| Changes of the Secretion and Morphology on Normal Human Nasal Epithelial Cells by Interleukin-1beta. |
| Kyung Su Kim, Joo Heon Yoon, Jin Woo Choi, Jeung Gweon Lee, Hyoung Jin Moon, Jun Ho Park, Hee Sun Chun |
| Department of Otorhinolaryngology, Institute of Logopedics and Phoniatrics, Yonsei University College of Medicine, Seoul, Korea. ydent@yumc.yonsei.ac.kr |
| Interleukin-1β에 의한 사람 정상 코점막 상피세포의 분비기능 및 형태 변화 |
| 김경수 · 윤주헌 · 최진우 · 이정권 · 문형진 · 박준호 · 전희선 |
| 연세대학교 의과대학 이비인후과학교실, 음성언어의학연구소 |
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| 주제어:
사람 정상 코점막 상피세포ㆍIL-1βㆍMucinㆍLysozyme. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Interleukin (IL)-lbeta is one of proinflammatory cytokines with an active role in acute nd chronic inflammation of airway mucosa. The present study was undertaken to find out the changes in the amount of released mucin and lysozyme by immunoblot assay which are the main constituents of airway secretion, to see if there were any changes in the mRNA expression of mucin and lysozyme genes by reverse transcription-polymerase chain reaction, and also to observe the morphologic changes of IL-1beta treated the normal human nasal epithelial (NHNE) cells by scanning and transmission electron microscopy.
MATERIALS AND METHODS:
NHNE cells were cultured using air-liquid interface technique and on the plating day 12, IL-lbeta 10 ng/ml was added and the cells were cultured for 24 hours. Afterwards the media and cells in the insert were harvested.
RESULTS:
The secretion of mucin and lysozyme didn't change significantly after the stimulation with IL-1beta and there was no significant difference between the control group and IL-1beta treated group in mRNA expression of MUC2, 5AC, 5B and lysozyme genes whereas MUC8 mRNA was significantly increased by IL-1beta stimulation. Electron microscopic findings revealed no significant differences between these two groups.
CONCLUSION:
The stimulation with IL-1beta alone in the differentiation stage couldn't induce changes in the secretory function and morphology of NHNE cells, but could enhance the expression of MUC8 mRNA. Therefore, the further study on the pathologic changes of NHNE cells by the combined actions of various inflammatory mediators should be followed. |
| Keywords:
Normal human nasal epithelial cellㆍIL-1betaㆍMucinㆍLysozyme |
서론
기도상피는 병원균과 독소에 대한 구조적 방어작용을 하며, 외부물질에 대해 점막 섬모가 이를 제거하는 청결작용을 한다. 한편 기도상피는 인체 방어기구의 역할을 수행하는 점액성 분비물과 비점액성 분비물을 생성하는데, 점액으로 대표되는 점액성 분비물과 면역글로불린, 락토페린, 리소자임, 단백 분해효소 억제자(protease inhibitor) 등의 비점액성 분비물 등을 분비 한다.1)
또한 최근에 알려진 바에 따르면 여러 염증 유발물질과 사이토카인들이 염증반응시 또는 자극에 의해 기도 상피세포에서 분비되어 염증반응에 관여하여 기도 상피세포가 염증반응을 조절하는 조절자로서의 역할을 한다고 밝혀졌다.2)
IL-1β 유전자는 사람에서 염색체 2번에 존재하며, 상피세포, 결체조직 세포, 신경원 세포, 백혈구 등에서 생성된다. IL-1β의 전구물질은 31 kDa으로 IL-1β 변환 효소에 의해 성숙형으로 변하여 세포밖으로 분비되어 고유한 수용체인 IL-1β 수용체에 결합하여 기능을 발휘하게 된다. 수용체와의 결합은 picomole 농도에서도 발생하며, T와 B 임파구, 중성구, 결체조직, 섬유아세포, 연골아세포, 상피세포, 내피세포 등에서 수용체의 존재가 증명되었다.3) IL-1β는 수용체에 결합한 후 T 세포의 활성화, IL-2 및 수용체의 유도, 콜라젠 분해효소와 prostaglandin의 증강, B 전구세포 및 B 세포의 분화 자극 및 증식, 면역글로부린의 생성, 유착분자(adhesion molecule)의 유도, 세포재생, 발열작용 등 염증반응에 관여한다.4)
또한 코점막의 급, 만성 염증반응에 코점막 상피세포에서 IL-1β가 분비되어 염증반응에 관여한다는 여러 증거가 제시되고 있다.5)6) 그러나 IL-1β에 의해 코점막 상피세포 자체가 영향을 받을 가능성에 대한 연구는 미흡하여 IL-1β에 의해 코점막 상피세포에 어떤 구조상의 변화가 초래되는 가에 대해서는 문헌고찰상 알려진 바가 없었다. 또한 코점막 상피세포의 주요기능인 점액 및 면역관련물질 분비작용에 대한 지금까지의 연구는 사람 정상 기관지 상피세포나 상피세포주를 이용한 연구가 대부분으로 주로 분비를 증강시키는 혈소판 활성인자나 prostaglandin F 2α와 연관된 작용에 촛점을 맞추어 간접적인 분비 변화 혹은 이차적 매개체의 증가 여부가 중점적으로 연구되어 왔을 뿐5) 현재까지 IL-1β에 의한 사람 정상 코점막 상피세포의 분비능 변화에 대한 연구는 문헌고찰상 찾을 수 없었다.
이에 연구자들은 IL-1β에 의한 사람 정상 코점막 상피세포의 형태학적 변화를 살펴보고 아울러 상피세포의 점액성 분비물 중 중요한 성분인 점액과 장액성 분비물 중 대표적인 리소자임의 분비에 대한 영향을 알고자 하였다. 이를 위해 첫째, IL-1β를 배양된 사람 정상 코점막 상피세포에 첨가 배양하여 배양시간에 따라 점액과 리소자임의 분비량이 어떻게 변화하는지 알고자 하였으며 둘째, 분비물에 가장 많은 변화를 일으키는 첨가 배양시간동안 배양시 점액과 리소자임 mRNA 발현 양상을 보고자 하였다. 셋째, 전자현미경을 이용하여 코점막 상피세포에 형태 변화가 초래되는지, 만약 변화가 생긴다면 어떤 변화인가를 관찰하고자 하였다.
재료 및 방법
사람 정상 코점막 상피세포의 Air-liquid interface 배양
사람 정상 코점막 상피세포(normal human nasal epithelial cells)는 Yoon 등7)의 방법으로 배양하여 2차 계대배양시켰다. 이 중 10 5개의 세포를 3.0 mg/ml의 제1형 콜라젠젤(Collaborative Res., New Bedford, MA)로 덮힌 반투과성막(Transwell-clear, Costar Corp., Cambridge, MA)에 평판하였다. 배양액은 호르몬과 각종 성장인자가 첨가된 무혈장 배양액(Table 1)을 사용하였다. 세포들은 첫 7일간은 배양액에 잠긴 상태로 두며 air-liquid interface를 만드는 7일까지 위 및 아래 부분을 모두 격일로 갈아주었다. 그후 배양액은 아래쪽 부분만 매일 교환해 주며 위쪽은 배양액을 제거하여 공기에 노출시켰다. 배양은 37℃, 5% CO 2에서 진행하였다.
IL-1β 첨가시 배양 시간에 따른 점액 및 리소자임 분비의 면역적 검출 및 정량
Air-liquid interface 방법으로 세포를 배양할 경우 평판 16일째 최고 정상기(plateau phase)에 이르러 분비 기능 및 성장이 정점에 달하므로7) 이 시기 이전인 평판 12일에 실험을 하였다.
IL-1β 첨가배양 시간에 따른 점액과 리소자임 분비 변화를 보기 위해 IL-1β 10 ng/ml를 12, 24, 48시간 동안 첨가 후 배양하여 세포상층에서 부유액(supernatant)을 채취하였다.
배양된 사람 정상 코점막 상피세포에서 분비물 측정을 위한 방법은 immunoblot assay를 이용하는 Gray 등8)이 기술한 방법을 사용하였다. 순수 인체점액(generous gift from Dr. Davis CW, University of North Carolina, NC)과 리소자임(Sigma, St. Louis, MO)을 표준으로 사용하였다. 점액에 대한 일차항체로는 단클론항체인 H6C5(1：1,000, generous gift from Dr. Davis)를, 리소자임에 대한 일차항체로는 다클론 리소자임 항체(1：1,000, DAKO, Capintera, CA)를 사용하였다. 배양된 세포에서 채취된 준비물과 표준들은 일정한 비율로 희석하여 나이트로셀룰로즈막에 적용하여 일차항체와 반응시킨 후 horseradish peroxidase conjugated goat anti-mouse IgG 혹은 anti-rabbit IgG에 반응시켰으며 chemiluminescence(ECL kit, Amersham, Buckingamshire, UK)로 발광시켰다. 이후 표준곡선을 직선회귀분석을 이용하여 그린 후, 각 검사물의 발색정도와 비교하여 정량하였다. 리소자임 항체의 특이성은 Western blot으로 확인하였다. 각 군에서 배양된 세포들의 수는 세포들을 트립신 처리하여 단세포로 만든 후 hemocytometer에 의해 측정하였다. 각 실험결과는 같은 실험을 3번 이상 시행하여 평균±표준편차로서 나타냈으며 통계학적 처리는 Student's t-test로 하였다.
IL-1β 첨가시 점액과 리소자임 mRNA 발현 검출을 위한 reverse transcription polymerase chain reaction
위의 방법으로 실험시 24시간 동안 배양하였을 때 점액 분비가 다른 시간에 비해 증가하는 결과를 보여 아래의 실험은 24시간 동안 첨가 후 배양하여 시행하였다. 총 RNA를 세포들에서 Tri-Reagent(Molecular Research Center, Cincinnati, OH)를 이용하여 분리하였다.
점액과 리소자임 mRNA 발현이 Northern blot에 의해 신뢰성있는 결과가 나오지 않아 Guzman 등9)이 보고한 reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) 방법을 이용하였다.
Oligonucleotide primers는 사람
MUC2(Genbank accession # L21998, 5'primer：
TGCCTGGCCCTGTCTTTG；3' primer：
CAGCTCCAGCATGAGTGC),
MUC5AC(Genbank accession # U06711, 5' primer：
TCCGGCTCATCTTCTTCC；3' primer：
ACTTGGGCACTGGTGCTG),
MUC5B(Genbank accession #Z73496, 5' primer：
ACTCCAGAGACTCTCCACAC；3' primer：
TACCACTGGTCTGTGTGCTA),
MUC8(Genbank accession #U14383, 5' primer：
ACAGGGTTTCTCCTCATTG；3' primer：
CGTTTATTCCAGCACTGTTC),
사람 리소자임(Genbank accession #J03801, 5' primer：CTCTCATTGTTCTGGGGC, 3' primer：ACGGACAACCCTCTTTGC)에 대해 이미 발표된 염기배열을 이용해 MUC 2는 440 bp, MUC5AC는 680 bp, MUC5B는 338 bp, MUC8는 239 bp, 리소자임은 350 bp로 cDNA 조각을 구성하였다. RT-PCR
의 조절유전자 (control gene)로서 β2 microglobulin(β2 M) oligonucleotide amplimers는 335 bp를 만드는데 Clontech Lab.(Palo Alto, CA)으로부터 구입하였다. RT-PCR은 Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler를 이용해 시행하였으며 간단히 방법을 소개하면 총 RNA(1 μg/20 μl reaction volume)를 random hexanucleotide primers와 Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase를 이용해 cDNA로 역전사시켰다. 점액과 리소자임을 위해서는 역전사 반응의 40%, β2M에는 4%를 사용해 각 0.2 mM의 primers를 이용해 증폭시켰다. PCR에서 MgCl 2의 적당한 농도를 최적화한 후 변성은 95℃에서 1분간, 소환온도는 리소자임은 55℃, MUC2, MUC5AC 및 β2M은 60℃에서 1분간, 신장은 72℃에서 1분간 시행하였다. PCR 산물은 50 ng/ml ethidium bromide를 함유하는 2% Seakem agarose gel(FMC, Rockland, ME)에서 전기영동으로 분리하여 폴라로이드 55 필림으로 사진을 찍었다.
상기 기술된 각 배양조건에서 각 유전자의 mRNA 발현을 비교하기 위해 비교역학분석(comparative kinetic analysis)를 시행하였다. PCR의 직선범위는 PCR 횟수당 발현강도를 정량하여 정하였다. MUC2의 직선범위는 27∼35 회, MUC5AC는 32∼40회, MUC5B는 23∼29회, MUC8 은 32∼40회, 리소자임은 25∼30회, β2M은 26∼30회에서 얻어졌다. 최종 산물이 mRNA로부터 생기고 genomic DNA의 오염이 없었다는 것을 증명하기 위해 역전사 반응에서 역전사 효소를 생략하므로써 음성대조군으로 삼았으며 RT-PCR의 특이성은 PCR 조각의 염기서열화(dsDNA Cycle Sequencing System, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD)에 의해 확인하였다.
IL-1β 첨가시 주사 및 투과 전자 현미경 관찰
10 ng/ml IL-1β를 평판 12일째 24시간 동안 첨가 후 배양하여 세포를 고정한 다음 전자현미경적 관찰을 하였다.
주사 전자현미경 관찰을 위해서 콜라젠젤 위에 배양된 상피세포를 2.5% glutaraldehyde에 4℃에서 4∼6시간 고정한 후 0.1M phosphate buffer로 세척하였다. 1% osmium tetroxide에 1시간 동안 다시 고정한 다음 2% tannic acid에 4℃에서 밤새 처리한 후 다시 1% OsO 4에 30분간 고정하였다. 탈수과정을 거쳐 임계점 건조(critical point drying) 시킨 후 gold coating하여 관찰하였다.
투과 전자현미경 관찰을 위해서는 콜라젠젤 위에 배양된 상피세포를 2.5% glutaraldehyde에 4℃에서 4∼6시간 고정한 후 0.1M phosphate buffer로 세척하였다. 1% osmium tetroxide에 1시간 다시 고정한 다음 탈수시키고 Epon 812에 포매하였다. 포매된 조직을 80 nm 두께로 썰어 uranyl acetate에 실온에서 6분, lead citrate에 실온에서 3분간 염색하여 관찰하였다.
결과
IL-1β 첨가시 배양 시간에 따른 점액 및 리소자임 분비
평판 12일째 배양된 사람 정상 코점막 상피세포에 IL-1β 10 ng/ml를 첨가하고 각각 12시간, 24시간, 48시간 동안 배양 후 IL-1β를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 점액과 리소자임 분비량의 변화를 알아보았다.
점액 분비량은 첨가 후 12시간 동안 배양시 대조군 19.8 ±1.2 μg/10 6세포, 첨가군 23.3±2.0 μg/10 6세포(17.7% 증가)였고, 24시간 동안 배양시 대조군 29.5±1.6 μg/10 6세포, 첨가군 36.4±1.8 μg/10 6세포(20.0% 증가)였으며, 48 시간동안 배양시 점액의 양은 대조군 32.4±1.5 μg/10 6세포, 첨가군 37.9±1.5 μg/10 6세포(16.9% 증가)였다(Table 2).
리소자임 분비량은 12시간동안 배양시 대조군 0.33±0.05 μg/10 6세포, 첨가군 0.28±0.03 μg/10 6세포(15.2% 감소)였고, 24시간동안 배양시 대조군 0.31±0.07 μg/10 6세포, 실험군 0.26±0.03 μg/10 6세포(16.1% 감소)였으며, 48 시간동안 첨가배양시 대조군 0.25±0.06 μg/10 6세포, 첨가군 0.24±0.04 μg/10 6세포(4.0% 감소)이었다(Table 3).
이상의 결과들은 점액과 리소자임 분비량 모두에서 대조군과 비교시 모든 배양 시간에서 통계적으로 의의있는 변화를 보이지 않았다.
IL-1β 첨가시 점액과 리소자임 mRNA 발현
IL-1β 10 ng/ml를 첨가하고 24시간 동안 배양한 후 MUC2, MUC5AC, MUC5B, MUC8 등의 점액 mRNA와 리소자임 mRNA 변화를 RT-PCR을 이용하여 측정하였다.
IL-1β를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 IL-1β 첨가군에서 MUC2, MUC5B 그리고 MUC5AC는 발현에 유의한 차이를 보이지 않았다. MUC8의 경우 IL-1β 투여시 의의있게 강한 발현을 보였다. 리소자임 mRNA 발현은 대조군과 첨가군간에 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 1).
IL-1β 첨가시 주사 및 투과 전자 현미경 소견
평판 12일째 IL-1β 10 ng/ml를 첨가후 24시간동안 배양한 다음 주사 및 투과 전자현미경으로 관찰하였다.
IL-1β를 첨가하지 않은 대조군의 평판 13일째 주사 전자현미경 소견상 미세융모로 덮인 분비상피세포가 관찰되었으며 분비상피세포 사이로 섬모상피세포가 관찰되었다. 섬모상피세포는 성장과정중의 섬모가 있었으며 분비상피세포보다 세포의 크기가 대체로 작았다. 한편 분비상피세포는 다양한 크기를 보였고 전반적으로 섬모상피세포보다 컸으며 표면에는 미세융모로 덮여 있었다(Fig. 2A). IL-1β를 첨가한 경우 전반적으로 미세융모로 덮인 분비상피세포와 성장중인 섬모상피세포가 관찰되며 섬모의 파괴나 소실 또는 분비상피세포의 증가 등의 염증 소견은 보이지 않아 대조군과 유사한 모습이었다(Fig. 2B).
투과전자현미경상 IL-1β를 첨가하지 않은 대조군의 경우 크기가 일정치 않은 기다란 형태의 세포들이 주로 관찰되었는데 세포 표면에 미세융모가 있고 세포질내 분비과립이 보이므로 분비상피세포로 생각되었다. 세포내 분비과립은 다양한 크기로 존재하였으며 과립의 수도 일정치 않았다. 분비과립은 전자 투과밀도성의 과립과 불투과밀도성의 과립이 존재하였다(Fig. 3A). IL-1β를 첨가한 경우 기다란 형태의 세포가 대조군과 유사한 양상으로 관찰되었으며 전자 투과밀도성과 불투과밀도성의 분비과립이 관찰되어 대조군과 차이를 보이지 않았다(Fig. 3B).
고찰
과분비 현상은 비염, 부비동염, 중이염, 알레르기성 비염, 만성 기관지염 및 낭포성 섬유증 등의 여러 호흡기 질환에서 보이는 흔한 합병증이다. 이러한 현상은 상피조직에 의해 능동적으로 이루어지며 최근 연구에 의하면 사이토카인과 여러 염증성 매개체, 성장인자, 세포외 기질 등이 상피조직의 분비에 관여한다고 한다.10)11) 이에 본 연구에서는 대표적인 염증유발 사이토카인으로 알려진 IL-1β가 사람 정상 코점막 상피세포의 분비에 미치는 영향을 알고자 하였다.
본 연구에서 IL-1β의 농도는 10 ng/ml를 사용하였다. 정상 생체의 농도는 혈청의 경우 0.1∼4.0 pg/ml(평균 0.5 pg/ml)이며, 비즙내 농도는 2∼12 pg/ml이다.12) 실험적으로 IL-1β를 생체에 투여하여 발열을 일으키는 농도는 10 ng/kg, 저혈압은 100 ng/kg이며 최대 허용농도는 300 ng/kg로 밝혀져 있고, 3) 이 농도를 체중 60 kg의 경우로 환산하면 대략적인 혈청농도는 발열은 0.5 ng/ml, 저혈압 5 ng/ml, 최대 허용농도 15 ng/ml이므로 실험농도를 10 ng/ml를 고려하였다. 또한 문헌고찰상 기도상피세포에서 IL-1β를 이용한 실험의 경우 5∼20 ng/ml의 농도를 사용하여 분비물을 측정하였다. 2)5) 이에 사람 정상 코점막 상피세포의 분비기능에 대한 IL-1β의 역할을 연구하기에 가능하다고 생각되는 10 ng/ml의 농도로 실험을 시행하였다.
본 실험에서 이용된 air-liquid interface 배양법은 세포의 분비기전을 연구하기에 유용한 방법으로 10 5개의 세포를 평판하여 배양시 16일째 2×10 6개의 세포수를 보여 최대 성장을 하며 이후 세포수는 plateau를 형성한다고 한다. 7) 대개의 경우 세포가 최고 정상기를 형성하게 되면 성장기에 비해 각 세포당 분비기능이 떨어지므로 실험은 이 시기 이전에 하였으며 실험결과상 전자현미경 소견으로 평판 13일째 배양된 코점막 상피세포의 세포내에는 전자투과밀도와 불투과밀도의 분비과립이 존재하였다. 생체내 분비세포의 경우 전자투과밀도의 분비과립이 우세한 양상으로 존재하나 본 실험에서는 이용된 세포의 분화가 완성되지 않은 상태이므로 상기 소견으로 보이는 것으로 생각되었다. 또한 평판 13일째 배양된 세포는 아직 섬모가 완전히 형성되지 않았는데 이는 섬모상피세포는 배양 12∼14일째부터 면역조직화학적 검사상 검출이 되므로,7) 13일째에 섬모가 발달중인 상태로 미성숙된 것은 정상적인 성장과정으로 생각한다.
IL-1β 투여에 의해 배양된 사람 정상 코점막 상피세포는 주사 전자 현미경상 대조군과 차이를 보이지 않았다. IL-1β는 염증유발 사이토카인이므로 이것에 의해 염증양 소견 즉, 섬모의 손실, 분비상피세포의 증가 등이 유발될 가능성이 있는데 본 연구는 성장과정중인 13일째 세포를 관찰하였으므로 섬모의 파괴나 분비상피세포의 증가 등을 명확히 관찰하기 어려웠다. Floating법으로 배양한 사람 코점막 상피세포의 경우 분화 및 성장이 완성된 시기인 floating 14일째 TNF-α 1 ng/ml를 48시간 동안 첨가배양시 형태학적 변화가 야기된다고 한다.13) 이러한 결과에서 보듯 유사한 종류의 염증유발 사이토카인인 IL-1β에 의해서도 분화와 성장이 완성된 시기인 평판 18일7) 이후 실험할 경우 염증과 유사한 변화가 가능하다고 생각되나 이점에 대해서는 추가 연구가 필요하리라고 본다.
투과전자현미경 소견상 분비과립의 증가소견이나 전자투과밀도의 변화 등이 관찰되지 않아 정상 대조군과 차이를 보이지 않았다. 저자들은 연구과정중 분비과립수와 투과밀도에 따른 과립수 등을 조사하고자 하였는데 세포마다 과립의 숫자가 일정하지 않고 또한 과립의 크기도 상이하여 측정이 어려웠다. 또한 전자현미경 소견을 정량화 하는 작업이 실제적으로 난점이 많아 이를 통계처리 하지는 못하였다.
실험결과상 점액의 분비는 IL-1β 첨가배양 시간에 관계없이 통계학적으로 의의있는 변화를 보이지 않았다. 이런 결과는 실험대상인 세포에 따라 상이한 결과를 보일 수 있다는 점을 감안하더라도 하기도 상피세포의 경우 IL-1β에 의해 점액분비가 증가한다는 연구들과 다른 결과를 보였다.5)10)
이러한 차이가 가능한 이유로 첫째, IL-1β의 역할을 연구한 대부분의 연구10)14)는 정상적인 세포를 대상으로 하더라도 배양액중의 혈청을 제거하여 세포에 영양결핍을 초래하고 사이토카인을 주는 방법을 채택한 것이 하나의 이유로 생각된다. 즉, 정상적인 세포를 정상적인 배양액에서 배양시에는 세포의 항상성(homeostasis) 때문에 본 실험의 결과처럼 세포가 IL-1β에 의해 의의있는 점액의 분비 증가가 초래되지 않을 가능성이 있다고 생각된다.
두번째 가능성으로 같은 상피세포라도 상기도와 하기도의 상피세포가 기능적으로 다를 가능성을 생각할 수 있다. 섬유아세포의 경우 장기에 따라 또는 같은 장기라도 부위에 따라 기능이 상이하다고 한다. 15) 이런 측면에서 해부학적으로 구분된 장기에 존재하는 상피세포간에 이형질이 가능하리라 생각된다. 기도상피세포의 경우 MUC 유전자의 발현이 상기도와 하기도에서 다르다는 것이 증명되었다.16) 즉 MUC2, MUC5B mRNA는 기관상피세포에서는 발현이 되지만 배양된 정상 사람 코점막 상피세포에서는 발현이 약하며, 또한 MUC7 mRNA는 정상 사람 코점막 상피세포에서는 약하게 발현되지만 기관상피세포에서는 강하게 발현되었다. 이러한 연구결과에서 보듯 기도 상피세포간에 상기도와 하기도의 구분에 따른 이형질이 가능하며 이런 이형질에 의해 IL-1β에 의한 표현이 다르다고 생각되었다.
세 번째로 IL-1β에 의해 점액분비가 증가하지 않을 가능성은 IL-1β 자체만으로는 점액분비를 자극하기에 불충분할 가능성이다. 이러한 가능성은 연골세포에서 IL-1β와 TNF-α를 복합투여한 경우 prostaglandin의 생성이 증가한다는 보고와 유사한 결과이다.17) 즉 생체내에서는 여러 사이토카인에 의해 반응이 일어나므로 단독투여 자체로는 생물학적 반응을 일으키기가 어렵다고 생각되었다. 향후 연골세포에서의 연구처럼 TNF-α를 복합투여한 경우 증가할 가능성이 있으므로 이에 대한 연구가 필요하다고 본다.
리소자임의 분비에 대해서 본 실험에서는 IL-1β를 투여시에는 감소하는 소견으로 대조군과 비교하여 유의한 결과를 보이지 않았다. 이러한 결과에 대하여 장액성 분비물 성분인 리소자임의 경우 호중구 엘라스타제나 어떤 분비물질이 리소자임 단백질의 분비를 촉진한다는 것이외에 점액에 비해 아직 알려진 바가 거의 없으므로18) 본 실험결과만으로는 설명이 불가능하다고 생각되며 향후 이에 대한 연구가 필요하리라 생각된다.
IL-1β에 의해 점액 단백질의 분비는 증가하지 않았으나 실험에 이용된 점액 유전자중 MUC8의 발현이 의의있게 증가하였다. 현재까지 점액 유전자는 9개가 보고되었으며 각각에 대해 많은 연구가 행해지고 있다.11) 이 중 연구자는 4종류의 유전자만을 조사하였는데 그 이유로 MUC2, MUC-5AC와 MUC5B 등은 호흡기에 존재하는 주요 유전자로 특히 MUC5AC mRNA는 사람 기관의 배세포에서 유래한다.11) 또한 사람 기관상피의 배세포와 점막하 분비선에서 MUC8이 발현된다고 한다.19) 이런 이유로 호흡상피세포에 주요한 4종류의 MUC 유전자를 조사하였다. 실험결과상 MUC8이 증가하였는데 이에 대한 해석은 본 연구로 불가능하며 더욱이 사람 코점막의 경우 발현되는 부위에 대해서 in situ hybridization을 통한 연구가 없는 실정으로, 현재 MUC8 유전자에 대해서는 발현 증가나 감소에 대해 많은 연구가 진행중으로 이에 대해 추가적인 연구가 필요하다고 본다.
결론
사람 정상 코점막 상피세포를 air-liquid interface법으로 배양하여 정상적인 배양조건하에서 평판 12일째 10 ng/ml의 IL-1β를 첨가하여 24시간 동안 배양한 결과, 대조군에 비해 점액과 리소자임의 분비는 의의있는 변화를 보이지 않았으나, MUC mRNA 발현에서는 MUC8은 의의있게 증가하였다. 그러나 다른 MUC 유전자 및 리소자임은 유의한 차이를 보이지 않았다. 또한 전자현미경 소견상 대조군과 의의있는 변화를 보이지 않았다. 이상의 결과에서 IL-1β가 세포 분화기에 단독으로는 정상 사람 코점막 상피세포에 분비기능 및 형태면에서 변화를 야기하지 못한다는 것을 알 수 있었다. 그러나 추가적으로 사이토카인 복합투여에 의한 분비기능 변화 연구가 필요하다고 생각되며 이를 통해 생체에서와 같은 다양한 염증성 매개체의 복합작용에 의한 병적 변화 여부를 검증할 수 있으리라 추측된다.
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