교신저자：박종성, 501-746 광주광역시 동구 학동 5번지 전남대학교 의과대학 생리학교실
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서     론

   뇌간의 전정핵군은 말초 전정기관, 소뇌, 망상핵(reticular nucleus), 청반(locus coeruleus) 그리고 배봉선핵(dorsal raphe nucleus)과 같은 뇌간의 신경핵으로부터 다양한 신경성 정보를 주고받는다. 특히 전정핵은 외안 신경핵과 경근과 사지근의 신경핵에 이차 축삭을 보냄으로써 전정안구반사, 전정경반사, 전정사지반사와 같은 자세 조절 반사를 일으키는 것으로 알려져 있다.¹⁾²⁾
   5-Hydroxytryptamine(5-HT)은 중추 신경계에서 주로 뇌간의 배봉선핵에서 유리되며 통각전달, 수면 그리고 운동 기능의 조절에 관여한다. 해부학적으로 전정핵은 배봉선핵과 연결되어 있으며 배봉선핵의 신경 활성도 변화에 의하여 전정핵의 흥분 발화율이 조절되는 것으로 보고 되었다. 그리고 면역조직화학 염색법을 이용한 형태학적 연구에 의하면 5-Hydroxy tryptaminergic terminal이 전정핵군에 고르게 분포하고 있으며, 전정핵군에서 5-Hydroxytryptamine 수용체 아형인 5-HT_1A와 5-HT₂가 존재하고 있다.³⁾⁴⁾
   현재까지 전정핵 뉴론을 대상으로 5-Hydroxytryptamine이 이 뉴론에 미치는 영향을 규명한 연구는 extracellular recording이나 intracellular recording을 이용한 방법이 대부분이었으나,⁵⁾⁶⁾ 전정핵 뉴론의 막전압 변화를 관찰하고 이에 미치는 5-Hydroxytryptamine의 영향을 관찰한 연구는 아직까지 없다. 이에 본 연구는 current clamp하 whole cell patch clamp 실험을 이용하여 분리된 흰쥐의 전정핵 뉴론의 자발적 활동전위에 미치는 5-Hydroxytryptamine의 효과를 관찰하였다.

재료 및 방법

내측 전정핵 뉴론의 분리
   생후 14~16일 사이의 Sprague-Dawley 흰쥐에서 Kay와 Wong⁷⁾의 방법에 의하여 내측 전정핵 뉴론을 분리하였다. 흰쥐를 ether로 마취한 후, 두피 및 두개골을 제거하고 전정핵이 위치하는 뇌간과 소뇌 부위를 적출하였다. 적출한 조직은 95% O₂/5% CO₂로 포화된 인공 뇌척수액(4℃)에 보관하고, 뇌조직 절편기(Vibroslice, WPI)를 사용하여 400 μm의 두께로 관상면으로 절단하여 내측 전정핵이 포함된 뇌절편(brain slice)을 만들었다.
   뇌절편은 실온의 배양 용액에서 1시간 이상 배양한 다음 단백 분해효소인 pronase(Sigma Co.)와 thermolysin(Sigma Co.)을 이용하여 각각 0.2 mg/ml 농도에서 효소처리 과정을 거쳤다. 효소처리가 끝난 절편은 다시 실온의 배양액 속에서 배양하면서 내측 전정핵 부위는 흰쥐 brain atlas를 참조하여 21 G 주사침으로 천공하여 얻었고, 이를 역상도립현미경 위의 용기에 옮긴 후 작은 피펫을 이용하여 단일 세포로 분리하였다. 분리된 전정핵 뉴론은 용기의 바닥에 가라앉아 안정화된 다음에 자발적 활동전위를 기록하였다.

용액의 조성 및 시약
   배양액의 조성(mM)은 124 NaCl, 5 KCl, 1.2 KH₂PO₄, 1.3 MgSO₄, 2.4 CaCl₂, 10 Glucose, 24 NaHCO₃ 등으로 구성되었으며, 칼륨전류를 기록하기 위한 세포외 용액은 5 KCl, 124 NaCl, 1.4 MgSO₄, 26 NaHCO₃ 2.5 CaCl₂, 1 NaH₂PO₄, 11 Glucose, pH 7.4로 하였고, 세포내 용액은 122.5 K⁺-gluconate, 17.5 KCl, 8 NaCl, 10 HEPES, 0.5 EGTA(ethylene glycol-bis(β-aminoethylether)-N, N, N', N'-tetraacetic acid), 4 Mg-ATP이며 pH는 7.3으로 하였다. 5-HT에 대한 내측 전정핵 뉴론의 반응은 5-HT를 세포외 용액에 해당 농도로 녹인 후, 중력을 사용한 관류장치를 이용하여 기록용 용기내로 순환시킬 때의 활동전위의 변화를 관찰하였다.
   본 실험에서 사용한 약물은 Sigma사(St. Louis, USA)제품을 사용하였다.

이온 전류의 측정 
   분리 전정핵 뉴론에서 Hamil 등⁸⁾의 whole-cell patch clamp 방법을 이용하여 내측 전정핵 뉴론의 자발적 활동전위를 기록하였다. 기록용 전극은 미세 유리 전극 제조기(Narishige, 일본)와 microforge(Narishige, 일본)를 이용하여 저항이 3-5 megaohom이 되도록 제작하였다. 막전류 고정과 막전압 측정은 Axopatch 200B patch clamp amplifier(Axon, 미국)를 이용하며 Digidata 1200B(Axon, 미국) interface를 통하여 컴퓨터와 연결하였다. 실험결과 얻어진 활동전위 기록 및 자료 분석은 pClamp 8 software(Axon, 미국)를 사용하였으며, 전류는 10 kHz로 여과하며, series resistance는 Axopatch 200B patch clamp amplifier의 series resistance compensation circuit를 이용하여 보상하였다.

실험결과 분석
   본 실험에서는 총 12마리의 흰쥐를 사용하였으며, 이들 동물에서 분리된 전정핵 뉴론 중 반응이 명확한 15개 세포에서 얻은 결과를 통계처리 하였다. 실험측정치는 Student's t-test로 통계학적 분석을 시행하고 p<0.05과 p<0.01를 유의성의 기준으로 삼았으며 평균±표준오차(standard error)로 표시하였다.

결     과

   내측 전정핵 뉴론 중 세포체의 크기가 비교적 크고 세포막이 매끄러우며 세포체의 경계가 분명하여 미세전극으로 접근하여 기록하기가 용이한 뉴론들을 대상으로 실험을 시행하였다. 5-HT를 처치한 전정핵 뉴론은 일정한 반응을 보이지 않고, 전체 15개의 전정핵 뉴론에 대한 실험 중 10개에서는 대조군에 비하여 자발적 활동전위가 증가하는 반응을 나타내었고 나머지 3개에서는 감소, 2개에서는 반응이 나타나지 않았다.
   본 연구에서는 자발적 활동전위가 흥분적 반응을 보이는 전정핵 뉴론의 안정막 전압, spike 간격, 후과분극(afterhyperpolarization) 그리고 발화율을 분석하였다. Current clamp 하에 의하여 기록된 내측 전정핵 뉴론의 자발적 활동전위는 규칙적이었으며, 20 μM 5-HT에 의하여 자발적 활동 전위는 증가하는 반응을 나타내었다(Figs. 1 and 2).

5-HT가 내측 전정핵 뉴론의 활동전위 안정막 전압에 미치는 효과
   전정핵 뉴론의 안정막 전압은 -48.24±1.41 mV(n=10)이었으며, 10 μM 5-HT에 의하여 -47.44±1.37 mV, 그리고 20 μM 5-HT에 의하여 -45.63±1.66 mV로 통계적으로 유의하게(p<0.01) 탈분극 되었다(Fig. 3A). 

5-HT가 내측 전정핵 뉴론 활동전위 spike 간격에 미치는 효과
   전정핵 뉴론의 자발적 활동전위의 spike 간격은 4.13±0.42 msec이었으며 이는 10 μM 5-HT에 의하여 4.80±0.46 msec, 그리고 20 μM 5-HT에 의하여 4.53±0.38 msec로 변하였으나 통계적으로 유의성은 없었다(Fig. 3B).

5-HT가 내측 전정핵 뉴론의 후과분극 크기에 미치는 효과
   후과분극의 크기는 활동전위 발생 후 막전위가 안정막 전압 이하로 감소하는 정도로 측정하였다. 전정핵 뉴론의 후과분극은 11.52±0.58 mV에서 5-HT 10, 20 μM에 의하여 각각 10.23±0.66 mV(p<0.05), 9.67±0.66 mV(p<0.01) 등으로 통계적으로 유의하게 감소하였다(Fig. 3C).

5-HT가 내측 전정핵 뉴론 발화율에 미치는 효과
   전정핵 뉴론의 발화율은 6.30±0.55 spikes/sec로서, 10 μM 5-HT에 의하여 6.55±0.55 spikes/sec로 증가하였으며 20 μM 5-HT에 의하여 7.93±0.69 spikes/sec로 통계적으로 유의하게(p<0.01) 증가하였다(Fig. 3D).

고     찰

   말초 전정기관은 신체에 가해지는 각가속이나 선가속을 감지하며 두부의 위치를 지각하는 기능을 가지고 있으며, 말초에서 발생한 정보는 뇌간의 상, 하, 내, 외측의 전정핵으로 전달된다. 이들 전정핵군 중 내측 전정핵은 가장 크고 주요한 기능을 영위하고 있는데 여기에는 다양한 신경전달 물질들이 관여하고 있다. 즉 1차 전정 뉴론에서는 glutamate가 유리되어 전정핵에 작용하며, 반대측 전정핵과 소뇌에서 들어오는 뉴론에서는 GABA가 유리되고, 청반신경으로부터 noradrenaline, 배봉선핵에서는 5-HT가 유리되는 등 내측 전정핵 뉴론의 신호전달에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.⁹⁾
   중추신경계에서 시상 뉴론,¹⁰⁾ suprachiasmatic nucleus 뉴론,¹¹⁾ dopamine이나 serotonin과 같은 monoamine 전달물질을 유리시키는 뉴론,¹²⁾¹³⁾ 해마와 대뇌 그리고 소뇌 피질의 GABA성 개재뉴론,¹⁴⁾¹⁵⁾ 뇌간의 전정핵 뉴론 등과 같은 특정 뉴론들은 활동전압의 자발적 발화를 보이고 있다. 이들 뉴론의 흥분성에 직접적인 영향을 미치는 것은 칼륨 채널로서 일반적으로 칼륨 채널은 막전압을 조절하고 활동전압의 모양과 그 흥분 발화율을 변화시킴으로써 흥분도를 조절하는 것으로 알려져 있다. 신경세포에서 칼륨 채널이 열리면 과분극되어 흥분도가 감소하고 칼륨 채널이 닫히면 탈분극되어 그 흥분도가 증가하는 것이다.¹⁶⁾
   전정핵 뉴론의 자발적 발화는 두 가지 타입으로 나눠지는데, 폭이 넓은 활동전위와 하나의 큰 후과분극이 특징인 type A와 초기 빠른 후과분극과 후기 느린 후과분극에 의해 폭이 좁은 활동전위를 가진 type B 전정핵 뉴론으로 구분되어진다.¹⁷⁾ 5-HT가 전정핵의 발화율에 미치는 영향을 규명한 연구는 많은 연구자들에 의하여 이루어졌다. Johnston과 Murnion 등¹⁸⁾은 생체내에서 전정핵에 주입된 5-HT에 의하여 변화된 발화율을 전기이온영동적 방법으로 관찰한 연구에서 82%에서 흥분 발화율의 증가를 일으켰으며 이는 5-HT₂ 수용체 길항제인 ketanserin이나 ritanserin에 의하여 억제되는 반응을 나타내었고, 10%에서는 흥분 발화율이 감소하며 나머지 8%에서는 양측성 반응(biphasic response)을 나타내었다. 이는 내측 전정핵에서 5-HT 두 가지 유형의 수용체가 있으며 이 두 가지 수용체에 의하여 나타나는 효과가 상반됨을 의미하고 있다.
   최근 Jeong 등¹⁹⁾은 5-HT가 내측 전정핵 뉴론의 칼륨 전류에 미치는 영향을 보고한 바 있다. 5-HT는 내측 전정핵 뉴론의 전압의존성 칼륨 전류를 증가시키거나, 억제시키는 두 가지 상반된 반응을 일으키는데, 이때 증가 반응은 5-HT₁ 수용체 작동제인 5-carboxamidotryptamine에 의하여 유발되었으며, 억제 반응은 5-HT₂ 수용체의 작동제인 5-α-methylhydroxytryptamine에 의하여 유발되었다. 이는 5-HT가 내측 전정핵 뉴론 내 5-HT 수용체 아형에 따라 상반된 반응을 보이는 것으로 해석된다.
   내측 전정핵 뉴론을 분리하여 각각 독립된 단일세포를 대상으로 한 본 실험에서는, 67%는 흥분성 반응을 나타내었고 20%는 흥분 발화율 감소를 보이며 나머지 13%는 반응을 보이지 않았다. 이와 같은 실험결과는 상기한 John과 Murnion 등¹⁸⁾의 연구결과와 차이가 나는데, 이는 John과 Murnion 등이 전정핵이 소뇌나 반대측 전정핵 등 중추신경계의 다른 부위와 연결이 된 상태에서 5-HT의 반응을 기록한 반면, 본 실험에서는 이와 같은 연결성이 끊어진 상태에서 순수하게 전정핵 뉴론의 반응을 관찰한 실험 조건상의 차이 때문이라 사료된다. 그리고 본 실험에서 자발적 활동전위가 흥분적 반응을 보이는 경우 5-HT가 전정핵 뉴론의 안정막 전압은 탈분극 시켰으며 후과분극의 크기도 감소시킴으로써 자발적 활동전위의 발화율을 증가시킴을 알 수 있었다.
   최근 Jeong 등²⁰⁾은 5-HT₂ 수용체 작동제인 5-α-methylhydroxytryptamine이 내측 전정핵 뉴론의 활성도에 미치는 영향을 보고한 바 있다. 이에 따르면 5-α-methylhydroxytryptamine은 전정핵 뉴론의 calcium 의존성 칼륨 채널을 억제함으로써 전정핵 뉴론의 후과분극을 변형시켜 뉴론의 활성을 증가시키는 것으로 보고되었다. 이는 본 실험에서 5-HT에 대하여 증가반응을 보이는 뉴론이 나타내는 작용기전과 유사하다고 생각된다.

결     론

   5-HT에 대하여 흥분적 반응을 보이는 내측 전정핵 뉴론은 막전압이 탈분극 됐으며 후과분극의 크기는 감소함으로써 자발적 발화율이 증가하였다.

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