교신저자：주형로, 200-704 강원도 춘천시 교동 153번지  한림대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   5-Fluorouracil(5-FU로 약함)은 두경부영역뿐만 아니라 위장관계의 악성종양에 대한 항암화학요법에 널리 사용되는 약제이다. 5-FU는 세포분화가 빠른 종양에 효과가 좋으나, 장점막, 구강점막 및 골수에 독성작용을 나타낸다.¹⁾²⁾ 구강점막에 대한 독성작용으로 나타나는 구강점막염은 생명을 위협하지는 않지만 저작통과 연하장애로 삶의 질을 저하시키며, 심한 경우는 투약중단을 초래하기도 한다. 구강점막염은 구강점막 기저상피세포의 분화작용을 5-FU가 비특이적으로 억제함으로써 발생한다. 기저상피세포의 분화가 억제되면 상피의 위축이 나타나고, 진행되면 궤양을 형성한다.³⁾⁴⁾ 항암제에 의한 구강점막염의 예방 또는 치료가 가능하다면, 항암화학요법에 의한 이환율을 줄일 수 있고, 5-FU의 치료용량을 충분히 투여함으로써 근치효과를 최대로 높일 수 있다.
   5-FU의 독성을 감소시키기 위하여 스테로이드 전신 또는 국소 투여, allopurinol의 전신투여 등 여러가지 방법들이 소개되었으나 이들 약제에 의한 부작용도 심하여 사용에 한계가 있었다.⁵⁾⁶⁾ 최근 allopurinol의 구강도포가 효과가 있다는 보고가 있었으나, 임상에 적용하였던 학자들의 보고에 논란이 있어 allopurinol의 국소도포에 대한 검증이 필요하게 되었다.^7)8)9)10)11) 항암화학요법중에 발생하는 구강점막염과 이에 동반되는 이차감염으로 인한 부작용을 최소화하기 위한 많은 노력과 관심에도 불구하고 객관적인 실험연구와 검증에 어려움이 있었던 원인은 적절한 동물모형의 개발과 약제투여의 방법 그리고 결과해석에 필요한 병리조직학적 기초자료의 부족 등에 기인한다.
   저자들은 실험동물을 이용하여 5-FU로 유발한 구강점막염에 대하여 동일 개체에서 일측 협점막에만 allopurinol 현탁액을 구강도포한 후 양측 협점막의 변화를 비교하여 allopurinol 국소도포의 효과를 객관적으로 검증하고자 하였다. 

대상 및 방법

대  상
   실험동물은 Golden Syrian hamster 수컷 24마리(12~ 15주, 104~111 gm)를 사용하였다. 이중 15마리는 실험군, 9마리는 대조군으로 하였다. 실험군과 대조군의 양측 협점막(buccal mucosa)은 인체에서 정상적인 저작운동에 의하여 일어날 수 있는 구강점막의 손상과 동일한 환경을 제공하고자 주사침(18-gauge)을 이용하여 수술현미경 하에 소창(scratching wound)을 가하였다. 소창은 협점막을 외번(eversion)시킨 상태에서 홍반성 변화가 나타날 정도로 2일 동안 매일 선형으로 3차례씩 자극하였다.
   실험군은 실험 개시일, 5일, 10일째 5-FU(100 mg/kg)를 복강내 주입하였으며, 우측 협점막에만 allopurinol(5 mg/ml) 현탁액을 희생시키기 전날까지 하루에 3회 1분씩 면봉으로 도포하였다. 실험군은 제 3일, 6일, 12일째 5마리씩 희생시켜 양측 협점막을 채취하여 1% paraformaldehyde가 함유된 1% glutaraldehyde(pH 7.4)에 고정하였다. 양측 협점막은 allopurinol을 도포한 우측 협점막과 도포하지 않은 좌측 협점막을 분리하여 구분하였다.
   대조군은 소창만을 가한 상태에서 5-FU를 투여하지 않고, 제 3일, 6일, 12일째 3마리씩 총 9마리를 ether 마취하에 구강점막의 상태를 수술현미경으로 확인하여 기록한 후 희생시켜, 양측 협점막을 채취하였으며 동일한 방법으로 고정시켰다.

결과 관찰
   협점막 조직들은 5-FU에 의한 점막손상의 정도와 allopurinol의 도포효과를 판정하기 위하여 두조각으로 각각 구분고정하여, 광학현미경, 주사전자현미경으로 점막상태를 다음과 같이 정밀 분석하였다.
   실험동물을 희생시킨 후 구강점막상태를 조직채취 전에 수술현미경(Zeiss operating microscope, ×6)으로 관찰하여, 홍반, 궤양 및 반흔조직 등의 존재여부를 확인하였다.
   병리조직학적 변화는 파라핀 포매과정을 거쳐 5 μm 두께로 박절하고, hematoxylin-eosin 염색하여 관찰하였다. 정상 점막소견을 보이는 경우를 음성(-, no change), 점막하층에 경도의 염증세포 침윤이나 각질층의 변화만 있는 경우를 경도(+, mild), 궤양을 동반한 조직 변화를 고도(+++, severe)로 하였으며, 중간 단계를 중등도(++, moderate)로 구분하였다.
   주사전자현미경을 이용한 관찰에서는 고정된 협점막 조직들을 0.12 M cacodylate buffer(pH 7.4)로 세척하였다. 세척된 조직절편들은 2% osmium tetroxide 고정액에 1시간 30분간 후고정하여, alcohol과 aceton에 탈수후에 cri-tical point dryer(Hitachi HCP-2)로 건조시켰다. 건조된 시료들은 Eiko IB-III ion coater로 도금한 후 주사전자현미경(Hitachi S-2500)으로 관찰하였다.

결     과

수술현미경 소견
   일차 5-FU 투여군 중 3일째 희생시킨 5마리에서 정도의 차이는 있었으나 홍반성 병변(erythema)이 관찰되었다. Allopurinol을 국소도포한 우측 협점막과 도포하지 않은 좌측 협점막의 수술현미경 소견의 차이는 없었다. 
   이차 5-FU 투여군은 6일째 희생시킨 5마리중 3마리에서 좌측 협점막에 국소 궤양이 관찰되었으나, allopurinol을 처리한 우측 협점막은 홍반성 병변과 경도의 육아조직만 관찰되었다(Fig. 1A and B). 이차 투여군 중 2마리는 우측에서 홍반성 병변만 관찰 되었고, allopurinol을 처리하지 않은 좌측 협점막에서 심한 홍반이 확인되었다.
   삼차 5-FU 투여군에서는 12일째는 궤양은 관찰되지 않았고, 소창을 가한 부위에 점막의 미란(erosion)이 관찰되었으며, 주변에 반흔이 확인되었으나 allopurinol을 도포한 우측 협점막에서는 미란이 확인되지 않았다.
   대조군의 협점막은 3일째 홍반성 병변이 관찰되었으며, 6일과 12일째는 점막병변이 확인되지 않았다.

광학현미경 소견
   대조군 협점막의 상피는 각질중층편평상피(keratinized stratified squamous epithelium)로 구성되어 있었으며, 핵이 없는 각질층과 그 하부에 과립층(granular layer), 기저층(basal layer)이 관찰되었다. 피하층은 섬유모세포와 교원질을 함유하고 있었다. 12일째 대조군의 협점막은 각질층에 핵이 관찰되는 이상각화증(parakeratosis)이 확인되었다. 상피층의 두께는 일정하였으나, 피하층과 근육층의 두께는 채취 부위별로 다양하였다.
   실험군 협점막의 병변은 동일 개체에서 allopurinol을 도포한 우측과 도포하지 않은 좌측의 조직학적변화는 음성에서 고도까지 다양하였다. 일차 5-FU 투여군 5마리중 3마리에서 allopurinol을 도포하지 않은 좌측 협점막의 병변이 우측에 비하여 현저하였으며, 나머지 2마리는 차이가 없었다. 이차 5-FU 투여군은 궤양을 동반한 점막 손상이 6일째 5마리중 3마리에서 확인되었으며, 삼차 5-FU 투여군의 점막 상태는 양호하였으나 근육세포의 위축이 관찰되었다. 양측 협점막의 변화는 실험군 15마리중 10마리(66.6%)에서 alllopurinol을 도포하지 않은 좌측에서 더 심하였으며, 나머지 5마리도 동일 수준의 손상이 관찰되었으나, allopurinol을 도포한 우측의 병변이 좌측에 비하여 심한 례는 없었다(Table 1). 
   실험군의 관찰기간별로 특징적인 병리조직학적 변화는 3일째 5-FU 일차투여한 좌측 협점막의 상피층이 두꺼워지면서 과립층과 각질층의 구분이 불분명하며, 기저층이 중층으로 변화되었다. 피하층과 근육층은 염증세포의 침윤이 있었고, 림프구의 침윤이 주였으며, 다형핵백혈구와 형질세포도 일부 확인되었다(Fig. 2A). 우측 협점막은 대조군과 특이한 병리조직학적 차이가 관찰되지 않았다(Fig. 2B). 6일째 5-FU를 이차투여한 군 중 allopurinol을 도포하지 않은 좌측 협점막은 표피층이 파괴되면서 피하층과의 구분이 불분명하고, 다형핵백혈구 침윤이 주가 되는 궤양성병변이 확인되었다(Fig. 3A). 우측 협점막은 allopurinol의 도포로 인하여 염증세포들이 근육층 하부의 결체조직에 침윤된 소견만 관찰되었다(Fig. 3B).
   5-FU를 삼차투여한 12일째군은 양측 협점막의 표피층은 병리조직학적 변화가 관찰되지 않았으나, 근육층에 경도의 염증세포 침윤과 근섬유의 위축이 확인되었다. 위축된 근육세포들은 세포연(margin)이 뚜렷하지 않으며, 핵이 일부 소실되었고, 염증세포 침윤은 좌측 협점막에서 현저하였다(Fig. 4A and B).

주사전자현미경 소견
   주사전자현미경은 대조군 2마리, 실험군은 모든 실험군의 고정된 협점막과 설점막을 주사전자현미경으로 관찰하고 3일, 6일, 12일째 군에서 비교치를 얻을 수 있는 2마리씩을 각각 선택하여 좌우측을 구분 중복관찰하였다. 
   대조군의 협점막은 다각형의 세포들로 경계되어 분리되어 있었다. 각 세포 표면은 수많은 오목구조(pit)와 미세능(microridge)으로 이루어져 벌집모양(honeycomb appearance)을 보였다(Fig. 5A and B). 세포간의 접촉부위는 세포간교(intercellular bridge)를 형성하고 있었다. 대조군에서 표면은 관찰기간별로 6일과 12일째 미세능이 연장되면서 뚜렷한 오목구조의 형성이 3일째에 비하여 불분명하였다.
   실험군 협점막의 주사전자현미경적 소견은 6일째 세포표면의 파괴가 현저하였고, 12일째는 대조군과 유사한 소견을 보였다. 3일째의 경우 allopurinol을 도포하지 않은 좌측 협점막은 미세능이 연장되면서 오목구조를 형성이 불분명한 반면, 우측 협점막은 오목구조와 미세능이 균일하게 배열되어 있으면서, 세포간교도 뚜렷하게 관찰되었다. 6일째는 allopurinol을 도포하지 않은 좌측 협점막에서 점막표면의 대부분이 탈락되면서 세포간의 구분이 되지 않고, 조약돌 모양(cobble stone appearance)의 둥근 융모상돌기로 덮여있었다(Fig. 6A). 우측 협점막은 오목구조 모양의 불규칙한 변화만이 관찰되었다(Fig. 6B). 12일째에는 양측 협점막 공히 표면의 미세구조와 세포간교가 정상적으로 유지되고 있었다.

고     찰

   5-FU 투여에 의한 구강점막염에 대한 연구들은 많이 있었으나, 적절한 동물모형을 만들기 어려워 항암제의 병용투여에 의한 이환율을 감소시키는데 많은 어려움이 있었다. Shklar¹²⁾는 hamster에 methotrexate(MTX, 0.1 mg/kg)를 1주에 3회 4주간 피하주사하여 점막에 홍반성 병변을 유발하였다. 병리조직학적 변화로는 교질변성과 상피위축이 발생하였으나 임상적인 점막염에서 보이는 궤양은 나타나지 않았다. Duperon¹³⁾은 흰쥐에 MTX를 0.75 mg/kg/IP 14일간 또는 1.5 mg/kg/IP 7일간 주사하여 점막염 유발에는 실패하였으나 점막세포에서 세포분열지수의 감소를 보고하였다. Sonis 등¹⁴⁾은 hamster에 5-FU(60 mg/kg/IP)를 주사하여 임상적인 궤양과 동일한 병변의 유발에 성공하였다. 협점막이 넓은 hamster는 관찰과 시료의 채취가 용이하고 점막염을 유발하는 5-FU의 용량에서도 치사율이 높지 않았으며, 이때 나타난 구강점막염은 육안적인 소견 뿐만 아니라 병리조직학적으로도 항암제를 투여한 환자의 부검조직에서 보이는 점막염과 유사한 병변이 관찰되었다고 하였다.³⁾⁴⁾
   저자의 실험에서는 점막염 유발을 위하여 hamster에 5-FU를 60 mg/kg을 3회, 5일 간격으로 주사하였으나 궤양을 동반한 점막염이 나타나지 않아 80 mg/kg, 100 mg/kg으로 증량하여 관찰한 결과 100 mg/kg에서 수술현미경하에 궤양을 확인하였다. 실험동물 hamster에 5-FU 100 mg/kg을 주사하였을때 치사율은 12일간 25.0%로 관찰되었다.
   5-FU는 위장관계 및 두경부 악성종양의 항암화학요법중 가장 널리 이용되는 병용항암제로 알려져있다. 5-FU는 투여시에 독성작용으로 인하여 치료가 중단되기도 하며, 이때 나타나는 주된 합병증은 구강점막염과 골수억제이다.¹⁾²⁾ Clark와 Slevin⁷⁾은 5-FU 일차투여후 점막염이 발생한 여섯명의 환자에게 이차투여부터 allopurinol 구강세척을 사용하여 점막염의 빈도와 증상의 경감을 보고하였다. 국소 allopurinol 구강세척의 이론적 근거는 전신적 allopurinol이 orotidylate decarboxylase의 작용을 억제하여 5-FU의 대사물인 fluordeoxyuridine monophosphate와 fluorouridine triphosphate의 발생을 감소시킴으로써 5-FU에 의한 독성작용을 약화시키는데 있다고 하였다.⁵⁾⁶⁾ Tsavaris 등⁸⁾은 allopurinol 구강세척제(16 mg/ml)를 5-FU를 투여하는 16명의 위장관계 암환자에 사용하여 점막염의 완화와 통증 경감에 유의한 효과를 보고하였다. Elzawaway¹⁰⁾는 18명의 5-FU 투여환자에서 allopurinol 구강세척(5 mg/ml)을 5-FU 투여 개시일부터 최소 7일간 하루 4회에서 6회 1분 동안 세척하도록 하여 15명(83.3%)에서 구강세척을 하지 않았던 이전 치료주기에 비하여 구강점막염의 정도가 감소하였다고 보고하였다. Porta 등¹¹⁾의 임상연구에서도 44명의 환자에서 allopurinol을 사용한 경우에 위약군(placebo)에 비하여 통계학적으로 유의하게 효과가 있었다. 그러나 Loprinzi 등⁹⁾은 77명의 환자를 위약군과 allopurinol군으로 구분하여 시행한 임상실험에서 효과에 유의한 차이가 없다고 하였다. 국소 allopurinol 구강세척에 대한 연구는 임상에서 이루어져 왔으며, 그 농도와 방법에서 서로 상이하여 객관적인 효과의 증명이 어려울 뿐 아니라 효용성에서도 논란이 있어왔다.
   저자들의 실험에서는 hamster를 실험동물 모형으로 하여 5-FU로 구강점막염을 유발하면서 allopurinol 구강도포의 효과를 확인할 수 있었다. 점막흡수를 통한 allopurinol 전신적 투여효과를 최소화하기 위하여 이전 연구에서 사용한 용량중 가장 낮은 농도인 5 mg/ml로 증류수에 녹여 사용하였으며, 일측 점막에만 하루 3회, 일분 동안 도포하였다. 한 개체에서 양측 협점막의 환경을 달리하여 비교한 것은 5-FU에 의한 독성작용의 발현정도가 개체간에 다를 수 있으므로 동일 개체 내에서 차이를 비교검토하는 것이 실험결과의 오차를 줄일 수 있을 것으로 판단되었다. 국소 allopurinol 도포는 allopurinol 현탁액을 면봉에 충분히 적신 다음, 우측 협점막에 일분간 작용시킨 후 남은 약제에 의한 타측 협점막의 영향을 줄이기 위하여 마른 면봉으로 남은 액은 최대한 제거하였다. 
   광학현미경적변화는 표피의 각질층이 두꺼워지면서 각질세포에 핵이 나타나는 이상각화증과 기저세포의 증식이 특징적이었으며 진행된 병변으로 궤양을 형성하였다. 각질층의 변화는 만성자극이 있을때 나타나는 세포방어작용의 결과이며 궤양은 임상적으로 인체에서 일어나는 구강궤양과 유사한 소견이었다. 진피층과 근육층에는 염증세포의 침윤이 주된 변화이었으며 12일째 조직에서는 염증세포의 침윤이 3일과 6일째에 비하여 미약하게 나타났다. 
   Sonis 등¹⁴⁾은 hamster 실험에서 5-FU 투여후 골수억제가 진행되면서 10일째 백혈구수가 최저에 이른다고 보고하고 있으며, 이 결과는 점막손상의 정도와는 관계없이 백혈구수 감소에 따른 염증세포 침윤 저하로 해석하고 있다.
   저자들의 실험에서 나타난 12일째 염증침윤의 약화소견은 5-FU 투여에 따른 골수억제와 관계가 있을 것으로 생각되었다.
   주사전자현미경에서 협점막의 벌집모양구조는 인체의 각질 구강점막의 구조와 동일하다.¹⁵⁾¹⁶⁾ 점막구조에 대한 연구에서 각질 표면의 오목구조와는 달리 하부에는 수많은 돌기들로 이루어져 있어 하부의 돌기와 표면의 오목구조가 서로 연결됨으로써 기계적 자극에 대한 방어벽으로 작용한다고 설명하고 있다.¹⁷⁾ 세포 표면의 변화에 대한 다른 연구에서도 유사한 소견을 보고하고 있다.¹⁸⁾ Hassanin 등¹⁹⁾은 DMBA(dimethyl-1-2-benzanthracene)로 hamster에서 유발한 전암성병변의 표면변화 연구에서 2주째 미세능과 오목구조의 변형, 8주째 돌기구조로의 변형을 관찰 보고하였다. 인체에서는 유사한 표면변화가 구강 편평태선과 구강 백반증에서도 보고되었다.²⁰⁾
   저자들의 실험에서 6일째 궤양부위의 돌기들은 각질층의 완전 탈락에 의한 하부 각질층의 노출로 인한 변화로 생각되었으며, 궤양 이외의 표면변화로는 미세능의 불규칙한 배열과 오목구조의 확장이었다. 
   실험결과에서 구강점막염은 실험 초기에는 5-FU의 독성작용과 인위적 자극에 의한 조직세포의 손상으로 나타나지만, 시간이 경과하면서 점막상피의 방어기전의 변화와 세균의 감염으로 더욱 심화되는 것으로 생각되었다. 그러나 allopurinol을 국소도포한 우측 협점막에서는 allopurinol의 작용으로 점막표면과 기저세포의 변화, 염증반응의 정도가 현저히 감소한 것으로 생각되었다.

결     론

   항암화학요법의 병용투여시 흔히 사용되는 5-FU에 의하여 유발되는 구강점막염의 예방과 치료에 도움을 얻고자, hamster 복강내에 5-FU를 투여함으로써 실험적으로 구강점막염을 유발하고 allopurinol을 국소도포하였으며, 구강점막염에 대한 5-FU의 영향과 allopurinol을 도포하였을때 나타나는 변화를 광학현미경과 전자현미경으로 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 5-FU(100 mg/kg)를 투여한 실험군은 개체간의 차이는 있었으나 일례를 제외한 전례에서 구강점막염이 유발되었고 이차투여한 6일째 염증세포의 침윤과 궤양이 가장 심하였으며, 삼차투여한 12일째는 염증반응이 호전되었으나, 인위적으로 점막손상만 유발하였던 대조군은 6일째 염증반응이 회복되었다. 실험군 중 구강점막에 allopurinol을 국소도포하였던 우측점막은 도포하지 않았던 좌측 점막에 비하여 염증소견이 미약하였다(66.6%). 주사전자현미경에서는 광학현미경상 좌측 협점막의 궤양을 형성한 부위에서 조약돌모양의 돌기가 관찰되었고, 오목구조와 미세능의 불규칙한 변화가 확인되었다.
   이상의 연구결과 5-FU의 투여로 유발된 구강점막염은 allopurinol의 국소도포가 염증반응을 감소시킬 수 있는 것으로 확인되어, 향후 allopurinol 국소치료는 항암화학요법으로 인한 이환율을 최소화하면서 근치효과를 높이는데 기여할 수 있을 것으로 생각되었다.

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