교신저자：박종성, 501-746 광주광역시 동구 학동 5번지  전남대학교 의과대학 생리학교실
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서     론

   뇌간의 전정핵군은 상, 하, 내, 외측의 4개의 전정핵으로 이루어져 있다. 이들 전정핵군은 전정성 반사의 센타로서 기능하고 있으며, 말초 전정의 세반고리관과 이석기를 통하여 들어오는 각가속이나 선가속에 관한 감각정보를 받아들여 처리하는 것으로 알려져 있다. 이들 전정핵군은 말초 전정성 정보 뿐 아니라, 소뇌에서 들어오는 정보나 경부의 고유수용기(propriocepter)에서 들어오는 정보, 그리고 시각정보와 뇌간의 특정핵에서 들어오는 감각정보를 처리하고 있다.¹⁾
이와 같은 전정핵의 신경신호 처리에는 다양한 신경전달물질들이 관여하고 있다. 즉, 1차 전정 뉴론에서 유리되는 glutamate가 주요한 신경전달물질로서 작용하고 있으며, 반대측 전정핵과 소뇌에서 들어오는 뉴론에서 유리되는 GABA나, 청반(locus coeruleus)으로부터의 noradrenaline, dorsal raphe nucleus에서 투사되는 뉴론에서 유리되는 5-hydroxytryptamine(5-HT), 그리고 기시되는 부위의 해부학적 위치는 밝혀져 있지 않지만 glycine이나, opioid 등도 전정핵, 특히 내측 전정핵 뉴론의 신호전달에 주요한 역할을 하고 있다.²⁾³⁾
   뇌간에 위치하는 dorsal raphe nucleus는 간뇌, 대뇌피질 그리고 척수와 연결되어 있으며 5-HT를 신경전달물질로 사용하여 수면, 통각전달, 운동의 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다. 현재까지 5-HT의 수용체로는 7개의 각기 다른 아형(subtype)이 발견되었으며 5-HT 수용체는 ligand-gated chloride 채널인 3형 5-HT(5-HT₃)를 제외하고는 G-단백에 매개되어 있는 수용체이다.⁴⁾
   Li 등⁵⁾은 마취된 흰쥐 외측 전정핵에 이온영동적 방법으로 5-HT를 주입하면 신근의 근활동성이 증가되는 반면 굴근의 근활동성이 감소되는 것을 보고 하였으며, 2A형 5-HT(5-HT_2A) 수용체의 길항제인 ketanserin에 의하여 이러한 효과들이 소실되는 것을 보고함으로써 전정척수반사의 조절에 5-HT가 관여하고 있음을 보고한 바 있다. 
   5-HT가 전정핵 뉴론의 흥분 발화율(firing rate)에 미치는 영향을 규명한 연구에 의하면 전정핵군의 신경핵에 따라 다른 반응을 보이고 있으며 같은 신경핵 내에서도 상이한 반응은 보이고 있음을 알 수 있다.⁶⁾⁷⁾ Li 등⁸⁾은 glutamate에 의하여 증가된 전정핵 뉴론의 신경활동성이 5-HT에 의하여 변형되는 것을 관찰하였는데 2/3에서 감소되었으며 1/3에서는 증가되었다고 보고하였다. 이러한 감소효과는 5-HT₂ 수용체의 agonist인 alpha-methyl-5-hydroxytryptamine에 의하여서도 비슷하게 나타난 반면 증가효과는 1A형 5-HT(5-HT_1A) 수용체의 agonist인 8-OH-DPAT에 의하여 비슷하게 나타났다. 그러나 Amano 등⁹⁾에 의하면 흰쥐 내측 전정핵 뉴론 중 lateral roll tilting 자극에 대하여 반응을 보이는 뉴론은 5-HT_1A 수용체의 agonist인 tandospirone에 의하여 억제되었으며 이러한 효과는 이 수용체의 길항제인 WAY-100635에 의하여 상쇄되었다. 
   신경세포의 여러 가지 이온 채널 중에서 칼륨 채널은 나트륨 채널과 함께 막전압 조절에 가장 중요한 채널로 특히 활동전압의 모양과 활동전압의 흥분 발화율을 변화시킴으로써 세포의 흥분도를 조절하며, 일반적으로 칼륨 채널이 열리면 세포는 과분극되어 그 흥분도가 감소하고 칼륨 채널이 닫히면 세포는 탈분극되어 그 흥분도가 증가한다.¹⁰⁾ 본 연구는 흰쥐 내측 전정핵 뉴론을 대상으로 patch clamp method를 이용하여 5-HT가 신경 활성도에 주요한 역할을 하는 칼륨 전류에 미치는 영향을 밝히고자 한다.

실험방법

내측 전정신경핵 세포의 분리
   생후 14~16일 사이의 Sprague-Dawley 흰쥐에서 Kay와 Wong¹¹⁾의 방법에 의하여 내측 전정핵 신경세포를 분리하였다. 흰쥐를 ether로 마취한 후, 두피 및 두개골을 제거하고 전정핵이 위치하는 뇌간과 소뇌 부위를 적출하였다. 적출한 조직은 95% O₂, 5% CO₂로 포화된 인공 뇌척수액(4℃)에 보관하고, 뇌조직 절편기(Vibroslice, WPI)를 사용하여 400 μm의 두께로 관상면으로 절단하여 내측 전정핵이 포함된 뇌절편을 만들었다. 뇌절편은 실온의 배양 용액에서 1시간 이상 배양한 다음 단백 분해효소인 pronase(Sigma Co.)와 thermolysin(Sigma Co.)을 이용하여 각각 0.2 mg/mL 농도에서 효소처리 과정을 거쳤다. 효소처리가 끝난 절편은 다시 실온의 배양액 속에서 배양하면서 내측 전정핵 부위는 흰쥐 뇌지도(Fig. 1)를 참조하여 21 G 주사침으로 천공하여 얻었고 이를 도립현미경(inverted microscope) 위의 실험용기에 옮긴 후 작은 피펫을 이용하여 단일 세포로 분리하였다. 분리된 세포는 용기의 바닥에 가라앉아 안정화 된 다음에 세포전류를 기록하였다.

용액의 조성 및 시약
   배양액의 조성(mM)은 124 NaCl, 5 KCl, 1.2 KH₂PO₄, 1.3 MgSO₄, 2.4 CaCl₂, 10 Glucose, 24 NaHCO₃ 등으로 구성되었으며, 칼륨 전류를 기록하기 위한 세포외 용액(mM)은 3 KCl, 140 Choline-Cl, 2 MgCl₂, 2 CaCl₂, 10 HEPES (N-[2-hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid], 30 Glucose, pH 7.4로 하였고, 세포내 용액(단위；mM)은 140 KCl, 2 MgCl₂, 0.1 CaCl₂, 10 HEPES, 0.1 EGTA(ethylene glycol-bis(β-aminoethylether)- N, N, N', N'-tetraacetic acid), 2 Mg-ATP이며 pH는 7.3으로 하였다. 세포에 대한 약물 투여는 중력을 이용한 관류장치를 이용하여 용기내 용액을 순환시켰다. 본 실험에서 사용한 약물은 Sigma사(St. Louis, USA)제품을 사용하였다. 

이온 전류의 기록 
   분리 전정핵 뉴론에서 Hamill 등¹²⁾의 whole-cell patch clamp 방법을 이용하여 칼륨 전류를 기록하였다. 기록용 전극은 미세 유리 전극 제조기 (Narishige, Japan)와 microforge(Narishige, Japan)를 이용하여 저항이 3-5 MΩ이 되도록 제작하였다. 막전압 고정과 전류의 측정은 Axopatch 200 B patch clamp 증폭기(Axon, USA)를 이용하여 Digidata 1200 B(Axon, USA) interface를 통하여 컴퓨터와 연결하였다. 막전압 조절과 실험결과 얻어진 칼륨 전류의 기록 및 자료 분석은 pCLAMP 7.0 software(Axon, USA)를 사용하였으며, oscilloscope를 사용하여 전류의 변화를 동시에 관찰하였다.

실험결과 분석
   기록된 자료는 pCLAMP 7.0 및 Microcal Origin 4.1 (Microcal software Inc. 미국) 프로그램으로 분석하였다. 실험측정치는 Student's t-test로 통계학적 분석을 시행하고 p<0.05를 유의성의 기준으로 삼았으며 평균±표준오차 로 표시하였다.

결     과

내측 전정핵 뉴론의 칼륨 전류에 미치는 5-HT의 효과
   전정핵 신경세포 중 세포체의 크기가 비교적 크고 세포막이 매끄러우며 세포체의 경계가 분명하여 미세전극(microelectrode)으로 접근하여 기록하기가 용이한 세포들을 대상으로 실험을 시행하였다(Fig. 2).
   유지전압을 -70 mV로 하고 10 mV 간격으로 -60 mV에서 +40 mV까지 단계적으로 탈분극펄스를 매 10초마다 400 msec 동안 자극하였다. 기록된 칼륨 전류는 -30~-20 mV에서부터 활성화되기 시작하였으며 탈분극 자극 전압이 높을수록 칼륨 전류의 크기도 커서 +40 mV의 탈분극 자극에 대해서 최대 전류치를 보였으며, 자극전압이 가해지는 동안 외향성 전류가 잘 유지되었다. 
   전정핵 세포는 5-HT 처치 후 탈분극 자극을 가하였을 때 일정한 반응을 보이지 않고 혼재된 양상의 반응을 나타내었다. 총 40예의 실험중 17예에서는 칼륨 전류가 대조군(4321±231 pA)에 비하여 증가(6021±321 pA, p<0.05)하는 반응을 보였으며(Figs. 3 and 4), 23예에서 칼륨전류가 대조군(4633±371 pA)에 비하여 감소(3201±428 pA, p<0.05)하는 반응을 나타내었다(Figs. 5 and 6).

내측 전정핵 뉴론의 칼륨 전류에 미치는 5-HT₁ agonist의 효과
   5-HT에 대한 전정핵 뉴론 칼륨 전류에 대한 증가, 또는 감소 반응이 전정핵 뉴론내에 존재하는 5-HT 수용체의 아형에 따라 어떠한 반응을 보이는가를 관찰하였다. 5-HT₁의 agonist 인 5-carboxamidotryptamine(5-CT)를 전처치하고 탈분극자극을 가하였을 때 내측 전정핵 뉴론의 칼륨 전류(n=10)는 대조군(4509±346 pA)에 비하여 유의하게 상승(6134±523 pA)하였다(Fig. 7).

내측 전정핵 뉴론의 칼륨 전류에 미치는 5-HT₂ agonist의 효과
   5-HT₂의 agonist인 α-methyl-5-hydroxytryptamine을 전처치하고 탈분극 자극을 가하였을 때 내측 전정핵 뉴론의 칼륨 전류(n=10)는 대조군(4521±431 pA)에 비하여 유의하게 감소(2234±512 pA)하였다(Fig. 8).

고     찰

   현재까지 전정핵 신경세포를 대상으로 하는 전기생리학적 연구는 주로 세포외 기록법을 이용하여 뉴론군의 흥분 발화율을 기록하거나 세포내 기록법을 이용하여 신경세포의 막전압 변화를 관찰하고 이온통로의 존재유무를 확인하는 연구가 대부분이었으나,¹³⁾¹⁴⁾ 본 연구에서와 같이 특정 전정핵 신경세포만을 대상으로 patch clamp기법을 사용하여 각 이온전류를 분류하고 이 이온전류의 특성 및 약물에 의한 조절에 관한 보고는 거의 없는 실정이다. 
   면역조직학적 방법을 이용한 연구에 의하면 뇌간의 전정핵군에는 5-HT 신경 말단¹⁵⁾과 5-HT 수용체⁴⁾가 광범위하게 존재하고 있으나, 5-HT에 의하여 유발된 전정핵 뉴론의 반응은 일정하지 않다. Licata 등⁷⁾은 5-HT에 대하여 외측 전정핵은 강한 흥분적 반응을 보인다고 보고하였으나, Licata 등⁷⁾과 Johnston 등¹⁶⁾은 상측 전정핵과 내측 전정핵에서는 흥분적 반응, 억제적 반응 그리고 흥분반응과 억제적 반응이 혼합된 이상성의 반응을 보고한 바 있다.
   Johnston 등¹⁶⁾에 의하면 내측 전정핵에 주입된 5-HT는 82%에서 흥분 발화율의 증가를 보였으며 이는 ketanserin이나 ritanserin과 같은 5-HT₂ 수용체 길항제에 의하여 억제되었으며, 10%에서는 흥분 발화율의 감소를 보였다. 그리고 8%에서는 짧은 기간 동안 감소되었다가 증가하는 양측성 반응(biphasic response)이 관찰되었으며 이 경우 흥분성 반응은 ketanserin에 의하여, 억제성 반응은 5-HT_1A 수용체 길항제인 pindobind-5-HT에 의하여 역전되었다. 이와 같은 실험결과는 내측 전정핵에서 5-HT 두 가지 유형의 수용체가 기능하고 있으며 이 두 가지 수용체에 의하여 나타나는 효과가 상반됨을 시사하고 있다. 본 연구에서는 whole cell patch clamp방법을 사용하여 5-HT가 내측 전정핵 뉴론의 칼륨 전류에 미치는 영향을 관찰하였다. 5-HT에 대한 전정핵 뉴론의 칼륨 전류는 증가하거나 감소되는 반응을 보였는데, 이때의 증가 반응은 5-HT1 수용체 agonist인 5-CT에 의하여 비슷하게 유발되었으며, 억제 반응은 5-HT₂ 수용체의 agonist인 α-methyl-5-hydroxytryptamine에 의하여 유발되었다. 이와 같이 본 실험에서도 내측 전정핵 뉴론이 두 수용체의 agonist 에 대하여 상반되는 반응을 보이는데 이는 Johnston 등¹⁶⁾의 실험결과와 일치되는 점이라 하겠다. 그리고 본 실험 결과에 의하면 5-HT₁ 수용체는 전정핵 세포의 흥분성을 감소시키며, 5-HT₂ 수용체는 전정핵 세포의 흥분성을 증가시킨다고 할 수 있으나, 이를 명확히 규명하기 위하여서는 세포막의 전류를 고정시킨 상태에서 내측전정핵 뉴론의 자발적 활동전압의 변화를 관찰하는 전류고정법하에서 각 약물의 효과를 관찰하여야 한다.
   신경계의 다른 부위에서도 5-HT가 칼륨 전류의 조절자로서 기능하고 있으나 그 효과는 작용 부위와 작용 수용체에 따라 다름을 볼 수 있다. 즉 쥐의 측좌핵(nucleus accumbens)에서 5-HT는 5-HT₂ 수용체를 통하여 칼륨 전류를 감소시키나,¹⁷⁾ 해마 뉴론에서는 5-HT_1A 수용체를 통하여 칼륨 전류를 활성화시키는 것으로 보고되어 있다.¹⁸⁾
   Li 등⁸⁾이 5-HT가 1차 전정신경에서 전정핵으로의 신호전달에 중요한 기능을 하고 있는 glutamate와 같은 흥분성 input에 대한 전정핵의 반응성을 변화시킴으로써 자세조절이나 안구운동에 영향을 미칠 수 있다고 하였다. 따라서 본 실험에서 관찰한 바와 같이 5-HT는 전정핵 뉴론에서 칼륨 전류에 영향을 미침으로써 전정핵 내에서의 흥분성 신호처리에서 주요한 조절자 역할을 할 것이라 생각된다.

결     론

   5-HT에 대하여 내측 전정핵 세포의 칼륨 전류는 일정한 양상의 반응을 보이지 않고 증가(17/40)하거나, 감소(23/40)하는 반응을 나타내었다. 5-HT₁의 agonist 인 5-CT에 의하여 내측 전정핵 뉴론의 칼륨 전류는 증가하였다. 5-HT₂의 agonist 인 α-methyl-5-hydroxytryptamine 에 의하여 내측 전정핵 뉴론의 칼륨 전류는 감소하였다. 이상의 실험결과 5-HT는 전정핵 세포의 5-HT₁이나 5-HT₂ 수용체를 통하여 칼륨 전류에 영향을 미치고 있으며 그 효과는 수용체에 따라 다름을 알 수 있다.

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