교신저자：여상원, 137-040 서울 서초구 반포동 505번지  가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   급성 중이염과 삼출성 중이염은 소아에서 흔히 볼 수 있는 질환으로 어린이의 90% 이상에서 만 7세 이전에 적어도 한번 이상은 중이염을 앓으며 이 중 3분의 2에 해당하는 소아에서는 3~4회 이상 중이염이 발생하는 것으로 알려져 있다.¹⁾ 최근 국내에서 발표된 논문들을 살펴보면 소아 삼출성 중이염의 유병률은 약 10~15%에 이르는 것으로 보고 되고 있다.²⁾³⁾ 하지만 오랜 동안의 연구를 통해 소아 중이염의 원인과 발병기전을 밝히는 데 많은 진전이 있어왔지만 아직도 과거와 크게 달라진 바 없이 상당수의 아이들은 오랜 기간 동안 항생제나 스테로이드 등의 약물 투여와 환기관 삽입, 아데노이드 절제술 등의 수술적 치료를 받아야만 하는 실정이다.
   만성적인 삼출성 중이염의 원인으로는 이관기능장애, 알레르기, 숙주인자, 세균, 그리고 여러 염증매개물질이나 그 부산물 등의 다양하고 복잡한 작용인 것으로 알려져 있다.³⁾ 한편 중이 점막에서 발생하는 면역 반응들 또한 삼출성 중이염의 원인과 발병기전에 중요한 역할을 담당할 것으로 생각되고 있으며 여러 동물실험과 삼출액의 분석을 통해 면역 복합체, 면역글로블린, 보체, 임파구 등의 존재와 역할에 대한 많은 연구가 보고되고 있지만⁴⁾⁵⁾⁶⁾ 아직까지 명확히 알려진 것은 없는 실정이다. 이러한 면역 반응들이 중이염에서 병의 진행을 막고 세균의 증식을 억제하는지 아니면 오히려 중이 점막의 염증을 유발하고 지속시키는지에 대한 것조차 아직 잘 알려져 있지 않다.
   저자들은 항생제의 사용으로 인해 세균이 사멸된 중이 내에서 세균의 항원성을 갖는 물질에 의한 중이강 내 면역반응이 염증을 지속하게 하는 원인 중의 하나로 생각하여 세균이 사멸한 이후에도 지속적으로 중이강에 남아 염증 및 면역 반응을 유발하는 물질로 알려진 Lipopolysaccharide (LPS)를 중이강에 주입하여 유발된 중이염모델에서 면역 반응을 억제하였을 때 중이점막의 염증과 분비세포로의 화생 정도가 어떻게 변화하는가를 알아보고자 하였다. 면역반응의 억제는 가역적으로 T helper 세포에만 선택적으로 작용하여 세포매개면역반응과 부분적으로 항체매개면역반응을 억제하는 강력한 면역억제제인 Cyclosporin A를 사용하였으며 투약 후 중이 점막에서 나타나는 조직학적 변화를 관찰하고 기존의 약물치료 중의 하나인 스테로이드를 투여하였을 때의 효과와 비교하여 보고자 이 실험을 고안하였다.

재료 및 방법

실험동물 및 중이염의 유발
   동일 조건 하에 사육된 약 230 gm의 성숙한 수컷 Sprague-Dawley계 흰쥐 34마리를 케타라(Ketamine hydrochloride, 유한양행, 서울, 한국) 50 mg/kg과 럼푼(Xylazine, 한국바이엘, 수원, 한국) 5 mg/kg을 근육 주사하여 마취상태에서 수술용 현미경으로 외이와 중이의 이상유무를 확인한 후 이 중 30마리의 우측 중이강에 100 μg/ml농도의 Lipopolysaccharide(LPS) Pseudomonas aeruginosa serotype 10(L-9143；Sigma Chemical Co. Saint Louis, USA) 35 μl를 고막을 통해 Tuberculin 주사기를 이용하여 주입하였으며 좌측 중이강에는 동량의 멸균 생리식염수를 주입하였다.

실험군의 분류
   LPS를 주입하지 않은 4마리의 실험동물의 양쪽 중이강에 35 μl의 멸균 생리식염수를 주입하고 정상 대조군으로 사용하였다. LPS를 주입한 30마리의 실험동물 중 10마리는 아무런 처치를 시행하지 않았으며(1군), 10마리는 디나트륨인산 덱사메타손(Dexamethasone disodium phosphate, 유한양행, 서울, 한국) 주사액을 1 mg/kg의 용량으로 LPS주입 직후 매일 모든 개체의 둔부근육에 주사하였고(2군), 10마리는 산디문(Cyclosporin A, 한국 노바티스, 안산, 한국) 주사액을 20 mg/kg의 용량으로 LPS주입 직후 매일 모든 개체의 배부 피하에 주사하였다(3군).

중이관찰 및 염색
   정상 대조군 2마리와 실험군 각각 5마리씩의 흰쥐를 2일과 6일째에 케타라(Ketamine hydrochloride, 유한양행, 서울, 한국) 50 mg/kg과 럼푼(Xylazine, 한국바이엘, 수원, 한국) 5 mg/kg을 근육 주사하여 마취시킨 후 수술용 현미경 하에 고막과 중이강 내 삼출액의 유무와 성상을 확인하고 개흉하여 심장을 노출시킨 후 헤파린으로 처리한 40°C의 생리식염수와 인산완충용액(0.1M, pH 7.4)에 용해한 4% paraformaldehyde로 심장관류를 통해 고정하였다. 측두골을 적출하고 4% paraformaldehyde로 40°C에서 하루밤 고정한 후 인산완충용액(0.1 M, pH 7.4)으로 세척한 후 Calci-Clear Rapid(National diagnostics, Atlanta, USA)용액에 1일간 담구어 탈회하고 수술현미경 하에서 각각의 측두골 마다 절개되는 부위가 최대한 일정하도록 동일한 방향에서 측두골을 수직으로 2등분하는 방향으로 절개를 가하여 이관의 고실 입구부위, 고실갑각과 이낭을 모두 관찰할 수 있도록 한 후 파라핀에 포매하였다. 포매된 조직을 미세 절편기를 이용하여 5 μm 두께로 절편한 후 슬라이드에 부착시켰으며 중이점막과 이낭점막의 일반적인 관찰을 위해 Hematoxyline-Eosin 염색을 하였고 점액분비세포의 관찰을 위해 Periodic acid-Schiff(PAS) 염색을 실시하였다.

결과 판정

중이삼출액
   수술현미경 하에서 중이강 내 삼출액의 유무를 확인하고 수집한 후 양을 측정하였다.

Hematoxylin-Eosin 염색 조직소견
   고실갑각, 이낭, 이관의 고실 입구부에서 기저막이 뚜렷하게 관찰되는 조직절편을 두 명의 관찰자가 다음을 관찰하였다.

상피하층의 두께변화
   각각의 부위에서 점막과 점막상피하층의 두께가 가장 두꺼운 부위를 중심으로 광학현미경의 대안렌즈에 부착시킨 격자(10×10 cells；25×25 μm/격자)를 이용하여 400배 시야에서 점막상피에서 골막까지의 거리를 측정하여 염증에 의한 상피와 상피하층의 비후를 비교하였다.

염증세포의 침윤도
   같은 부위에서 400배 시야로 격자를 이용하여 격자 내에 있는 상피와 상피하층에 침윤되어 있는 염증세포의 수를 세어 비교하였다.

혈관변화
   같은 부위에서 400배 시야로 격자 안에서 관찰되는 상피하층의 혈관수를 세어 각 군 간의 혈관의 변화를 관찰하였다.

Periodic acid-Schiff(PAS) 염색 조직 소견
   각 개체별로 고실갑각, 이낭, 고실내 이관입구부위의 상피세포의 분비성 점막으로의 화생(metaplasia)으로 인해 PAS 염색에서 양성을 보이는 정도를 200배 시야에서 관찰하여 상피 전체가 양성반응을 보이는 경우를 100%로 하고 이후 75%, 50%, 25%, 0%의 5단계로 분류하여 비교하였다.

통계적 검증
   각 실험군 간의 자료를 SPSS 10.0 for Windows 프로그램을 이용하여 유의수준 5%로 정상 대조군, 비치료군, Cyclosporin A 치료군, 스테로이드 치료군 간의 차이는 Kruskal-Wallis 검정으로, 비치료군과 Cyclosporin A 치료군, 스테로이드 치료군과 Cyclosporin A 치료군의 차이는 Mann-Whitney의 U 검정으로 통계적 검증을 실시하였다.

결     과

중이강 내 삼출액의 유무 및 성상
   수술 현미경 하에서 중이강 내의 염증상태와 삼출액의 유무와 성상을 관찰한 결과 모든 정상 대조군과 개체 간 대조군에서는 삼출액이 관찰되지 않았으며 조직의 염색을 통해 염증이 없는 정상 점막임을 확인하여 실험과정 중 발생할 수 있는 세균 감염을 배제하였고 2일째 희생한 실험동물 중 LPS주입 후 비치료군에서는 5귀 중 4귀에서 평균 약 30 μl의 장액성 삼출액이 측정되었으며 스테로이드 투여군에서는 5귀 모두에서 미량의 장액성 삼출액이, Cyclosporin A 투여군에서는 5귀 중 2귀에서 미량의 장액성 삼출액을 관찰할 수 있었으나 그 양을 측정하지는 못하였다. 6일째 희생한 실험동물에서는 모든 개체에서 삼출액의 존재를 관찰할 수 없었다.

Hematoxylin-Eosin 염색 조직소견
   이낭과 중이강내 고실갑각과 이관 입구부위 점막의 염증 정도를 비교하였을 때(Fig. 1) 2일째 희생된 실험동물에서는 스테로이드 투여군과 Cyclosporin A 투여군 모두에서 비치료군에 비해 상피하층의 두께나 염증세포의 침윤, 혈관변화의 감소가 관찰되었으나(p<0.05) 두 치료군 간의 차이는 없었다(Table 1). 이관 입구 부위에서는 Cyclosporin A 투여군에서 스테로이드 투여군 보다 상피하층의 두께와 염증세포의 침윤이 전반적으로 감소되어 있었으나 통계적 유의성은 없었다. 6일째 희생한 실험동물에서는 비치료군에서 2일째 조직에 비해 염증의 감소가 일어난 반면 두 치료군에서는 2일째에 비해 큰 변화가 없었고 두 군 간의 차이도 없었다(Table 2).

Periodic acid-Schiff(PAS) 염색 조직 소견
   PAS 염색 결과 Cyclosporin A 투여군에서 스테로이드 치료군 및 비치료군에 비해 양성도가 더 감소하였음을 확인할 수 있었으며(Figs. 2, 3 and 4) 6일째에는 통계적으로 유의하게 감소한 결과를 보였다(p<0.05). 스테로이드 치료군의 경우 6일째에는 비치료군과 거의 유사한 양성도를 보였다(Figs. 3 and 4).

고     찰

   항생제나 다른 약물에 반응하지 않으며 오랜 기간 지속되는 삼출성 중이염은 주로 지속적인 이관기능장애와 삼출액의 저류에 의한 것으로 생각되며 이때 중이강 내에서 일어나는 면역 반응들은 중이점막의 손상과 삼출액의 분비에 많은 역할을 할 것이라고 생각되고 있다.⁷⁾
   정상 상태의 중이점막의 면역계는 다른 호흡기점막과 달리 점액선이 거의 없고 배낭세포의 밀도도 적고 림프모양 여포조직(lymphoid follicle)도 없으며 형질세포나 림프구가 없는 특징을 가지고 있다. 반면 중이염으로 이환된 점막은 일반적인 다른 점막조직과 유사한 면역체계를 띠게 되는데 Bernstein 등은 중이염 환자의 삼출액과 점막조직의 면역학적인 연구에서 중이점막에 적절한 항원자극이 주어졌을 때 국소적으로 특정항체를 형성할 수 있는 체액성 면역반응을 보이며 세포매개면역반응에 대해서는 아직 많은 부분이 밝혀지지 않았지만 장액성 삼출액에서 림프구 중 T세포와 그 중 T helper세포가 점액성 삼출액에서는 B세포가 많으며 T세포 중에는 T suppressor세포가 주된 염증세포라고 보고하였으며 중이염의 삼출액은 국소적인 면역반응에 의한 산물임을 시사하였다.⁴⁾ 또한 중이염 환자의 삼출액에서 IgG, A, M, D, E의 면역 글로블린과 보체, 항원항체의 면역 복합체, IL-1, IL-2, IL-6, 감마 인터페론 등의 물질이 검출되며, 세균감염에 의한 중이염 발병 후에 그 세균의 항원형에 동일한 항체가 환자의 혈청에서 발견되었다는 보고들은 면역반응이 삼출성 중이염의 원인, 발병기전에 중요한 역할을 하고 있을 것으로 생각하게 한다.⁵⁾⁸⁾ 아직 많은 연구에도 불구하고 삼출성 중이염에서 체액성 면역과 세포매개 면역반응의 임무가 무엇인지는 아직도 정확히 알지 못하고 있지만 다소 시간이 지난 후 동원되는 면역 글로블린 IgG는 세균의 사멸과 중성구의 대식작용을 증가시키는 역할을 하며 면역반응 초기에 중이에 도달하는 면역 적격세포 들은 여러 cytokines을 분비하며 염증을 주도하는 것으로 생각되고 있다.⁹⁾
   Cyclosporin A는 원래 항진균제로 개발된 약으로 골수억제가 없는 강력한 면역 억제작용으로 장기이식 거부반응의 예방약으로 널리 사용되어 오고 있으며 면역반응의 초기 유도기에 T세포의 활성화 과정에서 정상적으로 유도되는 다수의 cytokines(IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, TNF-α) 유전자들의 발현을 억제하여 T세포의 증식을 차단한다. 또한 T세포에서 분비되는 cytokines과 관련된 B세포의 증식을 억제하는 것으로 알려져 있다.¹⁰⁾ 이러한 억제 능력은 가역적이며 주로 세포매개 면역반응에 작용을 하며 T helper 세포와 관련된 항체매개면역반응에도 강력한 억제작용을 하지만 직접적으로 B세포를 자극하는 항원에는 효과가 적은 것으로 알려져 있다.¹¹⁾ 임상적으로 장기이식이외에도 결체조직성 관절염,¹²⁾ 중증근육무력증,¹³⁾ 자가면역성 포도막염¹⁴⁾ 등 여러 자가면역 질환에 대한 실험적 연구와 임상에서 그 효과가 보고되었으며 최근에는 기존의 약물치료에 반응하지 않는 중증의 아토피성 피부염을 가진 소아에서 소용량(low dose) 치료법으로 좋은 효과를 보이고 있다고 보고되고 있다.¹⁵⁾
   이비인후과 영역에서는 아직까지 Cyclosporin A의 사용에 관한 보고가 없는데 본 실험에서 저자들은 중이염 환자의 만성적인 염증 및 삼출액의 분비의 원인이 이관기능이 저하된 폐쇄된 중이강 내에서의 지속적인 면역 적격세포의 유입과 이에 따른 세포매개 면역 반응에 있을 수 있다는 가설을 세우고 면역억제제인 Cyclosporin A를 투여하여 그 효과를 알아보았다. 그 결과 염증의 정도는 기존의 항염증제제인 스테로이드와 거의 비슷한 정도의 억제효과를 보였으며 특히 점액선이 많이 위치한 이관 입구부위에서 스테로이드보다 다소 더 효과가 있는 것으로 관찰되었으나 시간의 경과와 투여 기간에 따른 변화는 통계적으로 유의한 차이를 관찰할 수 없었다. 하지만, 시간이 경과하면서 두 치료군의 염증의 억제정도는 감소하였고 이는 실험동물의 중이강 내의 청소능력이 작용하여 염증의 정도가 감소하였을 것으로 생각된다. 또한 6일군에서 스테로이드 치료군의 염증세포의 침윤이 다소 증가한 것으로 미루어 스테로이드 보다 면역억제효과가 강한 Cyclosporin A의 투여가 시간의 경과에 따른 염증을 더 억제한다고 생각할 수도 있을 것이나 다른 염증에 대한 인자들은 큰 차이가 없어 이를 밝히기 위해서는 더 많은 실험이 필요하리라 생각된다. 중이상피의 점액 분비상피로의 화생과 점액 분비정도를 확인하기 위한 PAS 염색에서는 스테로이드보다 더 적은 화생과 점액분비를 보여 Cyclosporin A가 삼출액을 감소시키는 데 더 효과가 있음을 시사하였다.
   Cyclosporin A는 항원에 노출된 직후부터 투여하여야 그 효과가 있는 것으로 되어 있으나 이미 진행된 면역반응에서도 50% 이상의 억제효과를 보이고 있는 것으로 보고된 바 있고¹⁶⁾ 지속적인 면역반응과 관계가 있는 알레르기성 질환에도 효과가 있으므로¹⁵⁾ Cyclosporin A의 투여가 기존의 약물치료에 반응하지 않는 만성화된 중이염에서도 염증억제 효과가 있을 것으로 사료된다. 하지만 몇 가지 문제점들을 생각해 볼 수 있는데 첫 번째로 이러한 면역억제제가 전신적으로 무차별적으로 작용하며 이로 인한 기회감염이 발생할 수 있고 아직 삼출성 중이염에서 면역기능의 역할에 대한 기전을 알지 못하기 때문에 면역기능의 억제가 오히려 실제 임상에서 중이점막의 염증을 더 조장할 가능성도 있다. 하지만 기존에 항염증제제로 사용되어 온 스테로이드의 경우에도 그 작용기전이 IL-1, TNF-α, GM-CSF, IL-3, IL-4, IL-5, 그리고 IL-8 등의 cytokines에 의한 염증 반응을 억제시키고 임파구나 호산구의 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있어¹⁷⁾ 이미 면역억제제를 실제 임상에서 사용하고 있다고 생각할 수 있다. 또한 면역억제제를 사용 중인 다른 질환에서 이러한 문제점이 용량의 조절로 해결될 수 있음이 보고되고 있다. 두 번째로 부작용에 관한 문제인데 Cyclosporin A는 대부분 간에서 대사되며 다른 면역억제제 들과는 다르게 골수억제 효과가 없고 주요 부작용으로는 신장의 근위세관(proximal tubule)에 영향을 주어 혈청 요소와 크레아티닌의 상승을 일으킬 수 있어 신장기능이 안 좋은 환자에게서는 주의를 요하며 그 외에 고혈압, 경미한 간독성 등을 일으킬 수 있다고 알려져 있다.¹¹⁾ 본 실험에서는 여러 동물실험에서 보고된 부작용이 거의 없고 효과적인 용량인 20 mg/kg의 Cyclosporin A를 가장 안정적으로 혈장농도를 유지하는 것으로 알려진 피하주사의 방법으로 투여하였으며¹⁸⁾ 실험기간 중 실험동물에서 주목할 만한 부작용은 관찰할 수 없었다. 또한 아토피성 피부염을 갖는 소아에게 투여한 여러 보고에서도¹⁵⁾¹⁹⁾ 부작용은 거의 관찰되지 않은 사실에서 부작용 없이 소아에서도 안전하게 사용될 수도 있다고 생각된다.

결     론

   저자들은 LPS로 흰쥐의 중이에 염증을 유발하고 면역억제제인 Cyclosporin A를 투여한 결과 염증의 억제와 삼출액의 감소를 확인할 수 있었다. 면역억제제의 투여가 기존의 약물치료에 반응하지 않는 삼출성 중이염에서 시도해 볼 수 있는 방법일 수도 있을 것으로 사료되나 향후 이관폐색, 알레르기 등 다양한 조건 하에서 용량, 투여방법, 부작용 등에 관한 추가적인 연구가 뒷받침 되어야 할 것이다.

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