교신저자：임태승, 501-717 광주광역시 동구 서석동 588번지  조선대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   Cyclooxygenase(COX)는 arachidonic acid로부터 prostaglandin(PG)을 합성하는데 촉매작용을 하는 효소이며, COX-1과 COX-2 두 가지 아형이 있다.¹⁾ PG는 종류에 따라 다양한 반응을 보이게 되는데, 일부는 세포증식을 촉진시키며, 종양세포에 대한 면역반응을 억제시키고, 세포고사를 억제하는 등 종양의 성장과 깊은 관련이 있다고 알려졌다.¹⁾²⁾ 따라서 이런 PG의 생성에 관련된 COX는 결과적으로 종양의 성장에 영향을 미치게 된다. COX-1은 환경에 따른 변화를 보이지 않고, 항시 일정한 수준을 유지 발현하나, COX-2는 세포고사를 억제하고,³⁾ 신생혈관형성을 촉진하거나, 종양의 침습성을 증대시키며, 염증 및 면역기능을 조절하거나 procarcinogen을 carcinogen으로 전환시키는 등의 작용에 의해 종양의 형성 및 진행에 관여하는 것으로 알려져 있다.⁴⁾ COX-2는 결직장암의 경우 발암과정, 신생 종양혈관형성, 그리고, 침습성 획득에 중요한 역할을 하고 있음이 밝혀졌으며, COX-2 효소의 활성을 억제하는 약제를 이용하여 종양형성을 효과적으로 억제시키는 시도가 성공적으로 이루어지고 있다.⁵⁾
   세포 외 기질 금속함유 단백분해효소(matrix metalloproteinase, MMP)는 암세포의 침습 및 전이에 주된 역할을 하며, 암 전이는 암치료에 있어서 가장 큰 장벽이다. MMP는 기질 선호도에 따라 type IV collagenase(MMP-2, -9), stromelysin(MMP-3) 및 interstitial collagenase(MMP-1)로 구분하며, type IV collagenase는 gelatinase A (MMP-2, 분자량 72 kD)와 gelatinase B(MMP-9, 분자량 92 kD)로 나눈다.⁶⁾ 생체내에서 MMP-2는 섬유아세포, 내피세포, 대식세포 등에서 만들어지며, 주로 type IV, V collagen을 분해하며, 일부는 gelatin, laminin 및 fibronectin을 분해한다.⁷⁾ MMP-9은 정상세포와 암세포 모두에서 생성되며 종양세포의 악성도와 밀접한 관련이 있고, MMP-3는 광범위한 기질특이성을 보이며 proteoglycan, laminin, fibronectin, gelatin과 type Ⅲ, IV collagen 등을 분해한다.⁷⁾ 
   최근의 연구에 의하면 COX-2는 쥐의 태아 간세포(hepatocytes)에서 MMP-2 및 -9의 유리를 촉진한다는 보고⁸⁾가 있어 종양의 침습성, 전이능에 영향을 미칠 것으로 기대된다.
   이에 저자들은 각종 종양의 형성 및 진행, 침습 및 전이에 중요한 역할을 담당하고 있는 것으로 알려진 COX-2 및 MMP를 대상으로 이에 대한 연구가 매우 적은 비강 및 부비동 종양에서 면역조직화학적 염색을 통하여 이들 각각의 발현양상을 비교분석하고, COX-2 및 MMP의 상호관련성을 분석하여 비강 및 부비동 악성종양의 발병학을 보다 더 구체화하고자 한다.

재료 및 방법

재  료

증례 선정
   1992년부터 2001년까지 약 9년 동안 조선대학교 부속병원 이비인후과에서 조직검사로 확진된 비강 및 부비동 종양 중 조직의 보관 상태가 양호한 반전성 유두종 27예, 악성 변화를 동반한 반전성 유두종 5예, 편평세포암 19예를 대상으로 하였다. 연령 분포는 23~74세(평균연령；48.2세)였으며, 성별 분포는 남자 35예, 여자 16예였다. 

시  약
   면역조직화학적 검사에 사용된 1차 항체는 COX-2 mouse monoclonal antibody(1：300, Cayman chemical, Ann Arbor, MI, USA), mouse monoclonal antibody MMP-2, IM33L, mouse monoclonal antibody MMP-3, IM36L과 mouse monoclonal antibody MMP-9, IM37L(1：50, Oncogene Research Products, Boston, MA, USA)을 이용하였다. 2차 항체는 LSAB Kit(DAKO, Santa Cruz, CA, USA)를, 발색제는 AEC kit(DAKO)를 이용하였다. 

방  법

면역조직화학적 검사
   일반 광학현미경 검경 후 선택된 파리핀 블럭을 찾아, 이를 각 각 4 μm로 박절하여 X-tra^TM슬라이드(Surgipath, Richmond, USA)에 부착하여 xylene에 탈 파라핀한 후 에탄올 처리과정과 함수 과정을 거쳐 COX-2, 그리고, MMP-2, -3 및 -9에 대한 면역조직화학적 염색을 ABC법으로 시행하였다. MMP-2에 대한 염색은 trypsin으로 10분간 전처치 후 통상적인 면역조직화학적 염색법에 따라 염색을 시행하였으며, MMP-3에 대한 염색은 조직의 항원성을 살리기 위하여 조직을 탈 파라핀 및 함수 과정을 거친 다음 Pelco^TM3440 laboratory microwave oven (Ted Pella, Inc. Redding, CA, USA)을 98℃로 맞춘 후 5분간 가열된 target unmasking fluid(Monosan, AM Uden, Netherlands)용액에 담가 10분간 가열한 후 oven에서 꺼내어 20분간 실온에 방치시킨 후 trypsin으로 10분간 전처치하여 면역 조직화학적 염색을 시행하였다. COX-2 및 MMP-9에 대한 염색은 조직을 trypsin 처리 없이 MMP-3와 같은 microwave 처리만 한 후 면역조직화학적 염색을 시행하였다. 
   매 염색시 염증성 육아조직을 COX-2 및 MMP 발현의 양성대조로 삼았으며, 음성 대조군은 1차 항체를 정상 goat serum으로 대체한 것으로 하였다. 

면역형광 이중염색
   이상에서 언급된 면역조직화학적 염색과정과 동일한 방법으로 hydrogen peroxide 처리 과정 없이 차단항체를 10분간 실온에서 반응시킨 후 차단항체를 털어 내었다. 1차 항체 COX-2와 MMPs 이중 염색은 COX-2(1：300)을 4℃에서 24시간 정도 반응시킨 후 Tris 완충액으로 수 차례 세척하였다. 이 후 면역 표지물질인 2차 항체 fluorescein anti-mouse Ig G(H+L), FI-2000(Vector laboratories, Burlingame, CA, U.S.A.)을 1：100으로 희석하여 4℃에서 차광된 상태로 3시간 반응시킨 후 Tris 완충액으로 4℃에서 차광된 상태로 3시간 세척하였다. 여기에 같은 과정, 같은 방법으로 MMP-2, -3, 또는 -9(1：50)을 반응시킨 후 Texas red^® anti-mouse Ig G(H+L), TI-2000((Vector laboratories, Burlingame, CA, U.S.A.)을 2차 항체로 1：100으로 희석하여 4℃에서 차광된 상태로 3시간 반응시킨 후 Tris 완충액으로 4℃에서 차광된 상태로 3시간 세척하였다. 이후 슬라이드를 습윤 봉입하여 관찰하였다. 음성 대조군으로는 1차 항체를 생략하고 2차 항체만 반응시킨 조직을 사용하였다. 염색이 완결된 검체는 지체 없이 공초점 주사현미경(confocal laser scanning microscopy：FV300, Olympus, Japan)을 이용하여 관찰하고 영상을 얻었다.

면역조직화학적 검사의 염색도 판정
   COX-2 및 MMP에 대한 염색은 세포질 내에 반응을 보이는 경우를 양성 반응으로 판정하였는데, 반응 정도에 따라 세포질 내 염색소견을 보이는 세포가 전체 종양세포의 5%미만이면 음성(negative)으로, 5%이상이면 양성으로 판정하였으며, 5~49% 양성이면 약 양성(weak positive)으로, 50% 이상 양성소견을 보이면 강 양성(strong positive)으로 세분하였다. 한편, 대식구 및 섬유아세포의 세포질에서도 양성소견을 보였는데, 섬유아세포의 경우는 종양세포와의 감별에 어려움은 없었다. 그러나, 일부의 경우 염색도를 판정함에 있어 대식구와 종양 세포의 감별이 필요한 경우가 있어, cytokeratin 양성이며 CD68에 음성인 세포를 종양 세포로 간주하였다.

면역형광 이중염색의 판정
   모든 면역형광 이중염색이 시행된 조직표본은 공초점 주사현미경을 사용하여 관찰하였다. 레이저광선의 흥분파장은 488 nm 파장을 FITC용으로, 568 nm 파장을 Texas-red용으로 사용하였다. 0.5 μm 또는 1 μm 간격으로 주사영상을 얻어 flow view software program(Olympus, Japan)을 사용하여 최종 3차원적 영상으로 재 구축하여 컴퓨터에 저장하고 인쇄하였다.

통계학적 분석
   COX-2 및 MMPs 발현간의 관련성은 Fisher's exact test로 검정하였고, 유의수준은 0.05미만으로 정하였다.

결     과

면역조직화학적 검사

반전성 유두종의 MMPs 및 COX-2의 염색정도 
   MMP-2는 대부분(93%) 음성반응을 보였고, 일부(7%)에서만 약 양성반응을 보였다. MMP-3는 63%에서 음성을 보이고, 37%에서 약 양성반응을 보였다(Fig. 1). MMP-9는 70%에서 음성반응을 보이고, 30%에서 약 양성을 보였다. 
   COX-2는 대부분(93%) 약 양성소견을 보이고(Fig. 2), 7%는 음성을 보였다. 
   MMP-2, -3 및 -9와 COX-2의 발현유무 및 강도변화간에는 유의한 상관관계가 없었다(Table 1).

악성변화를 동반한 반전성 유두종의 MMPs 및 COX-2의 염색 정도
   MMP-2는 80%가 강 양성을 보였고(Fig. 3), 20%는 약 양성을 보였으며, MMP-3는 40%가 각각 강 양성 및 약 양성반응을 보였고, 20%는 음성반응을 보였다. MMP-9는 60%에서 강 양성을, 20%에서 각각 약 양성 및 음성반응을 보였다. COX-2는 60%가 강 양성을 보였고(Fig. 4), 약 양성과 음성을 각각 20%씩 보였다. 
   MMP-2, -3 및 -9와 COX-2의 발현유무 및 강도변화간에는 유의한 상관관계가 없었다(Table 2). 

편평세포암종의 MMPs 및 COX-2의 염색 정도
   MMP-2는 42%가 강 양성을 보였고, 47%는 약 양성을 보였으며, 11%는 음성반응을 보였으며, MMP-3는 89%가 강 양성을 보였고, 11%가 약 양성을 보였다. MMP-9는 69%에서 강 양성을(Fig. 5), 26%에서 약 양성을, 그리고, 5%가 음성반응을 보였다. COX-2는 79%가 강 양성을 보였고(Fig. 6), 21%가 약 양성을 보였다. 
   MMPs와 COX-2 발현유무 및 강도변화간의 상호 관련성을 보면 MMP-2(p<0.05) 및 MMP-9(p<0.01)는 COX-2의 염색강도와 유의한 상관관계가 있었으나, MMP-3는 유의한 상관관계가 없었다(Table 3). 

공초점 레이저 주사 현미경 검사
   MMPs와 COX-2의 발현을 구체적으로 국지화하기 위해 면역형광을 이용한 이중염색을 한 후 공초점 레이저 주사현미경으로 관찰한 결과 MMPs가 발현되는 부위와 COX-2가 발현되는 부위는 대체로 일치되었다. MMP-2와 MMP-3는 COX-2와 일부 동시 발현을 보이기도 하지만 특이성이 없었다. 그러나, MMP-9은 대부분, 특히 강 양성을 보이는 부위의 경우 COX-2와 동시 발현을 주로 보였다(Fig. 7). 

고     찰

   COX-2는 염증의 시작과 유사분열 반응에 관여하는 유발형(inducible) 효소로서 PG를 합성하는데 관여한다. 몇 몇 PGs중, 특히 PGE2는 혈관 형성을 촉진하고, 면역감시기능을 억제함으로써 종양형성 과정에 촉진자로서의 역할을 담당한다.¹⁾³⁾⁴⁾ COX-2의 합성 유도는 여러 가지 성장인자, 각종 cytokines, oncogenes, carcinogens, 그리고, tumor promoting ester 등에 의하며, 세포에 따라 lipopolysaccharide(LPS), interleukin(IL)-1β, tumor necrosis factor(TNF)-α, 그리고 활성산소 산물 등에 의해 조절된다.⁸⁾ 또한 COX-2 발현은 발암 및 종양 형성과 관련이 있는데, 아스피린이나 다른 NSAIDs를 규칙적으로 복용한 집단 연구에서 결직장암의 발생이 40~50% 감소되었다는 보고가 있다.⁵⁾⁹⁾ COX-2가 정확히 어떤 경로로 발암 과정에 관여하는지는 알려져 있지 않으나, COX-2 억제는 세포고사를 유도하고, 세포증식을 억제하며, bcl-2발현을 하향 조절하고,⁴⁾⁹⁾ H-ras-transformed cells의 성장을 촉진하며,⁹⁾ epidermal growth factor(EGF) 발현을 유도한다.³⁾ COX-2의 여러 가지 기능 중에서 신생혈관 형성 조절측면에서 보면 COX는 혈관 내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)의 발현을 유도하고, VEGF는 endothelial cell mitogen으로 작용하여 종양 신생혈관을 형성하게 되고, 결국은 종양의 성장과 침습을 촉진시키게 된다.⁴⁾ 따라서 최근의 연구는 COX 억제제의 사용은 발생중인 종양 내로의 혈관 성장을 차단할 수 있을 것으로 보고 있다.⁵⁾ 종양에서 COX-2의 발현에 관한 보고에서 Kim 등¹⁰⁾은 후두의 편평세포암종에서 COX-2는 21예 중 16예에서 중등도 이상의 양성반응을 보였다고 하였고, Ann 등¹¹⁾은 후두 유두종 5예에서 COX-2가 정량적, 정성적 방법 모두에서 정상 구강상피세포보다 강한 발현이 나타났다고 하여 COX-2의 발현이 종양의 형성과 관련이 있다고 하였다. 또한 Duminda 등¹²⁾은 식도 편평세포암종에서 COX-1은 정상세포와 암세포 모두에서 비특이적으로 발현하였으나 COX-2는 정상 구강상피에 비해 암세포에서 발현이 증가하여 COX-2 발현이 의의가 있다고 하였다.
   본 연구의 결과에서 COX-2는 종양주변의 정상 호흡상피에서 일부 약한 양성 반응을 보였고, 대식구, 혈관내피세포, 섬유모세포 등에서 약하게 세포질 내 양성 반응을 보였다. 또한 반전성유두종에서 COX-2는 대부분(93%) 약한 양성 소견을 보였고, 7%는 음성을 보였으나, 편평세포암종에서는 79%가 강 양성을 보였고, 21%가 약 양성을 보였으며, 음성을 보이는 증례는 없어 암세포에서 강한 발현을 한다는 타 보고와 유사한 결과를 보였다. 
   단백 분해효소 중 matrix metalloproteinase(MMP)는 여러 아형이 존재하는데 세포에서 분비된 MMP는 세포 외 활성화 과정을 거쳐 단백 분해 억제제와 복합체를 형성하여 활성도가 조절된다.⁶⁾ 즉, 침습이 일어나는 곳은 단백 분해효소와 단백 분해억제제의 균형이 깨져 단백 분해효소의 활성이 증가된다. 종양세포의 침습과 전이는 세포외 기질의 분해가 선행되어야 하며, 그 중에서도 기저막은 조직간의 경계막 역할을 하는 중요한 구조물 중의 하나이다. Matrixin이라고도 알려진 MMP는 Zn2+에 의존하는 내인성 peptidase로서 질환상태 뿐 아니라 정상 간질조직의 대사에도 관여하며 기저막의 분해를 일으킨다. 기저막은 type IV collagen, laminin, heparan sulfate, proteoglycan, fibronectin 등으로 구성되어 있고, MMP-2와 -9은 이들 기저막 성분 중 type IV, V collagen을 분해하여 종양세포의 기저막 파괴와 침습을 유도하게 된다.⁷⁾ 따라서 종양세포의 MMP-2와 -9 생산성은 종양의 침습성과 상관성이 있어 암세포의 전이능과도 상관 관계가 있다고 한다. 또한 MMP-3는 광범위한 기질특이성을 보여 proteoglycan, laminin, fibronectin, gelatin, type Ⅲ과 IV collagen 등을 분해하며, 두경부 암종에서 발현이 증가된 경우 종양의 침윤성이 증가되며, 구강 편평세포 암종에서 림프절 전이 및 혈관 침습의 정도와 밀접한 관련이 있다는 보고가 있다.¹³⁾ 
   각종 악성 종양세포에서 MMP-2 및 -9의 발현이 증가되었다는 연구 결과들이 있는데, Kurahara 등¹⁴⁾은 구강의 편평세포암종에서 면역조직화학적 염색을 시행하여 MMP-1, -2, -9의 발현이 높게 나온 경우 세포외 기질의 염색이 감소되었고, 전이된 환자의 경우 MMP-1, -2, -3, -9의 발현이 높다고 보고하였다. Rhee 등¹⁵⁾은 구강설의 편평세포암종에서 MMP-2는 52%에서 증가된 발현을 보였다고 하였고, Cho 등¹⁶⁾은 두경부 편평세포암종에서 MMP-2는 71%에서 양성 발현을 보였고, MMP-9은 60%에서 양성 발현을 보였으며, MMP가 발현된 군에서 림프절 전이가 잘 일어났다고 하였다. 또한 Choi 등¹⁷⁾은 구강 및 구인두 편평세포암종에서 MMP-2가 32예 중 20예에서 발현하였으며 원발 병소의 병기 증가와 침습이 심할수록 발현이 증가한다고 하였다. 그러나, 악성종양에서 발현되는 이들 MMPs가 종양세포 자체에서 분비된 것인지, 아니면 주변의 간엽세포에서 기원된 것인지는 논란이 있으며 아직 정확하게 확립되어 있지 않다. 종양주변의 섬유모세포에서 주로 MMP-2 mRNA가 검출된다는 보고가 있는 반면,¹⁸⁾ MMP-2 단백질이 주로 종양세포에서 관찰된다는 보고와,¹⁹⁾ MMP-2 mRNA와 MMP-2 단백질이 종양세포 및 인접 간엽세포 모두에서 검출되었다는 보고가 있다.²⁰⁾ 
   본 연구의 경우 MMP-2, -3 및 -9 모두 종양세포에서 강하게 발현되고, 소량의 반응이 주변의 섬유모세포 등에 나타나나, 정상 점막에서는 양성발현을 보이지 않아 종양세포자체의 MMPs 생산이 주된 역할을 하는 것으로 판단되며, 이에 의하여 유도된 인접 간엽 세포의 발현이 추가적으로 일조하고 있는 것으로 판단된다. 그러나 MMP-2의 경우 양성 반응이 악성 변화를 동반한 반전성 유두종 예들에 비하여 약간 감소된 소견을 보이는 것은 그 자체가 특이한 현상인지 혹은 악성 변화를 동반한 반전성 유두종의 증례가 5예로 한정적인 것에 기인한 것인지는 알 수가 없었다. 결과에서 이와 같은 보고자에 따른 결과의 불일치성은 종양세포 자체가 MMPs를 분비하는 것 이외에도 주위의 MMPs를 흡수하거나, 면역조직화학적 염색시의 항체의 특이성의 차이에 기인할 것이다.
   이와 같이 MMPs가 종양 침습 및 전이 과정뿐만 아니라, 형태 형성(morphogenesis), 장기(organ) 발달 등에 관여하고, 염증시의 조직 손상시 세포 및 세포 외 성분을 분해시켜 세포 이동에 중추적 역할을 담당한다. 
   MMPs의 분비량과 COX-2 발현 정도는 좋은 상관관계를 보이며, 많은 악성 종양에서 MMP-2 및 -9를 풍부하게 분비하는 것으로 알려졌다.²⁾ COX-2에 의해 합성된 어떤 대사산물과 PGs가 MMPs의 유리, 전사 조절, 그리고/또는 안정성과 분비에 관여하는데, COX-2 발현과 PG 합성은 MMPs 분비에 중요한 성분이며, 결과적으로 세포 외 기질의 remodeling을 일으킨다.²⁾ 
   본 연구에서도 MMPs의 발현이 종양의 COX-2 발현과 유의한 상관성을 보였으며, 양성 종양에서보다는 악성 전환이 일어난 증례나, 악성 종양의 경우 강한 발현을 보일 뿐만 아니라, 더욱 뚜렷한 COX-2/MMPs 상관성이 있어 종양의 진행, 악성화, 성장 및 침습능 등과 관련이 있을 것으로 판단된다. 따라서, COX-2 억제자는 효과적으로 종양의 진행 및 침습능 획득 등을 막거나 지연시킬 수 있을 것으로 생각된다. 또한 종양주변의 비 종양성 상피에서 COX-2가 발현되는 반면, 종양에서 멀리 떨어진 상피에서는 발현되지 않는 것으로 보아 paracrine field effect의 가능성을 시사한다.
   한편, MMPs와 COX-2의 동시발현을 면역형광 염색을 통한 공초점 레이저 주사 현미경 분석 결과 MMP-9과 COX-2의 동시 발현만이 유의하였다. 따라서, MMP-2 및 -3는 COX-2의 paracrine effect를 주로 받고, MMP-9는 paracrine effect 및 autocrine effect를 동시에 받아 종양의 악성화, 성장 및 진행, 침습 및 전이 등에 역할을 하는 것으로 추정된다. 

결     론

   비강 및 부비동의 반전성 유두종, 악성변화를 동반한 반전성 유두종 및 편평세포 암종을 대상으로 COX-2 및 MMPs의 발현을 비교 검토한 결과, 악성종양의 경우 COX-2 및 MMP-2, -3, -9의 발현이 유의하게 증가하였으며, COX-2와 MMP-2, -9의 발현은 유의한 상관 관계가 있었다. 또한 면역형광 이중염색 분석 상 COX-2 및 MMP-9은 악성종양세포에서 autocrine effect를 보이고 있었다. 
   이상의 결과를 토대로 비강 및 부비동 종양의 진행, 악성화, 그리고 침습능 등에 COX-2 및 MMPs가 관여하며, COX-2와 MMPs는 상호 밀접한 관련이 있다. 따라서, COX-2나 MMPs 억제제의 사용이 비강 및 부비동 종양의 발생 및 진행 억제에 도움이 될 것으로 생각된다.

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