서     론

   기도 점액층은 기도 표피 세포의 물리적인 보호와 먼지, 세균, 바이러스 등을 흡착시켜서 mucociliary clearance를 하는 역할을 하고 있다.¹⁾ 천식이나 만성 기관지염, 섬유성낭종 같은 만성 기도 염증 질환에서는 점액물질 발현 세포의 변화를 동반하며 이는 점액성 물질의 과분비를 초래하는 것으로 알려져 있다.^2-5) 점액성 물질의 과분비는 기도의 물리적인 장애를 초래하며 그로 인한 mucociliary clearance 역할을 효과적으로 하지 못하면서 이차적인 만성 감염을 유발한다. 이와 같이 인체 기도의 많은 만성 염증 질환들의 주 병적 소견은 점액성 분비물의 과분비(hypersecretion)이다.⁶⁾⁷⁾ 점액성 분비물의 과분비는 분비물의 대다수를 차지하는 당단백질인 점액의 과분비를 의미한다.⁸⁾ 그러므로 만성 기도 질환에서의 감염에 의한 점액 유전자의 전사조절은 새로운 치료법의 개발에 가장 중요한 위치를 차지하고 있다. 최근 많은 연구자들이 감염에 의한 점액 유전자들의 발현 조절에 관심을 가지고 연구가 진행되고 있다.^9-17) 그러나 점액 유전자는 지금까지 12개가 밝혀져 있으며 그들의 유전자가 각기 다른 조절을 받으며 다른 생리학적 역할을 수행하는 것으로 보여서 연구의 진행을 어렵게 하고 있다. 저자들은 많은 점액 중에서 감염에 의해 유전자 발현 증가를 보이는 점액 유전자가 질환에 관여하는 병적 점액(pathological mucin)이라는 논리적인 가설 하에 다양한 염증 매개체에 의한 점액 유전자들의 발현을 살펴본 결과 mucin gene 8(MUC8) 유전자가 염증 매개물질들에 의해서 가장 뚜렷하게 증가를 보이는 유전자임을 밝힌 바 있다.¹⁸⁾¹⁹⁾ MUC8 유전자는 아직 cDNA 그리고 유전자가 클로닝 되지 않았으며 전사조절에 대한 생화학적, 분자 생물학적 특성에 대해서 알려져 있지 않은 실정이다.
   모든 세포들은 세포외의 특정 신호를 인지하고 특정 전사 인자를 활성화하여 특정 유전자의 발현을 증가 또는 감소시키는 전사 조절을 한다. 특히 mitogen-activated protein(MAP) kinase family는 세포내의 신호 전달 매개체로서 핵심적인 단백질이며 인체에서의 다양한 염증 반응, 사멸, 세포 분화, 성장 등의 세포외 신호에 반응하여 활성화되어 전사인자를 활성화 시켜 필요한 유전자들의 전사를 조절한다.²⁰⁾ MAP kinase family는 extracellular signal regulated kinase(ERK), c-jun NH2 terminal kinase(JNK)/stress-activated protein kinase(SAPK) 그리고 p38 MAP kinase 등 3가지 subfamily가 알려져 있다. 이들의 역할은 각각 다른 신호에 의해 공통적 또는 독자적으로 조절되며 세포의 종류에 따라서도 각기 다른 조절 양상을 보이는 복잡한 체계이다. ERK의 경우는 세포의 성장과 밀접한 관계를 보이고 있으며 많은 세포 성장 인자에 의해서 조절 받고 있으며 과발현 또는 과활성될 경우 세포의 암을 유발하는 원인이 된다.²¹⁾ JNK/SAPK와 p38 MAP kinase의 경우는 대부분의 염증 반응, 세포 스트레스 신호, 세포 사멸 신호 등과 밀접한 관계가 있다.²²⁾ 이와 같은 MAP kinase와 점액유전자 조절과의 상관관계에 대한 보고는 전무한 상태이지만, 최근의 보고에 따르면 oxidative stress에 의한 epidermal growth factor receptor의 활성은 ERK의 활성으로 이어지며 이와 같은 일련의 신호 전달 과정은 MUC5AC의 전사를 유도한다는 보고가 있다.¹⁰⁾ 또한 섬유성 낭종에서 Pseudomonas aeruginosa에 의한 MUC2의 발현 유도에도 ERK가 관여한다는 보고가 있다.¹³⁾ 하지만 비용 상피세포에서 과발현 양상을 보이는 MUC8에 대한 신호 전달 연구는 아직까지 보고되고 있지 않다. 본 실험에서는 염증 매개물질들에의한 MUC8 유전자의 전사 증가가 어떤 subfamily의 MAP kinase 신호 전달을 경유해서 이루어지는 지를 밝히고자 하였다.

재료 및 방법

세포 배양법

   인체 정상 코점막 상피세포는 반투막성 막(Transwell-clear Costar Corp. Cambridge, MA, USA)에서 air-liquid interface(ALI) 배양법을 사용하였으며 사용한 배양액은 bronchial epithelial growth media(Clontics Corp. San Diego, CA, USA)와 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) 1：1 혼합액을 기본으로 호르몬과 각종 성장인자가 첨가된 배양액을 사용하였다.

MUC8 유전자의 전사량 조사
   MUC8 의 합성 유도를 위해서는 passage-2의 인체 정상 코 점막 상피 세포 배양액에 LPS(μg/ml), IL-1β(10 ng/ml), TNF-α(10 ng/ml)를 각각 처리한 후 24시간 후에 total RNA를 TRiZol agent를 사용하여 추출한 다음 역전사반응을 실시하여 single stranded cDNA를 얻었다.¹⁸⁾ 합성된 cDNA는 MUC8의 특이적 primer(sense：5'-ACA GGG TTT CTC CTC ATT G-3'；antisense：5'-CGT TTA TTC CAG CAC TGT TC-3')로 증폭하였다. 증폭에 사용된 cDNA의 양적인 보정을 위해서 β2 microglo-bulin 유전자를 특이 primer(Sense：5'- GCT TAC ATG TCT CGA TCC CAC TTA A-3'；antisense：5'-CTC GCG CTA CTC TCT CTT TCT GG-3')를 이용하여 증폭하였다.¹⁸⁾ P38 MAP kinase 저해시의 MUC8의 합성 유도를 살펴보기 위해서는 위와 동등한 조건의 세포에 LPS, IL-1,β TNF-α를 처리하기 전에 p38 MAP kinase의 특이적인 저해재인 SB 203580(40 μM)을 4시간 처리 후 같은 방법으로 RT-PCR을 실시하였다. 본 실험에서 사용한 SB 203580 농도는 세포에 영향을 주지 않으며 특이적으로 p38 MAP kinase를 저해하는 농도로 잘 알려져 있다.²³⁾

MAP kinase activity assay
   MAP kinase 활성 유도는 passage-2의 인체 정상 코 점막 상피 세포 배양액에 LPS , IL-1β, TNF-α를 각각 처리한 후 0, 15, 45분 후에 세포를 PBS로 세척한 후 SDS-PAGE sample buffer로 용해하여 5분간 끊여서 준비하였다. MAP kinase family의 활성도 측정은 활성화 때 인산화 되는 잔기(ERK의 경우 Thr²⁰²/Tyr²⁰⁴ 잔기, SAPK/JNK의 경우는 Thr¹⁸³/Tyr¹⁸⁵ 잔기 그리고 p38의경우는 Thr¹⁸⁰/Tyr¹⁸²) 에 특이적으로 반응하는 인산화 특이 항체(New England Biolab, Inc., Beverly, MA, USA)를 이용하여 측정하였다. 이와 같은 활성화 form specific한 특이 항체를 이용하는 활성도 측정 방법은 기존의 in vitro complex kinase assay와 동일한 것으로 알려져 있다.²²⁾ sample간의 양적 보정을 위하여 α-tubulin antibody를 사용하여 Western blot을 시행하였다. Western blot은 기존의 방법과 동일하게 시행하였다.²¹⁾²²⁾

결     과

염증 매개체에 의한 MAP kinase의 활성

   정상 기도 상피 세포에서 MUC8의 활성을 유도한다고 알려져 있는 염증 매개 물질들에 의한 MAP kinase family들의 활성을 알아보기 위하여 세포에 LPS, IL-1β, TNF-α로 각각 처리한 후 0, 15, 45분에 활성도를 측정하였다(Fig. 1). 그 결과 염증 매개 물질에 의한 MAP kinase family의 활성은 ERK의 경우 LPS, IL-1β, TNF-α에 의해서 각기 비슷한 정도로 활성됨을 알 수 있었으며 자극 후 15분 후에 최고치를 이루며 점차 감소함을 알 수 있었다. p38 MAP kinase의 경우는 매우 큰 폭으로 증가하였다. 특이한 점은 LPS에 의해서는 적어도 이시간대에는 매우 작은 양의 p38이 활성화 되며 반면에 TNF-α에 의해서는 자극 후 15분 후에 매우 큰 폭으로 활성화되어 그후 점차 감소함을 볼 수 있었다. IL-1β의 자극 실험에는 TNF-α와 비슷하였으나 자극이 45분까지 지속됨을 관찰할 수 있었다. SAPK/JNK 그룹의 MAP kinase는 전혀 증가하지 않았다. 이와 같은 실험은 정상 기도 상피 세포가 각기 다른 염증 매개 물질에 의해서 MAP kinase subgroup들이 각기 다르게 활성화된다는 것을 보여준다. 특히 정상 코점막 상피세포에서의 p38 MAP kinase 는 염증 매개체에 의해서 가장 큰 폭으로 활성화되는 kinase로서 정상 기도 상피 세포에서의 염증 매개 신호 전달에 관여할 가능성을 암시하고 있다.

p38 MAP kinase가 MUC8 유전자의 전사유도에 미치는 영향

   위의 실험에서 MUC8을 증가시킬 수 있는 염증 매개체인 IL-1β나 TNF-α가 p38 MAP kinase를 큰 폭으로 활성화하는 사실을 알 수 있었다. 그러면 IL-1β나 TNF-α에 의한 p38 MAP kinase의 활성이 궁극적으로 MUC8의 발현 조절에 어떤 영향을 미치는지를 알아보기 위하여 IL-1β나 TNF-α에 의한 MUC8 mRNA의 증가를 정상조건과 p38 MAP kinase의 활성을 저해하는 조건에서 RT-PCR로 조사하여 보았다. 이 실험에는 MAP kinase family중에서 p38 MAP kinase만을 특이적으로 저해하는 SB203580 이라는 화학 물질를 사용하였다.²³⁾ 대조군에서는 SB203580을 용해시키는데 사용된 DMSO를 같은 양 처리하여 실험에 이용하였다. 실험 결과 정상조건(DMSO 만 전처리한 조건)에서는 IL-1β나 TNF-α는 예상대로 MUC8의 전사를 일정량 증가시키지만, 놀랍게도 SB203580이 전 처리된 실험에서는 IL-1β나 TNF-α에 의한 MUC8 유전자의 전사 증가가 현저히 늘어나는 것을 알 수 있었다(Fig. 2). 특이한 점은 SB203580만 처리된 세포에서도 MUC8의 합성이 상당하게 올라가는 것으로 관찰되어서 basal level의 p38 MAP kinase의 활성이 평상시 세포에서 MUC8의 합성을 저해하고 있는 것으로 생각된다. 이 결과로 IL-1β나 TNF-α에 의한 MUC8 유전자의 전사 증가에는 p38 MAP kinase의 활성이 negative regulator라는 사실을 알 수 있었다.

고     찰

   점액 단백질의 면역학적 역할은 기도에 침입하는 감염체로부터의 물리적 방어 벽을 형성하는 것으로 알려져 있다. 감염 시에는 점액단백질의 분비를 증가시킴으로써 기도 세포를 보호하고 있다. 그러나 만성 감염시의 점액 단백질의 과발현은 이차적 감염을 가중시키며 여러 기도 질환을 야기한다.^2-5) 이와 같이 점액유전자 발현의 조절 연구는 과발현기전에 대한 이해는 물론 이를 이용한 치료적 응용에도 매우 큰 의미가 있다. 특히 MUC8 유전자는 비용 상피세포에서 과발현이 발견되고¹⁹⁾ 배양된 정상 기도 상피 세포에서 감염 매개체에 의해서 가장 많이 발현 조절을 받는 점액 유전자이므로¹⁸⁾ MUC8 유전자의 전사 조절 기전은 질병에서의 점액 과발현을 이해할 수 있는 핵심이 된다고 생각된다. 현재 저자들은 아직 알려져 있지 않은 점액유전자의 분자적 클로닝을 실시하고 있으며 여기서 나오는 MUC8 유전자의 전사 조절 요소들은 앞으로 점액 유전자의 과발현에 의한 질병들을 근본적으로 이해하는데 큰 도움이 될 것으로 생각된다. 본 실험에서는 면역 매개물질에 의한 MUC8 유전자의 발현이 어떤 신호 전달 과정을 통하여 조절되는가를 알아보기 위하여 먼저 염증 매개체에의한 MAP kinase family의 활성도를 측정하였으며, 실험결과 p38 MAP kinase가 정상 기도 상피세포에서 염증 매개체에 의해서 가장 큰 폭으로 활성화됨을 알 수 있었다. 또한 SB203580을 이용한 실험에서 IL-1β나 TNF-α에 의한 MUC8 유전자의 전사 유도에는 p38 MAP kinase 활성은 negative regulator로 작용한다는 사실을 알 수 있었다. 이상의 결과로 MUC8 유전자의 전사 조절에 p38 MAP kinase가 관여한다는 것을 알 수 있다. MUC5AC의 경우에는 epidermal growth factor receptor 가 관여한다고 알려져 있으며 TGF-α 처리시에 MUC5AC의 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있다.¹¹⁾ 그러나 본 실험에서 사용된 염증 매개물질인 TNF-α 단독에 의해서는 거의 변화가 없다고 알려져 있다. Epidermal growth factor receptor 신호 전달은 일반적으로 ERK에 의해서 매개된다고 알려져 있으므로 MUC5AC의 경우도 ERK 신호 전달을 매개할 가능성이 매우 높은 것으로 생각된다. 실제로 최근 보고에 따르면 oxidative stress에 의한 ligand-independent 한 epidermal growth factor receptor경유의 MUC5AC 발현 증가가 ERK의 up-stream kinase인 MEK의 특이적 저해제인 PD98059에 의해서 저해되는 것으로 알려져 있다.¹⁰⁾ 또한 MUC2의 경우도 ERK 신호 전달이 관여한다고 알려져 있다.¹³⁾ 이 결과는 MUC2와 MUC5AC의 발현은 ERK 신호 전달에 의해서 매개되는 것으로 보이며 이는 MUC8의 신호 전달 과정과 매우 다르며 독립적인 기전에 의해서 각기 조절되고 있음을 보여준다. 이들 유전자들의 조절 기전이 다르다는 것은 이들 유전자들의 생리학적 기능도 다르다는 것을 간접적으로 암시한다. 본 실험에서 사용한 염증 매개 물질의 경우에는 ERK도 미약하게 활성화하지만 ERK 활성이 MUC8 활성에도 직접적으로 중요한가는 앞으로 MEK의 특이적 저해제인 PD98059를 사용한 실험으로 조사해 보아야할 것이다. MUC8의 경우는 MUC5AC와는 달리 주로 세포의 염증 반응 신호 전달로 잘 알려져 있는 p38 MAP kinase의 활성이 필수적인 것으로 보여지지만 p38 MAP kinase의 역할이 MUC2와 MUC5AC에서의 ERK의 역할처럼 전자 인자를 조절하여 전사를 증가시키는 역할보다는 전사 증가의 저해 역할을 한다고 생각한다. 앞으로 MUC8 유전자의 promoter region을 이용하여 만든 reporter construct와 여러 MAP kinase의 dominant-negative construct를 작성하여 cotransfection을 통한 reporter assay를 이용하여 p38 MAP kinase 신호 전달과 MUC8 유전자 조절의 상관관계를 좀 더 심도 있게 연구할 수 있을 것으로 생각한다.

결     론

   결론적으로 염증 반응에 의한 MUC8 유전자 전사 유도는 p38 MAP kinase 신호 전달과정을 통해서 억제되며 이에 대한 보다 심도 깊은 이해는 MUC8 유전자 전사 조절 기전의 분자학적 이해는 물론 점액과분비 관련 질병의 이해와 치료에 도움이 될 것으로 생각한다.

1. Takishima T, Shimura S. Airway secretion: Physiological bases for the control of mucous hypersecretion. New York: Marcel Dekker Inc;1994.

2. Fahy JV, Steiger DJ, Liu J, Basbaum CB, Finkbeiner WE, Boushey HA. Markers of mucus secretion and DNA levels in induced sputum from asthmatic and from healthy subjects. Am Rev Respir Dis 1993;147:1132-7.

3. Thurlbeck WM. Small airways disease. Hum Pathol 1973;4:150-2.

4. Takizawa T, Thurlbeck W. Muscle and mucous gland size in the major bronchi of patients with chronic bronchitis, asthma and asthmatic bronchitis. Am Rev Respir Dis 1971;104:331-6.

5. Sperber K, Goswami SK, Gollub E, Mayer L, Marom Z. Mucus secretagogue production by a human macrophage hybridoma. J Allergy Clin Immunol 1991;87:490-8.

6. Shimura S, Andoh Y, Haraguchi M, Shirato K. Continuity of airway goblet cells and intraluminal mucus in the airways of patients with bronchial asthma. Eur Respir J 1996;9:1395-401.

7. Aikawa T, Shimura S, Sasaki H, Ebina M, Takishima T. Marked goblet cell hyperplasia with mucus  accumulation in the airways of patients who died of severe acute asthma attack. Chest 1992;101:916-21.

8. Yoon JH, Park IY. Mucin gene expression and mucin secretion in human airway epithelium. Rhinology 1998;36:146-52.

9. Dabbagh K, Takeyama K, Lee HM, Ueki IF, Lausier JA, Nadel JA. IL-4 induces mucin gene expression and goblet cell metaplasia in vitro and in vivo. J Immunol 1999;162:6233-7.

10. Takeyama K, Dabbagh K, Jeong SJ, Dao-Pick T, Ueki IF, Nadel JA. Oxidative stress causes mucin synthesis via transactivation of epidermal growth factor receptor: Role of neutrophils. J Immunol 2000;164:1546-52.

11. Takeyama K, Dabbagh K, Lee HM, Agusti C, Lausier JA, Ueki IF, et al. Epidermal growth factor system regulates mucin production in airways. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96:3081-6.

12. Longphre M, Li D, Gallup M, Drori E, Ordonez CL, Redman T, et al. Allergen-induced IL-9 directly stimulates mucin transcription in respiratory epithelial cells. J Clin Invest 1999;104:1375-82.

13. Li JD, Feng W, Gallup M, Kim JH, Gum J, Kim Y, et al. Activation of NF-kappa B via a Src-dependent Ras-MAPK-pp90rsk pathway is required for Pseudomonas aeruginosa-induced mucin overproduction in epithelial cells. Proc Natl Acad Sci USA 1998;95:5718-23.

14. Li D, Gallup M, Fan N, Szymkowski DE, Basbaum CB. Cloning of the amino-terminal and 5'-flanking region of the human MUC5AC mucin gene and transcriptional up-regulation by bacterial exoproducts. J Biol Chem 1998:273:6812-20.

15. Shankar V, Pichan P, Eddy RL Jr, Tonk V, Nowak N, Sait SN, et al. Chromosomal localization of a human mucin gene (MUC8) and cloning of the cDNA corresponding to the carboxy terminus. Am J Respir Cell Mol Biol 1997;16:232-41.

16. Fischer BM, Rochelle LG, Voynow JA, Akley NJ, Adler KB. Tumor necrosis factor-alpha stimulates mucin secretion and cyclic GMP production by guinea pig tracheal epithelial cells in vitro. Am J Respir Cell Mol Biol 1999;20:413-22.

17. Bernacki SH, Nelson AL, Abdullah L, Sheehan JK, Harris A, William Davis C, et al. Mucin gene expression during differentiation of human airway epithelia in vitro. Muc4 and muc5b are strongly induced. Am J Respir Cell Mol Biol 1999;20:595-604.

18. Yoon JH, Kim KS, Kim HU, Linton JA, Lee JG. Effects of TNF-alpha and IL-1 beta on mucin, lysozyme, IL-6 and IL-8 in passage-2 normal human nasal epithelial cells. Acta Otolaryngol 1999;119:905-10.

19. Kim SS, Kim KS, Lee JG, Park IY, Koo JS, Yoon JH. Levels of intracellular protein and messenger RNA of mucin and lysozyme in normal human nasal and polyp epithelium. Laryngoscope 2000;110:276-80.

20. Davis RJ. The mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J Biol Chem 1993;268:14553-6.

21. Kim SC, Hahn JS, Min YH, Yoo NC, Ko YW, Lee WJ. Constitutive activation of extracellular signal-regulated kinase in human acute leukemias: Combined role of activation of MEK, hyperexpression of extracellular signal-regulated kinase, and downregulation of a phosphatase, PAC1. Blood. 1999;93:3893-9.

22. Han SJ, Choi KY, Brey PT, Lee WJ. Molecular cloning and characterization of a Drosophila p38 mitogen-activated protein kinase. J Biol Chem 1998;273:369-74.

23. Cuenda A, Rouse J, Doza YN, Meier R, Cohen P, Gallagher TF, et al. SB203580 is a specific inhibitor of a MAP kinase homologue which is stimulated by cellular stresses and interleukin-1. FEBS Lett 1995;364:229-33.