| Secretory Differentiation of Serially Passaged Normal Human Nasal Epithelial (NHNE) Cells. |
| Joo Heon Yoon, Kyung Su Kim, Sung Shik Kim, Sung Min Lee, Joo Hwan Lee, Jeung Gweon Lee |
| Department of Otorhinolaryngology, Yonsei University College of Medicine, Seoul, Korea. jhyoon@yumc.yonsei.ac.kr |
| 계대배양된 코점막 상피세포에서 분비상피세포로의 분화 |
| 윤주헌 · 김경수 · 김성식 · 이성민 · 이주환 · 이정권 |
| 연세대학교 의과대학 이비인후과학교실 |
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| 주제어:
인체 코점막 상피세포ㆍ계대배양ㆍ점액ㆍ리소자임ㆍ레티노익산. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
The purpose of this study was to subculture normal human nasal epithelial (NHNE)cells without compromising their ability to differentiate into secretory and ciliated cells and to study the effect of retinoic acid (RA)on mucous and serous secretions in each passaged cells.
MATERIALS AND METHOD:
Freshly isolated nasal epithelial cells from normal inferior turbinates were subcultured repeatedly in serum-free medium on plastic tissue culture dishes. The subcultured cells were tested after every passage for secretory differentiation in air-liquid interface (ALI) cultures. The apical secretion of cultured NHNE cells was characterized by immunoblotting and Western blotting.
RESULTS:
Cultured NHNE cells secreted mucin and lysozyme. RA was essential for mucociliary and secretory differentiation.
The epithelium became squamous and mucin secretion decreased when RA was deleted from the culture media. Cells from passage 1(P-1) through passage-2 (P-2) remained competent to differentiate into mucous and squamous cells when grown in air-liquid interface culture.
CONCLUSION:
P-2 NHNE cell cultures retained many important features of normal epithelium and were suitable for conducting many studies of upper airway cell biology with an expanded cell pool. |
| Keywords:
Normal human nasal epithelial cellsㆍSubcultureㆍMucinㆍLysozymeㆍRetinoic acid |
서론
기도는 성대에 의해 상기도와 하기도로 나누어 지며 천식, 낭종성 섬유증 및 폐렴 등의 생명과 관계있는 질환이 대부분 하기도 질환이었기 때문에, 지금까지 기도에 대한 연구는 하기도 질환의 연구에 촛첨을 맞추어 진행되어 왔다. 그러나 발병율이 하기도 질환에 비해 매우 높은 알레르기성 비염, 과민성 비염, 부비동염 등이 병발하는 상기도의 임상적인 중요성도 크다고 할 수 있다.
기도상피세포의 배양은 분화된 기도상피세포의 기능과 환경 오염물질, 바이러스성 혹은 화학적 발암물질 및 세균의 영향을 연구하기에 좋은 방법으로써, 현재 submerged,1) suspension,2) floating,3) air-liquid interface(ALI)4)5) 등의 많은 다양한 배양방법이 개발되어 있으며 많은 연구자들이 보다 완전한 세포배양체계를 만들기 위해 노력하고 있다. 기도상피세포는 기도질환들 즉 각종 비염, 부비동염, 만성기관지염, 천식, 낭종섬유증 등에서 인체방어기전의 첫 장소이고 세균의 첫 표적세포들이기에 이의 생리학적 현상에 대한 연구는 매우 중요한 의미를 갖는다고 하겠다. 그러나 지금까지의 대부분의 연구는 기니 픽,6) 쥐,7) 햄스터8) 등의 동물 기도상피세포를 이용하여왔다. 사람에서는 일차배양세포를 주로 이용하였으나 실험에 충분한 양의 세포를 구하기가 어렵고, 실험을 위해서는 여러 공여자에서 동시에 일차배양을 시행해야 하는데 공여자간의 다양성 때문에 결과해석에 무리가 있고, 균에 의한 오염의 가능성 등의 문제점이 있는 실정이었다. 따라서 배양하기가 비교적 쉬운 종양세포를 이용하거나 혹은 SPOC-1, BEAS-2B 및 9HTE o -등의 세포계(cell line)를 만들어 이를 이용한 세포의 반응이나 기능에 대한 생리학적 연구를 진행하여왔다. 그러나 이러한 방법 역시 정상세포가 아니라는 점 때문에, 정상 기도상피세포를 이용한 연구의 필요성이 절실히 요구되고 있으나, 사람의 정상상피세포를 구하기가 어렵고 구하더라도 실험에 필요한 충분한 양을 확보하기가 어려운 문제점들을 가지고 있었다. 그러던 중 1996년 Gray 등 9)은 Clonetics사에서 상품화하여 팔고 있는 사람 정상하기도 상피세포(Passage-1；P-1)를 계대배양(subculture)하여 그 특성을 밝혀 Passage-2(P-2) 기도상피세포들이 분비물의 분비기전이나 분화를 연구하기에 적합하다고 보고한 이후 현재 많은 연구기관에서 이 정상 하기도 상피세포를 이용하여 각종 분비물의 조절 기전과 세포의 분화 혹은 염증성 매개체들이 미치는 영향에 대한 연구가 진행되고 있다. 기도질환의 발병빈도를 보면 상기도 질환들이 하기도 질환들보다 훨씬 높음에도 불구하고 상기도 상피세포에 대한 연구는 비용에서 배양된 일차상피세포를 이용한 간헐적인 연구만 진행되어 왔을 뿐 계대배양을 통하여 안정적으로 세포가 공급되는 여건에서 행해지는 체계적인 연구는 없는 실정이다. 이에 저자들은 이비인후과 의사로서 코의 상피세포들을 쉽게 구할 수 있다는 점에 착안하여, 정상 코 상피세포를 계대배양하여 실험에 사용하기 용이한 충분한 양의, 분화능력을 가지고 있는 많은 냉동 상피세포를 확보할 수 있는 방법을 개발하고 각 계대에서 상피세포의 분비성 분화의 특성을 밝히며 RA가 점액과 리소자임 분비에 미치는 영향을 알아보고자 본 연구를 실시하였다.
대상 및 방법
정상 코점막상피세포의 증식, 계대배양 및 냉동보관
비중격 만곡증으로 수술받는 환자들의 좁은 쪽 비강에서 혹은 상악동암의 수술 검체에서 정상으로 보이는 하비갑개 조직을 채취하여 1% pronase(type 14) in 1：1 of DMEM and F12 용액에서 18시간 정도 처치하였다. 상층에 떠 있는 세포를 플라스틱 용기에 평판한 후 37℃ 배양기에서 1시간동안 배양하면 근육세포, 혈관내피세포, 섬유아세포는 대부분 플라스틱 용기에 부착하나 상피세포는 그 시간동안 플라스틱에 부착하지 못하는 특성을 이용하여 상피세포만을 분리한 후 플라스틱 용기에 평판하였다. 배양액으로는 bronchial epithelial growth media(BEGM)을 사용하였으며 hydrocortisone(0.5 μg/ml), insulin(5 μg/ml), transferrin(10 μg/ml), epinephrine(0.5 μg/ml), triiodothyronine(6.5 ng/ml), gentamicin(50 μg/ml), amphotericin B(50 ng/ml), epidermal growth factor(25 ng/ml), alltrans retinoic acid(10 -7M), bovine serum albumin(1.5 μg/ml), bovine pituitary extract(1% vol/vol)를 배양액에 추가하였다. 배양액은 평판 하루후에 갈아주었으며 그 후로는 2일에 한번씩 갈아주었다. 50~60% 합류(confluency)를 이루는 시점에서 trypsin/EDTA를 이용하여 세포들을 프라스틱 용기로부터 분리시켜 단세포로 만든 후 액화질소에 6×10 5 cells/vial로 냉동보관하였다. 냉동보관된 상피세포를 350cells/cm 2 밀도로 평판하여 P-2 세포를 만들었다. Passage-3(P-3)와 passage-4(P-4)는 같은 방법으로 만들었다.
상피세포의 분화유도를 위한 air-liquid interface(ALI) 배양
10 5개의 인체 정상 코상피세포(normal human nasal epithelial(NHNE) cells, passage-2)를 반투과성막(Transclear, Costar Corp., Cambridge, MA)에 3.0 mg/ml의 제 1 형 콜라젠젤(Collaborative Res., New Bedford, MA)을 입혀 ammonium hydroxide가 들어 있는 밀폐된 곳에서 굳힌 후, 호르몬과 각종 성장인자가 첨가된 무혈장 배양액(Table 1)에 부유하여 평판하였다.7) 세포들은 첫 7일간은 배양액에 잠긴 상태로 두며 ALI를 만드는 7일까지 위 및 아래쪽 부분을 모두 격일로 갈아주었다. 그후 배양액은 아래쪽 부분만 매일 교환해 주며 위쪽은 배양액을 제거하여 공기에 노출시켰다. 배양은 37℃, 5% CO 2에서 진행하였다.
조직학 및 cytospin 슬라이드작성
사람 정상 코점막 상피세포를 RA유무에 따라 16일간 배양한 후 일부는 10% 중성포르말린에 고정한 후 2% 아가로스 젤에 샌드위치형으로 넣어 굳힌 후 파라핀에 포매하여 5 μm 두께로 절단하였다. 절단된 조직들은 H & E 염색을 실시하였다. 나머지 일부는 10 5개의 세포로 cytospin 슬라이드를 만든 후 4℃의 아세톤：메칠알코홀 1：1 용액에 고정후 섬모에 특이적으로 반응하는 β-tubulin 및 점액 항체(H6C5)로 면역조직화학적 염색을 시행하였다. β-tubulin 및 점액 항체(H6C5)에 양성인 세포의 백분율은 총 3,000개의 세포와 그중 양성세포의 수를 측정하여 구하였다.
점액 및 리소자임 분비의 면역적 검출 및 정량
배양된 사람 정상 코점막 상피세포에서 분비물 측정을 위한 방법은 immunoblot assay를 이용하는 Gray 등 9)이 기술한 방법을 사용하여 배양세포들이 24시간동안 분비한 양을 수집하여 정량하였다. RA 배양액에 유무에 따른 점액과 리소자임의 분비량을 측정하였다. 순수 인체점액(a generous gift from Dr. Davis, University of North Carolina, NC, USA)과 리소자임(Sigma, St. Louis, MO)을 표준으로 사용하였다. 점액에 대한 일차항체로는 단클론성 항체인 H6C5(1：1,000, a generous gift from Dr. Davis)을 리소자임에 대한 일차항체로는 다클론성 리소자임 항체(1：1,000, Dako, Capintera, CA)를 사용하였다. 배양된 세포에서 채취된 분비물과 표준들은 일정한 비율로 희석하여 나이트로셀룰로즈막에 적용하여 일차항체와 반응시킨후 horse-radish peroxidase conjugated goat anti-mouse IgG 혹은 anti-rabbit IgG에 반응시켰으며 chemiluminescence(ECL kit, Amersham, Buckingamshire, UK)로 발색시켰다. Standard curve를 linear regression analysis를 이용하여 얻은 후 각 검사물의 발색정도와 비교하여 그 양을 정량하였다. 리소자임 항체의 특이성은 western blot에 의해 확인하였다. 각 그룹에서 배양된 세포들의 수는 세포들을 트립신 처리하여 단세포로 만든 후 hemocytometer에 의해 측정하였다. 각 실험결과는 같은 실험을 3번이상 시행하여 평균±표준편차로서 나타냈으며 통계학적 처리는 Student’s t-test로 하였다.
결과
사람 정상 코점막 상피세포의 증식
5명의 공여자로부터 얻은 정상 코점막에서 효소처리하여 분리된 상피세포를 배양하여 얻은 P-1 세포 3×10 4을 10 cm 플라스틱 용기에 평판하였다. 세포들이 자라 약 50~60% 합류를 이루었을 때 세포들을 수확하여 10% DMSO 용액에 넣은 후 냉동질소에 보관하였다. 세포들은 P-3까지는 잘 자랐으나 P-4 세포들은 성장이 둔하고 세포내에 공포가 생기고 세포의 크기가 커지는 현상이 나타났다. P-3까지 각 passage 마다 약 20~30배의 세포수가 증가되어 동일한 strain에서 P-3까지 약 400배의 세포가 확보되었다.
P-2 사람 정상 코점막 상피세포의 성장곡선과 점액분비
계대 배양된 세포의 분화능력을 검사하기 위해 제 1 형 콜라젠 젤을 입힌 Transwell-clear membrane(24.5 mm, 0.45 μm pore size, Costar Co., Cambridge, MA)에 10 5개의 P-2 NHNE 세포들(2×10 4cells/cm 2)을 배양액에 평판하였다. 배양용기당 보통 2×10 6개 이상의 세포를 얻을 수 있었고, 동일한 배양용기에서 점액분비는 배양 9일에서 16일사이에 시간에 비례하여 증가하는 양상을 보였다. 세포수를 측정하기 위해서 분화된 상피세포들을 트립신 처리하여 단세포로 만든 후 hemocytometer로 수를 세었다. P-2 NHNE는 배양 9일째부터는 급속한 성장을 하여 2~3일만에 수가 배가 되었으며 배양 16일부터 plateau phase에 들어갔다(Fig. 1A). 배양일에 따른 점액분비는 배양 16일째 130.7±19.8 μg/10 6 cells을 분비하였으며 18일째는 213.0±11.5 μg/10 6 cells으로 절정에 달하였다가 배양 22일째는 165.6±12.6 μg/10 6 cells으로 약간 감소하여 배양 16일째부터 plateau phase에 접어드는 양상을 보였다(Fig. 1B). 섬모상피세포는 배양 12~14일째부터 면역조직화학적 검사상 나타나기 시작하였다
(Fig. 2).
계대배양된 사람 정상 코점막 상피세포의 각 계대에서 분비세포로의 분화
Cytospin 슬라이드로 면역조직화학적 염색을 하기위한 세포들은, 성장과 점액분비가 plateau phase를 이루는 시점인 배양 16일째에 채취하였다. P-1세포의 분화를 유도하였을 때 배양 16일째 세포의 수는 4.3±0.6(×10 6) 이었으며 P-2세포는 2.5±0.3(×10 6), P-3세포는 1.8±0.6(×10 6)으로 계대배양할 때마다 성장능력이 감소되는 것이 관찰되었다(Table 2). 분비세포의 백분율을 알기위해 점액항체인 H6C5로 염색한 결과 각 계대에서 분비세포는 P-1에서 38±2.6%, P-2에서 39.1±2.0%, P-3에서 35.1±0.6%로 계대간 차이가 관찰되지 않았다. P-4는 배양용기에 부착은 하였으나 번식을 하지 못하였다(Table 2).
계대배양된 사람 정상 코점막 상피세포의 각 계대에서 점액과 리소자임 분비에 대한 retinoic acid(RA)의 효과
점액분비에 대한 RA의 효과
배양액에 RA(10 -7M)가 포함되어 있을 때의 점액은 P-1에서 26.8±0.4 μg/10 6 cells, P-2에서 50.8±5.9 μg/10 6 cells, P-3에서 62.4±13.8 μg/10 6 cells이 분비되었다. RA를 배양액에서 없앴을 경우 P-1에서는 측정가능한 양 이하, P-2에서 1.5±0.3 μg/10 6 cells이었다. P-3에서는 12.8±3.0 μg/10 6 cells로 P-2에 비해 약 8.5배나 증가하였고 RA가 배양액에 있을 때의 P-1세포 점액분비량의 47.8%에 육박하는 많은 양의 점액을 분비하고 있어 RA에 대한 세포의 반응이 변하고 있을 가능성이 있었다(Table 3).
리소자임분비에 대한 RA의 효과
배양액에 RA(10 -7M)가 포함되어 있을 때의 리소자임은 P-1에서 0.5±0.03 μg/10 6 cells, P-2에서 1.4±0.02 μg/10 6 cells, P-3에서 2.7±1.1 μg/10 6 cells이 분비되었으나, RA를 배양액에서 없앴을 경우 P-1에서는 6.8±0.7 μg/10 6 cells, P-2에서 5.9±0.3 μg/10 6 cells으로 RA에 의하여 증가하는 점액의 분비양상과는 상반된 결과를 보였다. 한편 P-3에서는 1.5±0.1 μg/10 6 cells로 현저히 감소함이 관찰되어 역시 RA에 대한 세포의 반응이 변한 것이 아닌가 생각되었다(Table 3).
계대배양된 코점막 상피세포에서 세포의 표현형에 대한 RA의 효과
P-1과 P-2세포들은 배양 16일째 배양액에 RA가 있는 경우는 세포들이 입방형이었으나 섬모가 잘 보이고 있었으며(Fig. 3A) RA를 제거한 경우에는 편평상피세포로 변하였다(Fig. 3B). 하지만 P-3 세포는 RA를 제거하였을 때도 형태학적으로 특징적인 편평상피세포로의 분화가 일어나지 않았다.
고찰
세포 배양방법의 발달로 기도 상피세포는 생체와 유사한 형태와 생리학적 및 생화학적 특성을 가지게끔 분화를 유도할 수 있다. 인체 기도 상피세포에 대한 연구의 제한점은 충분한 양의 상피세포를 얻기가 어렵다는 것이다. 이러한 문제점은 분비세포와 섬모상피세포로의 분화능력을 유지하면서 상피세포의 계대배양이 가능하다면 해결될 수 있다.
저자들은 무혈장 배양액을 이용하여 5명의 공여자에서 얻은 인체 정상 코점막 상피세포를 플라스틱 용기에서 passage-4까지 계대배양하였다. 각 공여자에서 만든 passage-2 세포에서 세포의 성장과 그에 따른 점액의 분비를 측정한 결과, 세포의 성장이 배양 16일부터 plateau phase에 접어 들었으며, 각 공여자에서 만든 P-2 NHNE 세포에서 점액분비는 배양 16일째 50~150 μg정도의 충분한 양이 분비되는 것을 관찰하여 향후 일정 시점에서의 결과를 추출할 때는 배양 16일째가 가장 적당한 시점으로 생각되었다.
P-1에서 P-4까지 계대배양된 각각의 상피세포에서 배양 16일째 상피세포의 수와 분비상피세포의 수를 측정한 결과 계대배양될수록 세포의 수는 점차 감소하였으나, H6C5 점액항체로 면역조직화학적 염색하여 분비 세포의 백분율을 측정한 결과 각 계대배양된 세포에서 분비상피세포의 백분율은 큰 변화가 관찰되지 않았다(Table 2). 본 연구결과에서 전체 상피세포중에서 분비상피세포의 백분율은 계대배양에 따른 차이가 없었지만 점액의 분비량은 약간씩 증가하는 양상을 보여 세포가 계대배양될수록 일정 세포가 분비하는 점액의 양이 증가하는 것을 암시한다 하겠다.
저자들은 정상 코점막 상피세포의 P-1 및 P-2 배양세포는 분비능력이나 점액분비세포나 섬모상피세포로의 분화능력을 유지한다는 것을 알 수 있었고 P-3 배양세포는 RA가 있을 때는 점액섬모 상피세포로의 분화에 문제점이 없었으나, RA가 결핍된 상태에서는 세포수를 셀 때 전형적인 편평상피세포가 관찰되지 않았고 점액의 분비량이 P-2 세포에 비해 8.5배 정도 증가하였으며 리소자임도 분비량이 약 25%로 감소함으로써 RA 결핍에 대한 세포의 반응이 무뎌짐을 알 수 있었다. 따라서 배양된 사람 정상 코점막 상피세포의 P-3 배양세포는 RA를 제거하더라도 편평상피세포로 분화가 되지 않음으로써 세포가 상피세포의 특성을 일부 잃어 버렸다는 것을 암시하고 있다. 또한, 계속되는 계대배양으로 즉 P-1에서 P-3 계대배양으로 갈수록 배양 16일째 세포의 수가 감소하는 것이 관찰되어(Table 2) 노화에 따라 세포 기능이 점차 떨어지는 것으로 추정된다. P-1 및 P-2 상피세포는 형태학적이나 생리학적으로도 생체와 유사하게 분화가 되었다. P-4 계대배양된 상피세포는 배양용기에 부착은 하였으나 증식이 일어나지 않았다. 따라서 P-2 상피세포가 분비물과 분화에 관한 각종 실험을 수행하는데 가장 적합할 것으로 사료된다.
상피세포에서 분비되는 분비물은 점액성과 장액성으로 나누어지며 점액성 분비물의 대표로 점액을 선택하였으며, 장액선 분비물에는 리소자임, 락토페린, secretory IgA, secretory leukocyte protease inhibitor(SLPI) 등이 있는데10) 저자들은 그 중 리소자임을 선택하여 백만개의 세포당 분비되는 양을 정량하였다. 각 계대배양된 상피세포에서 immunoblot으로 정량 가능한 충분한 양의 점액과 리소자임이 분비되어 계대배양된 사람 정상 코점막 상피세포도 생체에서 분비되는 것으로 알려진 많은 분비물들을 분비한다는 것을 알 수 있었다.
기도 상피세포의 성장과 분화에 있어서 retinoids의 중요성은 이미 잘 알려져 있다. 쥐, 햄스터, 및 토끼의 배양된 기도 상피세포는 RA가 결핍된 무혈청 배양액에서는 편평상피화한다고 보고되어 있으나11-13) 일부 연구자들은 배양액에 RA가 없더라도 점액섬모상피로 분화할 수 있다고 보고하였다.14)15) 이러한 불일치가 어디에서 근거하는 것인지는 아직 확실하지 않지만 어떤 경우에서는 배양액에 사용된 혈장내에 이미 충분한 양의 RA가 있어 편평화생을 막았을 가능성이 있다고 할 수 있다. 그러나 다른 경우에서는 무혈장 배양액16)17) 혹은 Ultroser G18)19)를 사용하였는데 어떻게 점액섬모상피로 분화할 수 있었는지 설명하기가 어렵다. 또한 혈장대신 뇌하수체(BPE) 혹은 시상하부 추출물을 이용하는 경우는 추출하는 방법에 따라 들어 있는 retinoids의 양이 다양할 수 있다. 따라서 저자들의 배양체계에서는 저자들이 추출한 BPE를 사용한 배양액에서 비타민 A의 최종산물인 RA의 효과를 재검토해야 할 필요성이 제기되었다. 저자들의 배양체계에서는 RA는 최소한 10 -9M이 있어야 점액섬모상피로 분화가 되었으며(unpublished data) 그 이하의 농도로 있을 때는 편평화생이 일어났다. 또한 RA는 점액의 분비를 약 50배 증가시켰는데 이는 retinol이 rhesus monkey와 human tracheobronchial cell 배양에서 점액유전자의 하나인 MUC2를 감소시킨다고 보고한 결과20)와 상반되는 결과라 할 수 있다. 그러나 현재 왜 이런 상반된 결과가 나타났는지는 알 수 없다.
한가지 흥미로운 것은 점액이 증가하는 상태에서는 리소자임 분비가 감소하였다는 점으로 이는 Gray등의 보고와 일치되는 결과이다. 두 물질 모두 상피세포에서 분비되는 것인데 점액성 분비가 증가하는데 반해 오히려 장액성 분비가 줄어 들었다는 것은 서로 다른 조절 기전을 갖고 있거나 아마도 RA가 세포의 형태에 결정적인 영향을 주기 때문에 세포의 형태변화에 따른 이차적인 현상일 것으로 생각되었다.
결론적으로 이번 저자들의 연구에서 분화능의 소실없이 성공적으로 계대배양을 하였으며, 인체 코점막 P-2 상피세포를 ALI법을 이용하여 분화시키는 방법은 인체 코점막 상피세포의 분화와 분비물들을 연구하는 데 좋은 실험모델로 사용할 수 있을 것으로 생각된다.
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