교신저자：이강대, 602-702 부산광역시 서구 암남동 34번지  고신대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   암 연구의 목표 중 하나는 정상세포와 암세포를 구별할 수 있는 암 특이적인 분자를 찾아내어 암의 진단과 치료에 이용하는 것이라고 할 수 있다. 저자들은 암 특이적으로 발현되는 유전자인 MAGE 유전자(melanoma antigen gene, MAGE A gene)에 대해 관심을 가지고 암의 진단과 치료에 응용하고자 이 분야에 대해 연구하여 왔다. MAGE 유전자는 흑색종 세포주로부터 발견된 종양항원 유전자로서 암세포에 특이적으로 발현되고 동시에 세포독성 림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL)에 의해 인식되어 암 면역치료의 잠재적 목표물로 관심을 모아 왔다.¹⁾ MAGE 유전자는 염색체에 존재하는 위치에 따라 MAGE A, B, C, D 등으로 분류된다.²⁾ MAGE A는 적어도 12개 이상의 유전자로 구성되며, chromosome Xq28에 위치한다.³⁾
   MAGE A 유전자는 흑색종 뿐 만 아니라 두경부암,⁴⁾⁵⁾⁶⁾ 위암,⁷⁾ 식도암,⁸⁾ 대장암,⁹⁾ 폐암,¹⁰⁾ 유방암,¹¹⁾ 난소암,¹²⁾ 간암¹³⁾ 등 인체의 대부분의 암 조직에서는 발현되지만, 정상조직에서는 정소(testis)이외는 발현이 없는 것으로 알려져 있다. 현재까지 MAGE A 유전자에 관한 국외의 연구는 MAGE A가 암 특이적으로 발현되는 특성을 대부분 암의 치료에 응용하고자 하는 방향이 주를 이루고 있으나 이것을 암의 진단에 활용하고자 하는 연구는 매우 드물다. 최근에 이르러 위암, 간암 환자의 혈액으로부터 암세포를 검출하여 혈액을 이용한 암의 분자생물학적 진단의 가능성이 제시되고 있다.^14)15)16)
   두경부암에서 MAGE A 유전자는 암 특이적으로 발현되는 것으로 밝혀져 있는데 Eura 등⁴⁾과 Lee 등⁵⁾은 RT-PCR법으로 두경부의 편평세포암종과 비편평세포암종의 71~75%가 적어도 1종류 이상의 MAGE A mRNA를 발현함을 보고하였다. 또 Lee 등⁶⁾은 두경부암을 대상으로 monoclonal antibody 57B를 사용한 면역조직화학적 염색을 통해 MAGE A가 단백질 단계에서도 암 특이적으로 발현되는 것을 확인하였다. 이러한 일련의 연구 결과는 MAGE A 유전자의 mRNA와 단백질이 두경부암에서 암 특이적으로 발현하는 것을 강력하게 지지한다. Park 등¹⁷⁾은 단순히 두경부암에서 MAGE A 유전자의 발현을 보는 것에서 한 걸음 더 나아가 MAGE A1에서 MAGE A6까지의 유전자를 선택적으로 검출할 수 있는 common MAGE primer를 고안하여 두경부암 조직과 양성종양, 정상조직을 대상으로 nested RT-PCR을 한 결과 편평세포암종의 70.4%에서 MAGE A가 검출된 반면 양성 질환 및 정상 조직에서는 전혀 검출되지 않아 이 검사법이 암 진단을 위한 종양표지자(tumor marker)로 활용될 가능성이 있음을 보고한 바 있다.
   지금까지의 연구는 모두 두경부암의 수술로부터 얻은 검체를 대상으로 MAGE A mRNA와 단백질이 암 특이적으로 발현하는 것을 본 것이다. 저자들은 다음 단계로 실제 임상에서 MAGE A 유전자를 두경부암의 종양표지자로 활용이 가능한가에 관심을 두게 되었다. 본 연구의 목적은 두경부암 환자의 객담에서 저자들이 고안한 common MAGE primer로써 MAGE A 유전자의 암 특이적인 발현을 관찰하는 것이 가능한가를 알아보는 것이며 그것이 가능하다면 그 결과를 임상소견과 비교하여 객담에서의 MAGE A 유전자 발현에 대한 검사의 유용성을 평가하고자 한다.

대상 및 방법

대  상
   2001년 4월부터 2002년 12월까지 고신대학교 복음병원에 내원하여 두경부암으로 확진된 후두, 하인두, 구인두의 편평세포암종 17예, 설암 및 하인두암 치료후의 폐전이암 2예, 경부 림프절전이를 일으킨 폐암 2예, 하인두의 육종 1예 등 22예의 암 환자로부터 채취한 객담과 대조군으로 인후두-폐질환이 없는 정상인 40예로부터의 객담을 연구 대상으로 하였다. 두경부암 환자의 평균 연령은 63.5세이며 남녀 비는 10：1이었다. 대조군의 경우는 평균 연령은 31.5세이며 남녀 비는 10：1이었다. 환자군과 대조군에서 흡연과 비흡연자의 비는 각각 10：1과 1：1이었다. 대상 예 중 두경부 편평세포암종 17예의 원발부위에 따른 분포를 보면, 후두암은 성문암이 4예, 성문상부암이 7예 등 11예이었고, 하인두암, 설근부암, 편도암 등이 각각 2예이었다. T 병기별로는 T1이 4예, T2 5예, T3 3예 그리고 T4가 5예이었다. 대상 예에 대한 1차 치료로는 레이저 수술 1예, 방사선 단독치료 3예, 항암제와 방사선의 병합요법 13예이다.

객담의 채취와 mRNA의 분리
   객담에서 MAGE A mRNA의 발현을 보는 시기는 치료 전 1회 검사를 하였고, 수술, 방사선치료, 항암치료 등 치료 후 경과 관찰을 할 때에는 1회 이상 시행하였다. 객담을 얻는 방법은 환자로 하여금 기침을 강하게 하여 가능한 많은 후두와 인두 부위의 세포가 객담에 떨어져 나오도록 한 후 50 ml 시험관에 객담을 뱉게 한다. 객담처리법은 저자들이 고안한 방법으로서 객담의 액화, 세포용해 및 RNA 보존 등을 동시에 실시할 수 있는 방법이다. 이를 간략히 기술하면 50 ml 시험관에 모아둔 객담에 3~5 ml 정도의 보존제(Guanidium thiocyanate, Triton X-100)를 넣고 강하게 혼합하여 완전히 액화시킨다. Magnetic bead(ABgene, Epsom, U.K.) 150 μl(7.5 mg)을 액화된 객담에 주입하고 30분간 실온에 혼합하면서 방치한 다음 1,100 rpm에서 2분간 원심하여 상층액은 버리고 세척액으로 magnetic bead를 부유시켜서 1.5 ml 시험관으로 옮긴다. 4회 세척한 다음 세척액을 모두 제거하고, magnetic bead에 결합된 핵산은 용출액으로 부유시킨 다음, 이를 70℃에서 1400 rpm으로 10분간 혼합한다. 부유된 용출액은 새 시험관에 옮긴 다음, biotin이 결합된 oligo(dT)20(10 pmol/μl) 3 μl를 혼합한 핵산결합 시약 150 μl를 상기 시험관에 주입한다. SMP(Strepavidin Magnetic Particles, 10 mg/ml, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)를 완전히 부유시키고, 보존용액을 제거한 다음, 혼합된 핵산 용출액을 주입하여 37℃에서 10분간 반응시킨다. SMP 세척액을 주입하여 3회 세척하고, 자석으로 SMP를 붙인 다음, 상층액을 제거한다. 핵산분해효소가 함유되지 않은 3차 증류수를 20 μl 가하여 SMP를 부유시킨 다음 70℃에서 2분간 반응시켜 mRNA를 용출한다.

RT-PCR 및 nested PCR

역전사(Reverse transcription)에 의한 cDNA의 합성
   먼저 5X RT buffer 3 μl, 10 mM dNTP mix 1.5 μl, MMLV reverse transcriptase(200 U/l, Promega, USA) 0.5 μl, RNase inhibitor(40 U/l, Promega, USA) 0.5 μl, 100 pM oligo dT primer 1.5 μl를 PCR tube에 넣어 RT-mixture를 만들었다. RT-mixture에 mRNA 용액 13 μl 첨가한 뒤 mineral oil을 1방울 떨어뜨리고 실온에 10분간 두었다. 이 시험관을 42℃에서 60분간 열처리하여 cDNA를 합성하고 이 cDNA를 일차 PCR에 이용하였다.

MAGE A1-6 유전자에 대한 C1/C2 primer를 이용한 일차 PCR
   GAPDH(sense：CGTCTTCACCACCATGGAGA, antisense：CGGCCATCACGCCACAGTTT)를 사용하여 mRNA가 성공적으로 분리된 것을 확인한 후에 MAGE A1-6 gene에 대한 PCR을 시행하였다. 먼저 10X PCR buffer 3 μl, 25 mM MgCl2 1.8 μl, 10 mM dATP 0.3 μl, 10 mM dGTP 0.3 μl, 10 mM dTTP 0.3 μl, 10 mM dCTP 0.3 μl, 50 μM sense 및 antisense primer 0.25 μl, Taq polymerase(5 U/μl, Promega Co., USA) 0.25 μl를 혼합하고 여기에 증류수를 넣어 최종 용액량이 25 μl되게 하여 PCR mixture를 만들었다. PCR mixture를 PCR tube에 넣고 여기에 역전사 반응물을 5 μl 넣어 혼합하였다. 다음 mineral oil을 1방울 떨어뜨리고 PCR 기계(Cetus 480, Perkin Elmer Co., USA)에 넣어 다음의 조건으로 C1/C2 common MAGE primer를 이용한 1차 PCR을 실시하였다(Table 1). 먼저 94℃에서 5분간 가열한 후 94℃에서 30초, 57℃에서 45초, 72℃에서 45초를 1cycle로 하여 35cycle 반응시켜 cDNA를 증폭시켰으며, 최종적으로 72℃에서 5분간 처치하여 PCR을 완료하였다.

MAGE A1-6 유전자에 대한 C3/C4 primer를 이용한 nested PCR
   일차 PCR 산물을 증류수로 10배 희석한 후 nested PCR에 사용하였다. 상기한 바와 같이 PCR mixture에 희석한 PCR 산물 2 μl와 증류수를 3 μl 첨가하였다. PCR 시약이 들어 있는 시험관에 mineral oil을 1방울 떨어뜨린 후 PCR machine에 넣어 다음의 조건으로 C3/C4 primer를 이용하여 nested PCR을 실시하였다(Table 1). 먼저 94℃에서 5분간 가열한 후 94℃에서 30초, 57℃에서 45초, 72℃에서 45초를 1 cycle로 하여 35 cycle 반응시켜 cDNA를 증폭시켰으며, 최종적으로 72℃에서 5분간 처치하여 PCR을 완료하였다. 1% agarose gel에 PCR 산물을 접종하고 전기영동 한 뒤 UV transilluminater를 이용하여 관찰하였다.

통계처리
   대상에서 MAGE A 유전자 발현의 통계학적 유의성에 대해서는 χ²-test를 사용하였고, p<0.05 일 때 통계학적 유의성이 있는 것으로 판정하였다.

결     과

   두경부 편평세포암 환자 17예를 포함한 두경부암 22예와 대조군 40예의 객담으로부터 MAGE A1-6 mRNA를 찾아낼 수 있도록 고안된 common primer인 C1/C2와 C3/C4를 이용한 nested RT-PCR을 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

치료 전 두경부 편평세포암종 환자의 객담에서 MAGE A1-6 mRNA의 발현
편평세포암종의 경우 17예 중 13예(76.5%)에서 객담으로부터 MAGE A mRNA가 검출되었다(Fig. 1A).

장기별 발현 빈도
   장기별로는 후두암의 72.7%(8/11), 설근부암의 50%(1/2), 그리고 하인두암(2/2)과 편도암(2/2)의 경우는 100%에서 MAGE A mRNA가(+)로 발현되었다(Table 2). 

병기별 발현 빈도
   병기별로는 1기는 4예 중 2예(50%), 2기는 5예 중 5예(100%), 3기는 3예 중 2예(66.6%), 4기는 5예 중 4예(80%)에서 MAGE A가 검출되었다(Table 3). 병기별 예 수가 적어 병기별 통계적 유의성은 구할 수 없었다.

치료전 전이성 폐암, 경부전이를 가진 폐암, 하인두 육종 환자의 객담에서의 MAGE A1-6 mRNA의 발현(Fig. 1A)(Table 2).
   폐암(2/2), 폐전이암(2/2), 하인두 육종(1/1) 모두 100%에서 MAGE A mRNA가 검출되었다.

치료 후 경과 관찰 중 객담에서의 MAGE A1-6 mRNA의 발현
   일차치료 후 경과 관찰을 위해서 모든 예에서 1회 이상 객담 내 MAGE A 검사를 시행하였다. 경과관찰 중 대상 예중 치료 후 완전관해가 11예, 재발이 6예에서 관찰되었다. 완전관해를 얻었던 예에서는 모두 객담 내 MAGE A 발현 검사에서 검출되지 않았으나, 재발하였던 6예 중 3예는 방사선치료 후에 재발하였는데 이중 성문상부암 2예와 하인두암 1예에서는 경과 관찰 중 객담검사에서 MAGE A가 검출되어 이를 토대로 조직검사를 하였고, 그 결과 재발성 편평세포암종으로 확인되었다.

대조군에서의 발현
   두경부 암환자와는 달리 대조군인 정상인 40예에서는 2예(5%)에서 MAGE A가 발현되었다(p<0.001)(Fig. 1B). MAGE A가 발현된 2예는 모두 장기간의 흡연의 경력이 있었다.

고     찰

   두경부암에 대한 치료 방법들이 많이 개발되었음에도 불구하고 진행된 암에 있어서 생존율은 과거와 큰 차이 없어 여전히 기대에 미치지 못하는 것이 현실이다. 생존율을 개선하기 위해서는 새로운 암 치료법을 개발하는 것도 중요하지만 암을 조기 진단하는 것이 보다 효율적이라고 생각한다. 그러므로 암의 조기 진단을 위한 새로운 종양 표지자를 발견해내는 것은 두경부암 생존율의 개선에 매우 중요하며 암 연구자의 오랜 연구 목표이기도 하다. 이상적인 종양표지자는 암세포에 특이적으로 발현되고, 발현 빈도가 높으며, 다양한 암에서 나타나는 것이라고 할 수 있으나 두경부암에서는 아직까지 만족스러운 종양표지자는 없어 이 분야의 연구가 시급하다. 최근에 후두암에 대한 종양표지자로서 Godin 등¹⁸⁾ 은 PH-20의 가능성을 제시하였다. 그러나 PH-20은 정상조직보다 암 조직에서 양적으로 높게 발현된다는 것이지 암 특이적인 분자라고 할 수 없다. 더욱이 조직에서의 발현에 대한 연구 이후 그 뒤로 실제 임상에서 체액을 대상으로 종양표지자로 활용한 보고는 아직까지 없다.
   Eura 등⁴⁾과 Lee 등⁵⁾⁶⁾은 MAGE A 유전자가 두경부 영역에서 암 특이적으로 그리고 비교적 높은 빈도로 발현되는 것을 보고하였다. 또 Lee 등¹⁹⁾과 Park 등¹⁷⁾은 MAGE A1에서 MAGE A6까지의 유전자를 한번의 nested RT-PCR로 검출할 수 있는 common MAGE primer를 고안하여 두경부 암조직과 양성종양, 정상조직을 대상으로 검사를 한 결과 편평세포암종의 70.4%에서 MAGE A가 검출된 반면 양성 질환 및 정상조직에서는 전혀 검출되지 않아 MAGE A 유전자가 종양표지자로서의 가능성이 있음을 확인한 바 있다. 지금까지는 수술로부터 얻어진 종양 조직을 대상으로 MAGE A 발현에 대한 연구가 보고되었으나 본 연구에서는 임상에서 실제로 사용이 가능한 두경부암 환자의 객담을 대상으로 MAGE A 유전자의 발현 여부를 살펴보았다. 그 결과 조직과 마찬가지로 객담에서도 대단히 흥미로운 결과를 얻을 수 있었다. 즉, 두경부 편평세포암종의 경우 MAGE A1-6 mRNA의 발현 빈도는 76.5%(13/17)로 높았다. 객담에서 MAGE A 유전자의 발현빈도는 조직보다 낮을 것으로 예상하였으나 의외로 높게 나타났다. 이것은 대상의 표본 수가 적은 것에 기인한다고 생각한다.
   객담을 이용한 두경부암의 진단에 대해서 Matsuda 등²⁰⁾이 연구한 바 있다. Matsuda 등²⁰⁾은 후두암, 하인두암 환자의 객담을 대상으로 세포진 검사(sputum cytology)를 한 결과 후두암의 63.5%, 하인두암의 77.4%에서 진단이 가능하며, 후두암의 경우 병기별로는 T1이 29.4%, T2가 63.3%, T3에서 69.7%, T4에서 79.2%의 빈도로 진단이 가능하였고, 초기 후두암에서는 객담으로 떨어져 나오는 암세포의 수가 적어 초기암의 진단율은 낮다고 하였다. 비록 Matsuda 등²⁰⁾이 보고한 세포진 검사가 비침습적이고 간단한 진단법이긴 하지만 초기암의 진단율이 낮게되면 실제 임상에서는 진단적 수단으로서의 의미는 줄어든다. 왜냐하면 진행된 암에서 두경부암을 진단하는 것은 다른 도구로도 얼마든지 가능하기 때문이다.
   따라서 임상적 의미를 가진 검사법이 되려면 기존의 진단도구로써 쉽게 발견하기 어려운 초기 단계에서 임상의에게 암의 존재를 알릴 수 있는 방법이어야 한다. 본 연구에서는 T1에서 50%, T2에서 100%의 검출율을 얻어 비교적 조기의 암에서도 MAGE A 유전자를 이용하면 분자생물학적으로 암의 진단이 가능함을 알 수 있었다. 저자들은 이러한 결과를 뒷받침하기 위해 MAGE A(+)인 종양세포를 객담에 섞어 객담 1 ml에 1~4개 이상의 종양세포가 존재하여도 본 검사법으로 검출이 가능함을 밝힌 바 있다.¹⁷⁾ 따라서 객담 내 암세포의 숫자의 많고 적음이 아니라 MAGE A 유전자를 발현하는 암세포 자체가 존재하기만 하면 본 검사법으로 검출될 확률이 높다는 면에서 대단히 민감도가 높은 검사법임을 알 수 있었다. 
   본 연구에서 위양성율은 5%(2예)로서 기존의 종양표지자인 AFP, CEA에 비교하면 위양성율이 현저하게 낮다. 그러나 비록 위양성율이 낮다고 하더라도 MAGE A mRNA가 객담에서 위양성으로 검출되었다는 것은 MAGE A가 암 특이적으로 발현된다는 지금까지의 저자들의 연구결과와는 다르다. 저자들은 위양성의 원인으로 nested RT-PCR의 높은 민감도, 검사과정에서 발생할 수 있는 RNA의 오염, 객담 내 세포의 초기암화 과정 등이 관련될 수 있다고 생각한다. MAGE transcripts는 암조직에서 발현될 뿐만 아니라 초기암화 과정(early carcinogenesis)에 있는 암세포에서도 검출된다. Lee 등⁵⁾도 비록 1예이기는 하지만 후두백반증에서 MAGE A가 양성으로 발현되는 것을 보고하였다. 본 연구에서 위양성으로 나온 대조군은 진정한 의미에서 위양성일 수도 있지만 모두 흡연의 경력을 가지고 있는 것을 감안하면 초기암화 과정의 가능성도 있다. 따라서 장기간의 경과관찰을 요하는 암발생의 고위험군에 속할 수도 있을 것으로 생각한다. 실제로 본 연구 대상 중 1예에서는 후두백반증으로 경과관찰 중 MAGE A가 검출되었으나 전신마취하의 조직검사 상 이형성증으로 나왔고 이후 경과관찰 중 편평세포암종으로 확인된 예가 있다. 이러한 소견은 MAGE A 검사는 이형성 단계에서 암으로의 전환 여부를 평가하는데 있어 유용한 방법이 될 수 있음을 암시한다. MAGE A 위양성군이 향후 어떤 과정을 거칠지는 장기간의 관찰이 필요하다.
   후두, 하인두 암에 대한 방사선치료는 치료 후 후두나 하인두에 부종이나 괴사 등을 일으켜서 잔존암 혹은 재발암과의 감별이 힘들게 하여 치료 후 재발암의 조기 발견에 어려움을 주고 있다. 대상 예 중 경과 관찰시 재발이 6예에서 발생하였고 이 중 3예(성문상부암 2예, 하인두암 1예)는 객담으로부터 MAGE A 유전자의 검출로 모두 조기에 재발암 혹은 잔존암을 발견하는 것이 가능하였다. 우리의 증례에서 일부 재발된 성문상부암이라도 조기에 발견되었기에 레이저를 이용한 성문상부후두절제술로 구제 수술이 가능하였고 수술 후 1년 이상 경과한 현재까지 재발의 소견이 없다. 이처럼 객담 내 MAGE A 검사는 방사선 치료 후의 괴사나 부종 등을 암의 재발이나 잔존암과의 감별에 큰 도움이 될 수 있을 것으로 판단된다.
   객담에는 후두, 인두의 세포뿐만 아니라 폐에서도 세포가 떨어져 나오기 때문에 MAGE A를 이용한 객담검사는 두경부암의 진단뿐만 아니라 암의 발생빈도가 훨씬 더 높은 폐암의 진단에도 도움이 될 수 있다. 이 연구에 포함된 2예의 원발성 폐암과 2예 전이성 폐암 모두에서 MAGE A가 검출되었다는 것은 대단히 고무적이다. 두경부암의 원격전이가 가장 많이 일어나는 장기가 폐라는 점을 감안하면 MAGE A 검사는 중복암 혹은 폐전이의 조기진단에도 크게 도움이 될 것으로 생각한다.

결     론 

   저자들이 고안한 common MAGE primer로 객담 검사를 통해 후두암, 인두암, 폐암의 존재를 높은 민감도와 특이도로 검출하는 것이 가능하였다. 이러한 결과는 객담 내 MAGE A mRNA의 검출이 비침습적이고 반복적 검사가 용이함으로서 두경부암의 검색 그리고 재발과 폐전이의 조기발견을 위한 새로운 종양표지자로 활용될 수 있음을 의미한다고 생각한다.

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