교신저자：장형욱, 705-718 대구광역시 남구 대명4동 3056-6  대구가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   중이 점막은 상기도 점막의 일부로 기도점막과 같이 대표적인 점액성 분비물인 점액을 분비하며 분비된 점액은 중이 점막의 섬모에 의해 이관을 통하여 비인강으로 배출된다. 정상 점막인 경우 점액은 점액섬모수송체계의 주요한 요소일 뿐 아니라 세균 외부 세포막의 단백질과 결합하는 능력이 있어서 세균 침범시 세균을 국소화시키는 방어작용의 역할도 한다.¹⁾ 그러나 염증 반응이 일어났을 경우 중이 점막은 이형성이 일어나게 되어 중이 상피세포는 배세포와 점액분비선의 증식으로 점액의 분비가 많아지고 분비물의 점도가 증가하며 점액섬모수송체계의 장애를 일으켜 중이 질환이 발생되는 원인 인자가 되기도 한다.
   점액은 폴리펩타이드를 주골격으로 이질성의 큰 당질화를 곁가지로 가진 큰 분자량의 다당단백질 구조로 이루어져 있다.¹⁾ 이러한 이질성의 큰 당질화 때문에 중심 골격인 점액 폴리펩타이드에 대한 특이적인 항체를 만드는 것이 어려워 점액유전자에 대한 연구는 주로 mRNA를 측정하는 방법으로 이루어지고 있다.²⁾³⁾ 
   점액유전자(MUC)는 현재까지 MUC1, 2, 3A, 3B, 4, 5AC, 5B, 6, 7, 8, 11, 12, 13, 15, 16의 15개가 발견되었으며,^4)5)6)7) 이중 인체 중이 점막에서 발현되는 점액유전자는 배양된 passage-2 중이상피세포에서 MUC1, 2, 5AC, 5B, 8 mRNA가 발현되었으며,⁸⁾⁹⁾ 중이 수술시 채취한 중이 점막에서 MUC4, 5B의 발현이 보고되었다.¹⁰⁾¹¹⁾ 배양된 중이상피세포를 이용한 연구에 비해 인체의 정상 상태나 병적인 상태에서 채취한 중이와 유양동 점막을 이용한 연구는 중이 질환에 의한 점액의 발현 기전을 밝혀내는데 더욱 생리적인 조건을 기초로 하고 있다. 하지만 비강 등의 조직 채취에 비해 정상적인 중이 및 유양동 점막을 얻기가 어렵고, 채취할 수 있는 점막의 양이 한정되어 있어 연구에 어려움이 있다. 
   기도점막의 말초 부위에 해당되는 유양동 점막은 중이 점막과 더불어 만성 중이염에서 점막의 비후 및 점액의 과분비에 관여할 것으로 알려져 있다. 이러한 유양동 점막에서 점액유전자의 발현에 대한 보고는 없었다. 이에 저자는 정량적 역전사 중합효소연쇄반응 장치로 알려진 LightCycler(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)를 이용하여 정상과 염증성 인체 유양동 점막에서 점액유전자인 MUC1, 2, 4, 5AC, 5B, 8의 발현을 알아보고 이를 비교적 방법으로 정량화하여 염증시 증가하는 점액의 양상을 알아보고자 하였다. 

대상 및 방법

   실험군은 3개월 이상 염증의 병력을 가진 만성중이염 및 진주종성 중이염 환자 12명을 대상으로(남자 3명, 여자 9명, 평균연령 45.2세) 하였으며, 수술전 측두골 단층촬영상 상고실과 유양동내 병변이 나타나는 환자에서 유양동삭개술을 시행하여 염증 조직을 채취하였고 대조군으로는 인공 와우 수술을 받은 환자 5명에서(남자 3명, 여자 2명, 평균연령 12.1세) 정상 유양동 점막을 채취하였다. 
   점막 채취 부위를 일정하게 하기 위하여 유양동 점막은 유돌동구(aditus ad antrum) 부위의 점막을 채취하였다. 채취한 점막은 즉시 액화질소로 냉동하였으며 실험 할 때까지 -70도에 보관하였다. 실험전 실험군과 대조군 환자에게 실험의 배경을 설명하여 동의를 구하였으며, 의료원의 윤리위원회에도 허락을 받아 시행하였다. 

Hematoxylin and eosin 염색 
   유양동 점막의 표본을 일반적인 방법으로 H & E stain을 시행하였다. 수술 중 채취한 조직을 10% 중성 포르말린에 담궈 하룻밤 동안 고정한 후 파라핀에 포매하여 사용하였다. 5 μm 두께로 절단하여 0.1% hematoxylin(pH 4.0)으로 10~15분간 염색한 후 흐르는 물에 세척하고 1% eosin Y(pH 6.0) 용액에 담구어 염색시키고 증류수로 세척한 다음 탈수하였다. 400배 광학현미경으로 3구역을 임의로 선택하여 대식세포, 임파구, 백혈구 등의 염증세포의 수를 계측하여 평균값을 구하여 조직내 염증의 정도를 알아보고자 하였다. 

점액유전자의 정량적 역전사 중합효소연쇄반응

Total RNA 추출
   채취한 조직을 가압 멸균된 eppendorf tube에 넣고 Trizol을 1 mL 첨가하여 세포를 균질화시키고 15~30℃에서 5분간 둔 후 chloroform 200 μl을 첨가하여 흔들어 잘 섞이게 하였다. 4℃에서 12000 rpm으로 15분간 원심분리 후 상층액을 채취하고 수거한 상층과 동량(약 0.5 mL)의 100% isopropanol을 첨가하여 흔들어 섞은 후 -20℃에 두어 하룻밤 동안 침전시킨 다음 12000 rpm으로 10분간 원심분리하여 RNA pellet을 얻었다. 여기에 70% ice cold ethanol을 1 mL를 첨가하여 RNA pellet을 세척하고 12000 rpm으로 5분간 원심분리 후 상층액을 제거하고 DEPC(Diethyl pyrocarbonate) 처리된 탈이온수를 20~30 μl 넣어 RNA pellet을 녹였다. 녹인 RNA는 분광광도계인 DU 530(Beckman instrument, CA, USA)를 이용하여 260 nm, 280 nm에서 순도 및 정량을 하고 이 중에서 순도가 1.8 이상인 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하였다.

cDNA의 합성
   추출한 RNA를 대상으로 reverse transcription system (Promega Co, Madison, USA)을 이용하여 cDNA를 합성하였으며, 역전사 중합효소연쇄반응의 조건은 다음과 같다. 5×MMLV buffer 4 μl, 10mM dNTP 2 μl, oligo dT(50 pmol/μl) 1 μl, MMLV reverse transcriptase(200 U/μl) 0.5 μl, RNase inhibitor(40 U/μl) 0.5 μl로 구성된 중합효소연쇄반응 시약에 RNA 12 μl(200 ng/μl)을 주입하여 총 20 μl를 Eppendorf master cycler(Eppendorf Co, Foster, USA)으로 증폭하였다. 42℃에서 60분간, 95℃에서 5분간 유지하여 역전사효소를 무력화시킨 뒤 5℃에 냉장시켰다. 

정량적 중합효소연쇄반응
   합성된 cDNA를 대상으로 LightCycler system(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)을 이용하여 FastStart PCR 시약으로 정량적 역전사 중합효소연쇄반응을 시행하였다. 즉 멸균 증류수 13.2 μl, 25 mM MgCl2 2.4 μl, forward & reverse primer(50 pmol/μl) 각각 0.2 μl(0.5 μM)에 FastStart Taq DNA polymerase와 DNA double-strand specific SYBR Green I dye가 포함된 중합효소연쇄반응시약 2 μl를 섞어 유리 capillary에 넣고 합성된 cDNA 2 μl를 첨가하여 총 20 μl를 증폭하였다. 증폭과정은 MUC4의 경우 FastStart Taq DNA polymerase 활성을 위해 95℃ 10분(전변성과정), 95℃ 15초(변성반응), 62℃ 3초(결합반응), 72℃ 25초(연장반응)으로 구성된 증폭과정을 40회 시행하였다. 이후 65℃에서 95℃까지 초당 0.1℃/s의 속도로 가열하는 용해(melting) 과정과 40℃로 내려주는 냉각(cooling) 과정을 시행하였다. 중합반응시 형광 신호를 컴퓨터를 통해 측정하였다. 각 조직에서 증폭된 cDNA의 유무를 확인하기 위하여 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 대조 유전자(internal control)로 사용하였으며, 표본을 넣지 않은 것을 음성 대조군으로 하였고 나타난 PCR 산물이 genomic DNA오염이 없다는 것을 증명하기 위해 중합반응시 RT enzyme을 넣지 않고 시행하여 중합반응 후에도 아무런 band가 나타나지 않음을 확인하였다. 사용한 시발체의 유전자의 위치, 염기서열, 증폭산물의 크기는 Table 1과 같다. 
   결합반응 온도는 GAPDH 62℃, MUC1 62℃, MUC2 56℃, MUC4 62℃, MUC5AC 64℃, MUC5B 66℃, MUC8 54℃이었다. 유전자의 발현정도는 중합효소연쇄반응 주기 40회를 cut-off로 하여 측정하였다. 최종 PCR 산물은 전기영동을 시행하여 결과를 확인하였다.

중합효소연쇄반응의 상대적 정량화
   증폭된 중합효소연쇄반응 산물의 정량화를 위하여 분광광도계를 이용하여 농도를 측정한 GAPDH를 함께 증폭하여 threshold cycle 수를 얻었고 이를 기준으로 표준검량선을 작성한 후 이 검량선의 수식에 의하여 검체내 점액유전자 각각의 산물을 정량화하는 상대적 정량법을 사용하였다. cDNA가 증폭되면 SYBR Green I dye가 결합하여 형광을 발생하는데, 증폭된 DNA 양이 많을수록 형광이 처음으로 검출되는 연쇄반응 주기의 시점이 빨라짐을 이용하여 threshold cycle 수를 구하였다. 각 점액유전자의 농도를 GAPDH의 농도로 나누어 정상화된 점액유전자의 농도를 구하고, 이 값을 정상화된 대조군의 평균 점액유전자 수치로 나누어 만성 염증시 정상에 비하여 증가한 점액유전자 mRNA 발현을 상대적으로 정량화하였다. 

통계분석
   정상 점막군과 염증성 점막군에서 발현하는 점액유전자 차이는 Mann-Whitney’s U법을 사용하였으며 조직내 침윤한 염증세포와 점액유전자 발현과의 관계는 Spearman rank correlation법을 이용하였으며 유의수준은 p<0.05로 하였다.

결     과

정량적 중합효소연쇄반응
   농도를 알고있는 GAPDH RNA를 이용하여 표준검량선을 측정하였으며 유의적인 상관관계(γ=0.992)를 보였다(Fig. 1). 
   정상 유양동 점막에서 MUC1, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC8은 발현되었으나 MUC2는 발현되지 않았고 염증성 유양동 점막에서도 MUC1, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC8이 발현되었으나 MUC2는 발현되지 않았다(Table 2)(Fig. 2). 
   염증성 유양동 점막에서 정상 점막에 비해 MUC1 1.2±1.1배, MUC4 3.2±2.5배, MUC5AC 2.5±1.0배, MUC5B 4.1±2.2배, MUC8 2.7±2.1배 증가로 MUC5B의 발현증가가 가장 현저하여 정상 유양동 점막에 비하여 의미 있는 증가를 보였다(Fig. 3)(p<0.05). MUC5B를 제외한 다른 유전자에서는 정상과 염증성 유양동 점막에서 발현하는 점액유전자의 차이가 없었으나 염증에 의하여 점액 유전자의 발현은 증가하였다. 

MUC mRNA 발현율과 조직내 침윤한 염증세포의 상관관계
   염증성 점막을 H & E 염색하여 조직내 침윤한 염증세포를 구하였으며(Table 3), 염증성 유양동 점막에서 조직내 침윤한 염증세포와 MUC mRNA 발현 상관관계는 MUC1 γ=0.764, MUC4 γ=0.743, MUC5AC γ=0.696, MUC5B γ=0.734, MUC8 γ=0.725의 양성관계를 나타내었으며 MUC5AC를 제외한 점액유전자는 유의한 상관관계를 나타내었다(Fig. 4)(p<0.05). 

고     찰

   중이염은 대표적인 귀의 염증성 질환으로 중이강내 염증세포의 침윤, 염증매개물질의 증가 및 점액 유전자 발현의 증가로 인하여 점액의 분비가 정상에 비해 증가하는 것으로 알려져 있다.¹²⁾ 조직학적으로 배세포와 점막하 분비선을 많이 함유하는 호흡 상피인 가중층 섬모상피(pseudostratified ciliated epithelium)로 구성된 이관과 달리 정상 중이 점막은 배세포와 섬모세포의 수가 적으며 점막하층에는 점액분비선이 없는 입방상피 혹은 편평상피로 구성된 변형 호흡상피의 형태를 취하며 이러한 상피 구조는 유양동으로 갈수록 단층의 편평상피로만 구성되어 있다.¹³⁾ 그러므로 정상 중이에는 염증세포의 수가 극히 드물며 분비선도 거의 없다.¹⁴⁾ 하지만 염증이 발생할 경우 중이와 유양동의 점막은 이형성을 일으켜 호흡상피인 가중층 섬모상피로 변화되며 염증세포의 수가 증가하게 되고 이와 함께 배세포의 수와 점막의 일부가 함몰하여 형성된 가점막하 분비선도 증가하여 중이강내로 분비물이 증가하게 되며 이러한 분비물 중 대표적인 물질이 점액이다.¹³⁾ 
   점액은 구조와 세포내 위치에 따라 세포막형 점액(membrane associated mucin)과 분비형 점액(secretory mucin)으로 나누어진다.¹²⁾ 세포막형 점액은 점액의 당질화 부위가 세균 세포벽의 리간드와 결합하여 세균을 전이증식시키며, 세포 보호, 점착, 점막상피의 세포증식에 관여하며 발암현상, 종양세포 침범, 전이에도 관여하는 것으로 알려져 있다.^3,14) 분비형 점액은 세포내 점액 과립내에 모여있다가 점막상피의 표면으로 분비되어 점액층을 형성하여 상피를 보호하고 미생물로부터의 침입을 방지하는 역할을 한다. 현재까지 알려진 점액유전자 중 MUC1, 3A, 3B, 4, 11, 12, 13, 15, 16은 세포막형 점액이며, MUC2, 5AC, 5B, 6, 7, 8 등은 분비형 점액인 것으로 보고되어 있다.^4)5)6)7) 
   인체의 하기도에서는 MUC1, 2, 3, 4, 5AC, 5B, 7, 8이 발현되는데 주로 MUC5AC가 발현되며, MUC5B는 약하게 발현된다.¹⁵⁾ 비점막과 상악동 점막에서는 MUC1, 2, 4, 5AC, 5B, 7, 8가 발현되며 MUC3, 6은 발현되지 않는다.¹⁶⁾ Hutton 등¹⁷⁾은 소아 만성 삼출성 중이염의 중이 저류액에서 MUC5A와 5B을 확인하였다. 중이점막 상피세포를 배양한 실험에서 MUC1, 2, 5AC, 5B, 8 mRNA 유전자가 발현하는 것으로 보고하고 있으며,¹⁾⁸⁾⁹⁾ Kawano 등¹⁰⁾은 중이염 수술시 채취한 중이점막에서 MUC5B가 발현한다고 보고하였고, Lin 등¹⁸⁾은 사체와 중이 수술시 채취한 점막을 대상으로 이관부위에서는 MUC1, 4, 5AC, 5B가 발현하고, 정상 중이 점막에서는 MUC5B가 약하게 발현하지만 염증이 있는 중이 점막에는 MUC5B의 발현이 4.2배, MUC4는 6배의 증가를 보인다고 하였다. 이처럼 하기도에서는 MUC5AC, 이관부위에는 MUC5AC와 MUC5B, 중이에서는 MUC5B가 발현되는 주요한 점액으로 기도의 위치에 따라 다른 발현의 양상을 보이고 있다. 
   본 연구에서는 정상 및 염증성 유양동 점막에서 MUC1, 4, 5AC, 5B, 8은 발현되었으나 위장관에서 주로 분비되는 것으로 알려진 MUC2의 발현은 관찰되지 않았으며 염증성 유양동 점막에서 MUC5B는 모든 예에서 발현되었고, MUC8, MUC1, MUC4, MUC5AC의 순으로 발현되는 양상을 보였다. 사용한 유양동 점막의 전례에서 점액유전자가 발현하지 않고 점액유전자의 종류에 따라 일부에서만 발현한 것에 대한 이유로 유양동 점막에서 발현하는 유전자에 대한 보고가 없어 비교할 수는 없지만 다음과 같이 생각할 수 있다. 첫째, 기도의 위치에 따라 주로 발현하는 점액유전자의 양상이 다르기 때문일 수 있으며 둘째, 기도나 코점막과 달리 생체에서 채취할 수 있는 유돌동구 점막의 표본량이 소량이기 때문에 중합효소연쇄반응을 하더라도 적은 량의 점액유전자를 발현시키는데 현실적인 한계가 있기 때문일 수 있다. 정량적 분석으로 염증성 유양동 점막에서는 정상에 비하여 MUC5B의 발현이 4.1배의 증가를 보였으며, MUC4는 3.2배, MUC8은 2.7배, MUC5AC는 2.5배, MUC1은 1.2배 증가를 보였다. 염증성 질환이 발생하였을 때 세균 내독소가 cytokine인 TNF, interleukin, GM-CSF 등의 생산을 자극하게 되고 과생산된 cytokine은 염증세포를 다시 자극하여 염증매개물질을 증가시키며 또한 점막과 배세포를 증식시키고 점액유전자를 과조절하여 점액의 생산이 많아지는 것으로 알려져 있으나¹⁶⁾ 이러한 점액분비의 기전이 유양동 점막에서도 동일하게 일어나는지는 알려져 있지 않다. 염증성 유양동 점막에 침윤한 염증세포와 MUC1, 4, 5B, 8 mRNA의 발현은 높은 양성 관계를 보였으며, 염증 세포의 침윤이 많을수록 점액유전자 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 그러므로 염증시 점액유전자 발현의 증가는 정상 유양동 점막이 염증성 변화에 의하여 여러 염증 매개체에 노출되기 때문으로 생각되며 만성중이염이 발생하였을 때 염증성 변화는 중이 뿐 아니라 유양동에서도 동시에 일어나며 이에 따라 유양동 점막에서도 점액 유전자의 발현이 증가하게 되고 향후 과생산된 점액분비에 관여할 것으로 생각된다. 
   Kawano 등¹⁰⁾은 In situ 보합법으로 중이점막을 대상으로한 연구에서 MUC4, 5B의 경우 역전사 중합효소연쇄반응법과 In situ 보합법으로 발현을 확인할 수 있으나, MUC5AC는 발현율이 낮아서 역전사 중합효소연쇄반응법에서만 발현을 확인할 수 있다고 하였다. 
   Lightcycler^®에서 사용하고 있는 정량적 중합효소연쇄반응은 SYBR Green I^® 검출시약을 이용하여 중합효소연쇄반응이 일어날 때 이 검출시약이 DNA의 이중나선 구조와 결합하여 형광을 나타낸다.¹⁹⁾ Lightcycler^®는 중합효소연쇄반응이 일어나는 동안 시험관의 마개를 통하여 이중나선 DNA와 결합하는 SYBR Green I^® 염색제의 형광을 지속적으로 측정함으로써 연쇄반응 산물의 양을 측정하며 중합효소연쇄반응 증폭 산물의 수가 많을수록 증폭 산물이 일찍 나타나는 결과를 이용하여 중합효소연쇄반응의 증폭 산물이 처음 나타났을 때의 threshold cycle을 측정하여 주입된 DNA의 양을 정량화 할 수 있으며 최종산물의 확인은 전기영동을 시행하지 않고도 알 수 있어 시간적, 경제적인 장점이 있다. 본 연구에서 Lightcycler^®의 threshold cycle치는 실제농도와 0.992의 우수한 상관과 직선성을 나타내어 점액유전자 mRNA의 상대적 정량화에 적합하였으며 향후 정량화기법에 도움이 될 것이다. 또한 본 연구와 더불어 유양동 점막에서 점액유전자의 발현이 나이에 따라 달라지는지에 대한 연구와 염증의 급성 및 아급성 발생시 증가하는 cytokine의 종류와 양에 따라 차이가 있는지에 대한 연구가 뒷받침되어야 할 것이다.

결     론

   정상 및 염증성 유양동 점막에서 MUC1, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC8은 발현되었으나 MUC2는 발현되지 않았으며 염증성 유양동 점막에서는 정상 점막(1.0±0.8)에 비하여 MUC1 1.2±1.1배, MUC4 3.2±2.5배, MUC5AC 2.5±1.0배, MUC5B 4.1±2.2배, MUC8 2.7±2.1배 증가로 MUC5B의 발현증가가 가장 현저하였다. 조직내 침윤한 염증세포와 점액유전자 발현의 상관관계는 MUC1, 4, 5B, 8에서 유의한 양성 상관관계를 나타내었으며 이 결과는 염증세포의 침윤이 많을수록 점액유전자 발현이 증가하는 것을 나타낸다. 
   이상의 결과를 종합하면 염증의 정도가 심할수록 점액유전자 MUC1, 4, 5AC, 5B, 8의 발현도 증가하여 유양동내 점액의 분비가 많아지며, 유양동 점막에서 발현하는 점액유전자의 양상은 중이에서 발현되는 유전자와 동일한 결과를 나타내었으므로 유양동 점막도 염증시 점액의 분비에 중이 점막과 같이 관여하는 것을 알 수 있었다. 

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