는 관내강막에 BzATP를 자극하였을 때만 증가하였고 기저외측막에 대해서는 반응이 없었다(Fig. 4C). 관내강막으로의 BzATP의 자극에 의한 작용은 세포가 카페인으로 전처치 된 경우 성공적으로 억제되었으며 이로 인해 P2X7 활성화의 가능성을 배제할 수 있었다(Fig. 4D). 따라서 P2Y11 수용체가 정상 사람 코점막 상피 세포에서 관내강막에만 존재하고 기능함을 알 수 있었다. 
   이상을 요약해 보면, 기능적으로 활성화된 P2Y2, P2Y6 그리고 P2Y11 수용체가 정상 사람 코점막 상피 세포의 관내강막에 존재하고 P2Y2 수용체는 기저외측막에도 존재하며 이러한 수용체들은 점액과 수분 분비의 조절에 중요한 역할을 할 것으로 추정된다. 또한, 정상 사람 코점막 상피세포에는 의미있는 세포내 칼슘 신호를 유발할 만큼 기능적으로 활성화된 P2X 수용체가 존재하지 않는 것으로 생각된다. 앞으로의 연구에서 P2 수용체의 각각의 subtype에 특이적인 촉진제 및 억제제를 사용한다면 정상 사람 코점막 상피세포에서의 분비 기전에 있어서 각각의 P2 수용체가 갖는 정확한 역할에 대하여 밝혀낼 수 있을 것이다.

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