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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1998;41(11): 1365-1371. |
| Establishment of Normal Human Middle Ear Epithelial (NHMEE) Cell Using Serum-free Media. |
| Sung Kyun Moon, Ho Ki Lee, Joo Heon Yoon, Myung Hyun Chung, Hee Nam Kim |
| Department of Otorhinolaryngology, College of Medicine, Yonsei University, Seoul, Korea. hokilee@yumc.yonsei.ac.kr |
| 무혈장 배양액을 이용한 사람의 정상 중이점막 상피세포의 배양 |
| 문성균 · 이호기 · 윤주헌 · 정명현 · 김희남 |
| 연세대학교 의과대학 이비인후과학교실 |
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| 주제어:
사람 중이점막ㆍ상피세포ㆍ세포배양ㆍ무혈장 배양액. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Despite many reports about middle ear mucosal epithelial cell culture of experimental animals like rat, gerbil or chinchilla, normal human middle ear epithelial (NHMEE) cells have not been cultured in vitro yet. We attempted to culture NHMEE cells and confirm them to be epithelial cells.
MATERIALS AND METHOD:
Healthy middle ear mucosa was harvested during the otologic surgery without contamination.
Specimen was cultured by primary explant culture method and proliferating cells were subcultured after enzymatic disaggregation. Cultured cells were observed using phase contrast light microscope, scanning electron microscope and transmission electron microscope. Immunocytochemical stain was performed to identify the expression of cytokeratin, vimentin and von Willebrand factor.
RESULTS:
Cultured cells were of polygonal shape and the cell surfaces were covered by microvilli. The immunocytochemical stain revealed cytokeratin in all the cultured cell, whereas vimentin was co-expressed in some of the cells and von Willebrand factor was not expressed at all. We could observe desmosome or tonofilament in cultured cells by TEM. Although cells proliferated 20 or 30 fold in every passage, the passage-4 cells did not proliferate and many vacuoles were formed.
CONCLUSION:
The NHMEE culture system using serum free media will provide a good model for the study of human middle ear epithelial differentiation and secretion. |
| Keywords:
Human middle earㆍEpithelial cellㆍCell cultureㆍSerum-free media |
서론
삼출성 중이염과 같은 중이질환에서 점막에서의 과분비가 차지하고 있는 역할을 알아보고자 중이점막의 세포분비에 대한 연구가 활발히 진행되어 왔으며 특히 최근에는 쥐1)나 친칠라2)3)등과 같은 실험동물의 중이점막 상피세포를 배양하여 배양된 세포를 이용하여 세포 자극 물질이나 염증성 매개체가 세포 분비에 미치는 영향에 대한 보고가 있었다.
그러나 실험동물의 중이점막 상피세포보다는 사람의 중이점막 상피세포를 직접 배양하여 실험하는 것이 인체의 생리적 상태에 더욱 가까운 결과를 얻을 수 있을 것으로 생각되나 사람에서는 충분한 양의 중이점막을 구하기가 어렵고 사람의 중이점막 상피세포가 잘 증식되는 배양액이 개발되어 있지 않아 아직 사람의 중이점막 상피세포를 효과적으로 분화능력의 소실없이 배양하는 방법이 확립되어 있지 않은 상태이다.
최근 저자들은 중이점막이 발생학적으로 호흡점막과 기원이 같다는 점에 착안하여 사람의 기도점막과 코점막 상피세포 배양에 사용된 무혈장 배양액4-6)을 이용하여 사람의 정상 중이점막 상피세포의 배양을 시도하고 장기적으로는 계대배양하여 실험에 충분한 양의 냉동세포를 얻고자 한다. 이를 위해 본 연구에서는 일차적으로 explant 배양법7)을 이용하여, 사람의 정상 중이점막 상피세포의 배양을 시도하고 배양된 세포의 형태학적 관찰과 세포의 동정을 규명하고자 본 실험을 시행하였다.
재료 및 방법
Primary explant법을 이용한 세포배양
청신경 종양 환자나 측두골 골절 환자 및 선천성 외이도 폐쇄증 환자의 수술시 중이의 점막상태가 정상소견을 보이는 환자의 중이 점막 조직을 중이갑각(promontory)에서 크기가 약 2×2 mm 2 정도로 채취하여 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Gibco, NY, USA)과 Ham's F12 nutrient mixture(F12, Gibco, NY, USA)를 1：1로 혼합하고 항생제(Penicillin；100units/ml, Streptomycin；100 ug/ml, Gibco, NY, USA)를 첨가한 transfer media에 넣어 냉장보관하였다.
채취한 중이조직을 35 mm 플라스틱 배양접시에 옮겨 37℃, 5% CO 2에서 explant culture를 시도하였다. 배양 첫날은 배양액을 적게 넣어 조직이 플라스틱 배양접시 표면에 잘 부착되도록 하였으며 일단 조직이 부착되면 배양액을 격일로 교환해 주었다. 배양액은 bronchial epithelial ba-sal medium(BEBM, Clonetics Co., MD, USA)을 기본 배양액으로 하여 각종 홀몬과 성장인자들을 10가지 첨가하였으며 혈장은 포함시키지 않았다(Table 1). 조직의 변연부로부터 바깥쪽으로 세포가 충분히 증식되면 HBSS(hy-droxyethyl piperazine ethane sulfonic acid buffered saline solution)에 희석한 0.025% trypsin 0.01% ED TA(Clonetics Co., MD, USA)로 세포를 유리시켜 단세포를 만들었다. 혈구계를 이용하여 수집된 세포의 수를 세고 분주되는 세포가 2,000 cells/cm 2이 되도록 희석하여 플라스틱 배양용기에서 이차배양을 하였으며 배양된 세포가 50∼60% 함류를 이루었을 때 다시 효소처리하여 단세포로 분리후 분주하여 계대 배양을 시도하였다.
배양된 세포의 면역세포화학염색
배양된 세포가 상피세포임을 증명하기 위해서 이차배양된 세포에서 cytokeratin, vimentin 및 von Willebrand factor에 대한 면역세포화학염색과 cytokeratin과 vim-entin에 대한 중복 면역염색을 각각 시행하였다. 면역염색을 위한 슬라이드 제작을 위해, 일부 세포는 chamber sli-de(Lab-Tek Chamber slide, Nalge Nunc Internat-ional, USA)에서 배양하였으며 중복 면역염색을 위해서는 일부 세포로 cytospin slide를 만들었다. cytospin은 효소처리로 유리된 세포를 세포농도가 5×10 4 cells/200 ul 되도록하여 cytospin 원심분리기(Cytospin3, Shandon, USA)로 500 rpm에서 5분간 원심분리하여 slide에 부착시킨 후 차게한 acetone과 methanol을 1：1로 섞은 용액으로 고정시켰다.
일차항체로는 단클론성 mouse anti-human cytokeratin(1：100, DAKO, Denmark), vimentin(1：50, DAKO, Denmark), von Willebrand factor(1：50, DAKO, Denmark) 항체를 각각 사용하였다. 이차항체는 biotinylated anti-mouse rabbit IgG(1：200, Vectastain Elite ABC Kit, Vector Lab., CA, USA)를 사용하였다. 세포가 배양되어 있는 chamber slide를 100% methanol 200 ml와 30% H 2O 2 2 ml를 섞은 용액에 20분간 담궈 내인성 peroxidase을 제거한 후 비특이적 항원 항체 반응을 방지하기 위해 1：600으로 희석된 가토의 정상혈장을 20분간 처치하였다. 일차항체를 37℃에서 2시간 처치한 후 biotin이 부착된 이차항체를 30분간 처치하였다. avidin-biotinenzyme complex법으로 peroxidase를 부착시킨 후 diaeinobenzidine tetrahydrochloride(DAB)를 처리하여 갈색으로 발색시켰다. 대조염색은 Mayer's hematoxylin으로 시행하였으며 음성 대조염색으로는 일차항체를 nonimmunized mouse IgG(Sigma, MO, USA)로 대치하고 나머지 순서는 동일하게 하였다. cytokeratin과 vimentin이 동시에 발현되는지를 증명하기 위해 중복 면역세포화학염색을 시행하였는데 cytokeratin은 이차항체에 ABC법으로 alkaline phosphatase를 부착시킨 후 aminoethylcarbazole(AEC)를 처리하여 적색으로 발색시켰으며 vimentin은 이차항체에 peroxidase를 부착시켜 bromocholoroindiophosphate(BCIP)/nitro blue tetrazolium(NBT)를 처리하여 흑청색으로 발색시켰다.
배양된 세포의 위상차 현미경과 주사 및 투과전자현미경적 관찰
배양되고 있는 세포의 형태를 위상차 현미경(Olympus light microscope, Vanox-S type, Japan)을 이용하여 관찰하였다. 주사전자현미경적 관찰을 위해서 chamber slide에 배양된 세포를 4℃의 2.5% glutaraldehyde에 4∼6시간 고정시킨 후 0.1 M 인산완충용액으로 세척하였다. 1% osmium tetroxide에 2시간 다시 고정한 후 탈수과정을 거쳐 critical point drying 후 금도금(300 μm thickness)하여 관찰하였다.
투과 전자현미경 관찰을 위해서 chamber slide에서 배양된 세포를 2.5% glutaraldehyde에 4℃에서 4∼6시간 고정시킨 후 0.1 M 인산완충용액으로 세척하였다. 1% os-mium tetroxide에 4℃에서 1시간 고정후 탈수하였다. epon 812에 포매후 60℃ 배양기에서 48시간 중합후 배양용기에서 떼어내어 epon에 부착된 상태로 떨어져 나온 세포를 절편으로 만들었다. 절편을 uranyl acetate에 실온에서 6분, lead citrate에 3분간 염색하였다.
결과
계대 배양의 성공률
Primary explant를 위하여 10례의 환자에서 중이점막을 채취하여 배양하였으나 그 중 3례에서 세포의 증식을 관찰할 수 있었고 모든 례에서 passage-4까지 계대 배양을 할 수 있었다.
배양된 세포의 증식형태
조직의 변연부로부터 배양후 5∼6일째 세포가 증식되기 시작하였으며 세포는 다각형이었고 서로 밀착되어 증식하였다(Fig. 1). cluster의 주변부에 있는 세포는 세포질 돌기가 바깥쪽으로 뻗어 나가는 모양을 하고 있었으며 세포내에서 핵이 분열하고 있는 세포를 관찰할 수 있었다.
분주될 때마다 세포수는 20배에서 30배정도 증가하였으나 3회의 분주후 배양되는 세포들(passage-4 cells)은 더 이상 증식하지 않고 세포질내에 공포(vacuole)를 형성하는 양상을 보였다(Fig. 2).
주사전자현미경상 배양된 세포들(passage-2 cells)은 다각형의 형태였으며 서로 밀착되어 있었다. 세포의 표면은 microvilli로 덮여있는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 3A). 투과 전자 현미경상에서는 상피세포에서 특징적으로 발견되는 desmosome과 tonofilament를 관찰할 수 있었다(Fig. 3B).
배양된 세포의 동정
면역세포화학염색상 모든 세포는 상피세포의 표식자인 cytokeratin에 강하게 염색되었다(Fig. 4A). 일부 세포에서는 vimentin의 발현이 관찰되었으나(Fig. 4B) 주로 cluster의 주변부세포, 즉 세포분열이 활발한 세포에서 발현되었다. 내피세포의 표식자인 von Willebrand factor에 양성인 세포는 없었다(Fig. 4C). 중배엽 기원의 세포에 나타나는 vimentin이 배양된 상피세포에서도 나타날 수 있다는 보고가 있어 저자들은 중이점막 상피세포에서도 두가지가 동시에 발현되는지를 알아보고자 vimentin과 cytokeratin의 중복 면역세포화학염색을 시행하여 일부 같은 세포에서 두 항원이 동시에 발현되는 것을 관찰할 수 있었다. 주로 vimentin은 세포질의 중앙부위에서, cytoker-atin은 세포질 전체에서 양성반응을 보였다(Fig. 5).
고찰
최근 세포배양법의 발달로 세포의 특성을 유지하면서 특정세포의 증식 혹은 분화를 시킬 수 있게되어 세포배양은 많은 실험에 이용되고 있다. 조직이나 생체를 재료로 하여 실험할 경우에는 그 결과나 현상이 각종 세포의 상호 작용에 의한 것이기 때문에 그 분석이 어렵지만, 세포배양을 이용하여 실험을 할 경우 한가지 세포만 가지고 실험할 수 있기 때문에 결과의 분석을 단순화 할 수 있는 장점이 있다. 또한 사람의 세포를 배양하여 실험함으로써 실험동물의 제한점인 종간의 차이를 부분적으로 극복할 수 있게 되었다. 중이점막의 상피세포는 쥐나 가토와 같은 실험동물에서 이미 배양법이 확립되어 실험재료로 사용되고 있으나 아직 사람의 중이점막 상피세포의 배양법은 확립되어 있지않은 상태이다.
중이점막 상피세포의 배양은 1976년 Drucker등8)에 의해 처음 시도 되었으나 약 2주동안 점막조직을 체외에서 생존시키는데 불과하였다. 그후 1986년 Van Blitterswijk등9)이 쥐의 중이점막 세포를 계대배양하는데 성공하였고 뒤이어 기니아픽,10) gerbil,11) 친칠라12)13)에서도 계대배양이 성공되었다. 1992년 Hill등 4)은 사람 중이점막조직을 체외에서 1주일간 배양하여 점액이 생성되는 것을 확인하였으나 상피세포의 일차배양이나 계대배양이 아닌 조직배양이었다. 한편, 1993년 Herman 등15)은 gerbil의 중이점막 cell line을 만드는데 성공하였으며 이 세포가 중이점막 상피세포의 특성을 유지하고 있음을 증명하였다. 그러나, 아직 사람의 중이점막 상피세포의 계대배양에 대한 보고는 없으며 현재 앞서 기술한 실험동물의 중이점막 상피세포를 배양하여 세포의 분비나 생리를 연구하고 있는 현실이다.
쥐나 가토와 같은 실험동물의 중이점막 상피세포보다는 사람의 중이점막 상피세포를 직접 배양하여 실험에 이용하는 것이 인체의 생리상태에 가까운 결과를 얻을 수 있음에도 불구하고 지금까지 그 배양이 힘들었던 이유는 충분한 양의 정상적인 중이 점막조직을 얻기가 힘들고 동물과 달리 사람의 중이점막 상피세포가 잘 증식되는 무혈장 배양액의 성분이 아직 마련되어 있지 않기 때문이다.
세포배양시 혈장이 들어 있는 배양액을 사용하게 될 때의 문제점은 첫째, 세포배양시 섬유아세포가 증식되기 쉬우며4) 둘째, 배양액에 혈장이 함유되어 있으면 실험하고자하는 특정 성분이 이미 포화상태로 배양액에 존재할 가능성이 있기 때문에 실험하고자하는 특정성분에 의해 나타나는 현상을 해석하기가 어려운 문제점이 있다. 이에 저자들은 사람 중이점막 상피세포의 분화 및 분비에 대한 연구의 기초단계로, 중이점막이 호흡점막과 발생학적 기원이 같다는 점에 착안하여 사람의 기도점막 및 코점막 상피세포의 배양에 사용된 무혈장 배양액4-6)과 primary explant배양법을 이용하여, 안면신경 감압술이나 청신경종양수술 또는 선천성 외이도 폐쇄증의 수술 등 비교적 중이점막이 정상이며 세균의 오염이 적은 이과 수술시 사람의 중이점막을 채취하여 상피세포를 배양하고 배양된 세포가 상피세포임을 증명하고자 하였다.
배양된 모든 세포에서 상피세포의 표식자인 cytokeratin이 발현된 것과 투과 전자현미경 소견상 desmosome이나 tonofilament과 관찰된 것으로 보아 배양된 세포는 상피세포인 것으로 확인할 수 있었다. 한편, 일부 세포에서 섬유아세포의 표식자인 vimentin이 발현되었는데 이것은 섬유아세포의 오염이 아니라 배양된 상피세포에서 cytokeratin과 vimentin이 동시에 발현되는 것을 중복 면역염색으로 확인할 수 있었다.
배양된 상피세포에서 섬유아세포의 표식자인 vimentin이 동시 발현되는 현상은 이미 배양된 사람의 피부상피세포16)17)나 유선세포18) 및 호흡상피세포19)에서 확인된 현상으로 주로 분화가 되지않은 세포에서 발현이 많이 되는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서도 비교적 분화가 되지 않고 세포분열이 활발히 일어나는 것으로 생각되는 cluster의 주변부에서 vimentin이 주로 발현되었으며 본 실험결과에 포함시키지 않았지만 배양액에서 Ca++을 낮추고 epidermal growth factor의 농도를 높여 세포의 분화를 억제한 경우 vimentin의 동시 발현이 증가하는 현상을 관찰할 수 있었다.
본 실험에서 이용된 primary explant 배양법의 장점은 작은 조직을 이용하여 배양을 시작할 수 있다는 점이지만 모든 조직표본에서 일차배양이 시작되지 않고, 많은 경우에 조직이 괴사되는 단점이 있어 보다 효율이 좋고 세포의 증식능력을 오래 유지할 수 있는 배양법의 개발이 필요하다고 생각된다.
사람 중이점막의 세포분비나 생리에 대한 연구재료로 본 실험에서 배양된 세포를 이용하려면 먼저 배양된 세포가 정상 점막세포와 그 특성이 같거나 적어도 크게 다르지 않다는 것을 확인하는 작업이 선행되야 하며 둘째로 최대 어느 passage까지 중이점막세포의 특성이 유지되는지를 증명하는 실험이 필요하다. 기본적으로 각 계대별 증식율, 증식속도 및 분화능력 등에 대한 실험이 필요하나, 본 실험에서 passage-4 세포가 증식능력을 잃고 노화되는 것을 볼 때 일단 passage-4 세포는 실험재료로 이용될 수 없고 passage-3 세포나 passage-2 세포를 사용해야 된다고 생각한다. 또한, passage-3 세포보다는 passage-2 세포가 생체 세포에 더 가까운 특성을 가지고 있을 것이라는 것은 자명한 사실이나 passage-2 세포를 실험에 사용하기에는 충분한 세포를 확보하는데 어려움이 있어 증식율이 높은 배양법의 개발이나 이미 개발된 gerbil의 중이점막 세포계와 같이 사람에서도 중이점막 세포의 특성이 유지되는 세포계의 개발이 필요할 것으로 생각된다.
이번 실험을 통하여 사람 기도상피세포의 배양에 사용되었던 무혈장 배양액이 사람 중이점막세포의 배양에도 유용함을 확인할 수 있었으며 primary explant 배양법의 장점과 한계를 알게되어 앞으로 보다 나은 배양법 개발에 기초가 될 것이라 생각한다.
결론
저자들은 사람의 정상 중이점막 상피세포를 채취하여 무혈장 배양액을 이용하여 primary explant 배양법으로 배양하였으며, 배양된 세포가 상피세포임을 면역세포화학염색과 전자현미경적 관찰로 확인하였다. 따라서 배양된 세포는 향후 사람의 중이점막 상피세포의 분비 및 생리 연구에 좋은 모델이 될 것이다.
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