교신저자：김용대, 705-717 대구광역시 남구 대명 5동 317-1  영남대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   Prostaglandin(PG)은 염증반응을 일으키는 중요한 물질이며 cyclooxygenase(COX)는 PG의 합성에 필수적인 효소이다. 이 효소는 arachidonic acid를 prostaglandin H₂로 전환시켜 prostaglandin, prostacyclin 및 thromboxane A₂ 등을 생성한다. COX는 두 종류가 있는데 COX-1은 생리적인 환경에서 항상성 유지를 위한 PG의 생성을 담당하고, COX-2는 정상환경에는 존재하지 않거나 미약하게 분포하며 특정세포에서 사이토카인과 같은 전구성 염증자극¹⁾이나 lipopolysaccharide,²⁾ 성장인자³⁾ 등의 자극에 의해서 발현이 증가되어 세포성장이나 염증반응을 진행시키는데 중요한 역할을 한다.
   인체의 기도 상피세포에서 COX-2의 발현은 여러 전구염증성 사이토카인에 의해서 이루어지며, interleukin-1β(IL-1β)는 호흡기 상피세포에서 COX-2 유전자와 효소의 활성도 뿐 아니라 PGE2의 발현도 증가시켜 염증반응을 유도한다.⁴⁾ 이러한 염증반응을 억제하기 위해 최근 새로운 비스테로이드성 항염증 약제(non-steroidal anti-inflammatory drugs；NSAIDs)가 속속 개발되고 있고 특히 선택적인 COX 억제제들이 각광을 받고 있다. 이 중 COX-2 선택적 억제제(COX-2 selective inhibitor)는 위장세포보호에 중요한 COX-1은 억제하지 않고 COX-2만을 억제하여 소화성 궤양과 같은 합병증을 줄여 준다. 부신피질호르몬 역시 인간의 기도 상피세포에서 arachidonic acid의 유리억제, phospholipase A₂ 활성도 감소, prostaglandin과 COX-2의 생산감소 등의 효과를 나타낸다.⁵⁾⁶⁾ 포도열매껍질에서 추출되어 허혈성 심장질환의 예방, 항염증 및 항암효과가 있다고 밝혀진 resveratrol도 COX를 억제한다고 알려져 있다.⁷⁾
   따라서 본 연구에서는 인간 호흡기 상피세포주에서 COX-2 선택적 억제제인 NS398과 COX-1 선택적 억제제인 salicylate, COX-1/COX-2 비선택적 억제제(COX-1/COX-2 non-selective inhibitor)인 indomethacin, antioxidant인 resveratrol 그리고 항염증제제인 부신피질호르몬이 IL-1β에 의해 유도된 COX-2의 생성에 어떠한 영향을 미치는지를 비교하여 호흡 상피세포에서 염증발현의 양상을 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

세포배양 및 처치
   인간 호흡기 상피세포주인 human pulmonary mucoepidermoid carcinoma cell line(NCI-H292 cell, American Type Culture Collection, Rockville, MD)을 6개의 실험판에 1×10⁶ 세포의 농도로 배양하고, 95%의 공기와 5%의 이산화탄소가 가습된 대기에서 37℃의 온도로 10% fetal calf serum(FCS, GibcoBRL, Grand Island, NY)이 포함된 RPMI 1640(GibcoBRL) 배지에 penicillin 100 U/ml, streptomycin 100 μg/ml, 2 mM L-glutamate를 추가하여 배양하였다. 배양이 어느 정도 이루어 지면 세포를 24시간 동안 0.5% fetal calf serum(FCS)을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 배양하였고 phosphate buffer saline(PBS)에 헹구어 낸 후 human recombinant IL-1β(R & D Systems, Minneapolis, MN)를 0.02, 0.2, 2, 20 ng/ml의 농도로 투여한 후 37℃에서 8시간 동안 배양하여 IL-1β에 의한 COX-2의 발현 양상을 관찰하였다.
   억제제의 효과를 알아보기 위해 배양세포에 NS398(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), indomethacin(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), salicylate(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), resveratrol(Biomol Research Laboratories, Inc., Plymouth Meeting, PA), 그리고 budesonide, triamcinolone, dexamethasone(Sigma Chemical Co.)를 1시간 동안 전처치한 후 IL-1β(2 ng/ml)를 처치하고 8시간동안 배양하였다. 대조세포군은 처치를 하지 않았고 IL-1β는 PBS, 억제제는 에탄올과 PBS에 용해하였다. 에탄올과 다른 용매의 최종농도는 0.1% 이하로 유지하였다.
   COX-2 점액유전자 분석을 위하여 RT-PCR법을 이용하였고, COX-2 단백질의 분석은 Western-blot법을 이용하였다. 그리고 스테로이드 수용체 길항제인 RU-486을 전처치하여 스테로이드의 억제 작용이 회복되는 것을 관찰하였다.

Western blot에 의한 단백 측정 
   COX-2 단백양을 측정하기 위하여 처치한 배양세포를 PBS로 세척하였다. Trypsin 처리 후 4℃에서 700×g로 침전시켜 침전된 세포를 lysis buffer(50 mM Tris·Cl, pH 8.0, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)로 다시 부유시켰다. 이것을 다시 원심분리를 하여 세척한 다음 상층액을 whole-cell lysate로 보관하였다. 여기서 얻어낸 정량된 단백(50 μg)을 10% SDS-polyacrylamide gel에 주입하여 2시간 동안 20 mA에서 전기영동을 하였다. 분리된 단백은 300 mA로 3시간 동안 나이트로셀룰로오즈막에 이동시킨 후, 5% non-fat milk로 비특이적 단백 결합을 방지하였다. Rabbit polyclonal COX-2 항체(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI)를 1：2,000으로 희석하여 4시간 동안 반응시킨 후, 다시 세척하고 horseradish peroxidase에 결합된 이차항체인 goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase conjugate(Bio-rad Laboratories, Hercules, CA)를 1：5,000으로 희석하여 1시간 동안 반응시켰다. 세 번 세척 후 enhanced chemilluminescence(ECL, Amersham Pharmacia Biotech. Inc., Buckingham Shire, England) 시약으로 X-선 필름으로 감광하여 단백을 확인하였다. Western blot에 의한 단백 측정은 Hsp 70을 대조군으로 이용하였다.

RT-PCR에 의한 COX-2 유전자의 분석 
   총 mRNA를 Tri-Reagent(Molecular Research Center, Cincinnati, OH)를 이용하여 추출하였다. COX-2 mRNA의 측정은 변형된 reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) 방법을 이용하였다.⁸⁾ 총 mRNA를 무작위 hexanucleotide primer들과 Moloney murine leukemia virus(MMLV) reverse transcriptase(Perkin Elmer, Morrisville, NC)를 사용하여 cDNA로 역전사하였다. RT-PCR에 사용한 oligonucleotide primer는 인체 COX-2 유전자의 sense와 antisense를 사용하였다. 인체 COX-2 유전자의 primer 염기서열은 sense는 5'-TTC AAA TGA GAT TGT GGG AAA AT이며, antisense는 3'-AGA TCA TCT CTG CCT GAG TAT CTT이다. PCR 과정은 초기 가열을 95℃에서 3분간 실시한 후 변성은 95℃/1분, 60℃/1분, 72℃/1분간을 34 cycles을 실시하고 신전(extension)은 72℃에서 20분간 실시하였다. PCR의 산물은 50 ng/ml의 ethidium bromide가 들어있는 1% Tris-boric acid-EDTA 완충용매에서 2% agarose gel을 통한 전기영동을 이용하였다. 띠(band)의 정도는 densitometry를 이용하여 분석하였다. Relative density는 대조군의 density를 1으로 하였을때 실험군의 density 값의 비이다.

결     과

IL-1β에 의한 COX-2 유전자와 단백의 발현
   NCI-H292 세포주에서 IL-1β에 의해 COX-2의 생성이 자극되는지를 알아보기 위해 배양된 세포에 IL-1β를 다양한 농도(0.02~20 ng/ml)로 처리하고 8시간 동안 반응시킨 후 COX-2 mRNA 발현과 COX-2 단백의 생성을 관찰하였다. IL-1β의 농도가 20 ng/ml일 때 COX-2의 발현이 최대로 나타났으며(Fig. 1A), IL-1β처리 후 시간경과에 따른 COX-2의 발현 양상은 IL-1β(20 ng/ml) 처리 후 2시간부터 COX-2의 합성이 신속하게 이루어짐을 관찰 할 수 있었다. COX-2 발현양은 IL-1β 처리 후 8시간에 최대치에 도달하였고 12시간까지 유지되었다(Fig. 1B).

NS398과 indomethacin이 IL-1β에 의한 COX-2 발현에 미치는 영향
   IL-1β의 자극에 의한 COX-2의 발현에 NS398과 indomethacin이 어떠한 역할을 하는지 알아보기 위해서 NS398(5 μM)과 indomethacin(20 μM)을 세포에 전처치하고 1시간 뒤 IL-1β(2 ng/ml)를 처리하였다. NS398에 의해서 IL-1β에 의한 COX-2 mRNA 발현과 단백의 생성이 억제되었으나, indomethacin은 IL-1β에 의한 COX-2의 생성을 거의 억제하지 못하였다(Fig. 2).

Resveratrol 및 salicylate가 IL-1β에 의한 COX-2 발현에 미치는 영향
   Resveratrol과 salicylate가 IL-1β에 의한 COX-2의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해서 resveratrol(50 μM)과 salicylate(10 μM)를 세포에 전처치하고 1시간 뒤 IL-1β(2 ng/ml)를 처리하였다. Resveratrol은 IL-1β에 의한 COX-2의 생성을 억제하였으나, salicylate는 억제 효과가 아주 미약하였다(Fig. 3).

Budesonide, triamcinolone, dexamethasone이 IL-1β에 의한 COX-2 유전자와 단백질 발현에 미치는 효과
   IL-1β의 자극에 의한 COX-2의 발현이 부신피질 호르몬에 의해 억제되는지를 알아보기 위해 budesonide(10 nM), triamcinolone(10 nM), dexamethasone(10 nM)를 전처치하고 1시간 뒤에 IL-1β(2 ng/ml)를 투여하여 8시간 동안 반응시켰다. Budesonide, triamcinolone, dexamethasone을 투여한 경우 COX-2 유전자의 발현과 단백 생성이 모두 억제되었으며, 억제정도는 dexamethasone, triamcinolone, budesonide 순으로 억제정도가 강하였다. 한편 스테로이드 수용체 길항제인 RU-486을 전처치한 경우는 COX-2 gene의 expression이 증가되었다(Fig. 4).

고     찰

   음식물로부터 섭취한 linoleic acid는 세포막의 구성성분인 phospholipid ester를 형성하는데, 인체가 여러 가지 물리적, 화학적, 호르몬 또는 체액성 자극(humoral stimulation)을 받으면 세포막의 phopholipase A₂에 의하여 phospholipid ester로부터 arachidonic acid가 유리된다. 이 arachidonic acid는 cyclooxygenase에 의하여 PGH2를 거쳐 PGE₂, PGD₂, PGF_2α, PGI₂, thromboxane A₂로, lipoxygenase에 의해 여러 종류의 leukotriene으로 변환된다. COX에 의해 변환된 상기 산물들은 인체에 혈관확장이나 부종, 발열, 염증반응 등을 유발하게 된다.
   현재까지 cyclooxygenase 경로를 억제하여 염증을 감소시키기 위해 많은 NSAID들이 소개되었고 임상에서도 흔히 사용되고 있으며 그 기전에 따라 COX-1/COX-2 비선택적 억제제, COX-1 선택적 억제제, COX-2 선택적 억제제와 고도의 COX-2 선택적 억제제(highly selective COX-2 inhibitor)로 나누기도 한다.⁹⁾ 그러나 COX 억제제는 종류에 따라, 생체내-외에 따라 그 효과가 다양하다. 또한 호흡기 상피세포에서 IL-1β와 같은 사이토카인으로 COX-2의 발현을 증가시킨 후 COX 억제제의 효과에 대한 연구는 부족한 실정이다. 이에 저자들은 호흡기 상피세포에서 IL-1β에 의해 유도된 COX-2의 발현 양상을 임상에서 직접 사용하고 있는 여러 가지 종류의 COX 억제제를 사용하여 그 억제효과를 관찰하였다.
   이 중 NS398(N-[2-(cyclohexyloxy)-4-nitrophenyl]methane-sulfonamide)은 처음으로 보고된 선택적 COX-2 억제제로, 생체외 실험에서 COX-1에는 아무런 영향 없이 COX-2 활성도만 농도에 비례하여 억제시키고 특히 염증이 생긴 조직에만 특이적으로 반응한다.¹⁰⁾¹¹⁾ 대장암종 세포주인 HT29를 대상으로 한 연구에서 NS398은 COX-2 활성도를 억제하고 PGE₂의 분비를 감소시키지만 COX-2 단백의 합성은 증가시킨다.¹²⁾ 그러나 본 실험에서는 IL-1β에 의해 유도된 인간 호흡기 상피암 세포주인 NCI-H292 세포에서는 COX-2 유전자와 단백의 발현이 NS398에 의해 농도에 비례하여 모두 현저히 감소한 결과를 나타내었으며 이는 선택적 COX-2 억제제인 NS398이 유전자 단계에서 COX-2의 생성을 억제한다는 것을 시사한다. 이러한 결과의 차이는 아마도 실험대상이 되는 세포주나 자극제 사용여부나 혹은 자극제의 종류, 사용되는 시약 등의 차이에서 오는 것으로 생각된다. 그 외 NS398은 A549 폐암세포주와 사람 1547 골육종세포주와 같은 암세포에서는 과다하게 증가된 COX-2 발현을 억제함으로써 apoptosis를 촉진하여 항암작용도 나타낸다.¹³⁾¹⁴⁾ 
   비선택적 COX-1/COX-2 억제제인 indomethacin은 생체외에서 비가역적이고 시간에 비례하여 그 억제작용이 감소한다. 본 실험에서는 indomethacin의 처리농도(20 μM)를 NS398(5 μM)보다 4배 높게 했음에도 COX-2의 발현은 거의 억제하지 못하였다. 이는 indomethacin이 NS398과 같은 선택적 COX-2 억제제에 비해 IL-1β에 의해 호흡기 상피세포에서 유도된 COX-2의 발현을 억제하지 못하는 것을 알 수 있었다.
   한편 resveratrol(3, 4', 5 trihydroxystilbene)은 포도나무와 같은 종자식물이 상처를 입거나 곰팡이에 감염될 때 생성하는 생약물질로 stilbene phytoalexin의 주요 활성 화합물이다. 생물학적으로 다양하게 항염증작용, 항산화작용, 지질대사의 조절, 혈소판의 항응집작용, 혈관확장효과, 항암작용, 에스트로겐호르몬 효과 등이 있는데, 혈소판의 항응집 작용은 resveratrol이 lipoxygenase 경로를 통한 생산물과 proaggregant인 thromboxane B₂의 합성을 억제하여 나타난다.¹⁵⁾ 또 항염증작용은 주로 COX-1과 hydroperoxidase 기능을 억제함으로써 나타내고 protein kinase C(PKC) 신호전달경로도 억제하여 암생성에 중요한 COX-2 유전자의 발현을 감소시킴으로써 항암작용까지도 나타낸다.¹⁶⁾ K562 세포를 이용한 연구에서는 resveratrol이 lipoxygenase와 cyclooxygenase 두 가지 효소 모두의 활성도를 억제하였으며,⁷⁾ murine resident peritoneal macrophage에서는 COX-2의 발현 뿐 아니라 arachidonic acid의 생성도 감소시켜 prostaglandin 합성이 저하된다.¹⁷⁾ 본 실험에서도 resveratrol은 IL-1β에 의한 유도된 COX-2 유전자 발현을 억제하여 이전의 다른 실험과 비슷한 양상이었으며, 이러한 억제작용이 PKC 신호전달 경로를 통하는지 혹은 전사단계에서 일어나는지는 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
   Salicylate의 항염증 작용의 기전은 아직 잘 알려져 있지 않다. Xu 등¹⁸⁾은 사람의 내피세포와 섬유모세포에서 치료농도(10^-5~10^-4 mol/L)의 salicylate가 COX-2 전사를 억제하여 COX-2 mRNA와 단백생성을 감소시킨다고 하였다. 반면에 Mitchell 등¹⁹⁾은 인간 폐상피 세포주인 A549를 이용한 연구에서 IL-1β에 의해 증가된 COX-2의 활성도가 salicylate의 농도에 비례하여 억제되었으나, 이는 salicylate가 COX-2 mRNA 및 단백발현을 억제시켜 나타나는 것이 아니라, COX-2의 활성부위에 salicylate가 arachidonic acid와 경쟁적으로 반응하여 나타나는 결과라고 하였다. 그 외 쥐를 통한 연구에서 salicylate가 COX-2의 발현과는 관계없이 효소 활성도를 억제함으로써 항염증작용을 나타낸다고 하였다.²⁰⁾ 본 연구에서는 salicylate가 COX-2의 단백생성을 거의 억제하지 못 하였다. 아마도 이러한 결과는 Mitchell 등의 결과와 유사한 것으로 생각된다. 한편 Xu 등¹⁸⁾의 연구에서는 salicylate가 COX-2 단백생성 자체를 억제하였다.
   부신피질호르몬은 기관지천식에서의 염증반응 조절에 우선적으로 선택되는 약제로서 세포질 내에 있는 부신피질호르몬 수용체를 통해 유전자를 전사단계에서 조절한다. 국소적 분무제로 사용되고 있는 부신피질호르몬인 fluticasone, budesonide, triamcinolone은 COX-1과 phospholipase A₂에는 영향을 주지 않고 COX-2의 활성을 현저하게 감소시킨다.⁶⁾ 부신피질호르몬의 종류에 따라 COX-2 발현 억제나 phospholipase A₂ 활성도 억제는 RU-486에 의하여 복원된다.⁵⁾ 본 실험에서는 3가지 부신피질호르몬 모두가 IL-1β에 의한 COX-2 유전자 발현과 단백생성을 억제하였는데, 역시 부신피질호르몬 수용체 길항제인 RU-486에 의해 budesonide의 억제 작용이 복원되었다. COX-2를 억제하는 정도는 dexamethasone이 가장 강한 것으로 나타났는데, COX-2에 대해 더 강력한 억제작용을 가진 부신피질 호르몬을 선별하기 위해서 좀더 다양한 제제를 이용한 실험이 필요할 것으로 생각된다.
   이상의 결과를 종합해 보면 NCI-H292 세포에서 IL-1β에 의해 유도되는 COX-2의 발현이, COX-2에 선택적인 억제제인 NS398과 antioxidant이며 COX 억제작용이 있는 resveratrol에 의해 그 생성이 억제되었다. COX-1/COX-2 비선택적 억제제인 indomethacin과 COX-1 선택적 억제제인 salicylate는 IL-1β에 의해 유도된 COX-2 발현의 억제는 아주 미약하거나 없었다.

결     론

   NCI-H292 세포주에서 IL-1β에 의한 COX-2의 유전자와 단백의 발현은 NS398, resveratrol, 그리고 부신피질호르몬에 의해 억제됨을 알 수 있었다. 이상의 결과로 보아 COX-2 억제 작용이 있는 기존의 항염증제들은 각각의 물질에 따라 그 효과가 다르며 이러한 다른 효과는 실험대상의 세포주와 다양한 환경에 따른 억제 정도가 다른 것으로 생각된다. 따라서 항염증제에 따른 COX-2의 억제작용에 대한 더 많은 연구가 이루어 진다면 향후 염증성 호흡기 질환의 치료에 많은 도움이 될 것으로 기대된다.

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