교신저자：김병국, 130-709 서울 동대문구 전농 2동 620-56번지  가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   흔히 볼 수 있는 감각장애의 하나인 후각기능의 장애는 최근 여러 원인에 의해 증가하고 있으며, 각각의 원인에 따라 여러 가지 치료법이 시도되고 있다. 원인으로는 폐쇄성 비강 및 부비동 질환, 상기도 감염, 두부외상, 노화, 선천성 기형, 내분비 질환 등이 있다.¹⁾²⁾ 원인에 따른 치료법으로는 부비동 질환이나 비폐색이 원인인 경우에는 부비동 내시경 수술이나 비중격 교정술 등의 수술적 치료법으로 후각이 회복되는 경우도 있고, 경구 및 국소용 스테로이드를 치료의 목적으로 사용하기도 하나, 효과 및 작용 기전에 대해서는 명확히 알려져 있지 않다. 또한 다른 약물 치료법도 사용되기는 하나 치료 성공률이 높다고 알려져 있지는 않다. 특히 상기도 감염 후 생기는 후각장애는 바이러스에 의한 후각상피의 손상에 의한다고 추정되며 조직검사 소견 상 다수의 후각상피에서 섬모가 소실되어 있으며 정상 섬모를 가진 후각상피 수의 감소를 보이게 된다.³⁾ 즉 외상성이나 상기도 감염성 후각장애에 의한 손상은 후각신경 상피세포 또는 신경전달과정에 직접 손상을 주기 때문에 특별한 치료가 불가능하다고 알려져 있다.
   본 교실에서는 교감신경절의 일종인 성상신경절을 차단하는 방법(stellate ganglion block)을 후각장애 환자의 치료에 적용한 결과 56% 이상의 후각 개선이 있었으며 특히 상기도 감염 후의 경우 71% 이상의 높은 후각 개선이 있음을 관찰하였다.⁴⁾
   이에 본 실험은 후각장애에서 성상신경절 차단의 효과를 동물실험을 통해 객관적으로 연구하고자 하였다. 즉, zinc sulfate의 기계적인 자극에 의한 후각장애 동물모델을 만든 후, 교감신경절을 차단하여 후각과 직접 연관이 있는 후각수용체 세포의 수를 관찰하였다. 후각수용체 세포는 후각표지단백질(olfactory marker protein：OMP)을 이용하여 면역조직화학법으로 염색하여 관찰하였다.

재료 및 방법

실험 동물
   BCF1계의 20~25 g 사이의 건강한 수컷 마우스를 냄새를 통한 음식물 찾기 검사로 후각 기능의 장애가 없는 것을 확인한 다음 실험에 사용하였다. 음식물 찾기 검사는 동물들의 후각 상태를 검사하기 위한 방법으로 깨끗한 동물 사육조 안에 먹이를 깨끗한 대팻밥 안에 묻어 두어 동물들이 냄새로 이를 찾을 수 있는 가를 보고 후각상태를 결정하였고,⁵⁾ 5분 이내 음식을 찾을 수 있는 56마리의 마우스를 실험 대상으로 하였다.

실험군

정상 대조군(normal 군)
   6마리의 마우스를 비강 내에 1 ml 주사기로 생리 식염수 0.1 ml를 주입하였다.

Zinc sulfate 주입군(zinc sulfate 군)
   Zinc sulfate(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 비강에 주입하여 후각신경세포를 파괴시켰다(n=25).

상경신경절 절단군(SCG 군)
   Zinc sulfate를 비강에 주입하여 후각신경세포를 파괴시킨 후 양측 상경부 신경절을 절단하였다(n=25).

무취증 유발 및 성상신경절 차단법
   무취증 유발은 0.9% NaCl 용액에 용해한 zinc sulfate(64 mM)를 1 ml의 주사기에 polyethylene catheter tube를 연결하여 0.1 ml를 양측 비강에 주입하였다. 흡인에 의한 질식과 중독을 방지하기 위해 이를 여러 번에 나누어 주입하면서 마우스의 호흡 상태를 확인하며 필요에 따라 비강과 구강의 흡인기로 흡입하면서 실시하였다. 다음날 음식물 찾기 검사로 무취증을 확인하였다.
   상경신경절 차단은 마우스의 양측 상경부 교감신경절(superior cervical ganglion) 절단으로 시행하였다. 마취는 N₂O-O₂-enflurane 흡입 마취하에 앙와위로 고정된 마우스의 목 정중앙 부위를 알코올로 소독한 뒤, 정중선을 따라 절개한 다음 기관과 경동맥을 노출시켰다. 경동맥과 나란히 위치하는 미주신경을 확인하고 미주신경을 따라 배측에 나란히 위치하는 교감 신경줄기를 찾은 후, 머리쪽으로 따라 올라가 상경부 신경절 부위에서 절단하였다. 그후 마우스의 양측 안검하수(Horner's syndrome)로 교감신경절단을 확인하였다.

면역조직화학적 염색(비강 상피조직 염색)
   면역조직화학적 염색을 위한 1차 항체는 Margolis 교수(Department of Anatomy & Neurobiology, University of Maryland School of Medicine, Baltimore, MD, USA)로부터 제공받은 OMP에 대한 goat antiserum을 사용했다. 2차 항체로는 biotinylated anti-goat IgG(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA)를 사용하였다.
   Zinc sulfate군과 SCG군에서 1, 2, 3, 4 및 7주째 ketamine hydrochloride(30 mg/kg)와 xylazine(6 mg/kg)를 근육주사하여 전신 마취시킨 후 0.1 M 인산완충식염수액(pH 7.4)으로 완충시킨 4% paraformaldehyde로 심장 관류를 통해 고정하였다.
   두부를 적출한 후 4% paraformaldehyde에 1일간 후고정한 다음 Calci-clear rapid(Pational Diagnotics, Atlanta, GA, USA)에 1일간 탈회하여 Metharcan solution에 처리시킨 후 파라핀 포매하였다. 포매된 비강의 비중격에 직각이 되게, 관상면으로 4 μm 두께의 절편을 만들어 슬라이드(Probe On slide, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA)에 부착시켰다.
   후각상피의 일반조직학적 관찰을 위해 정상대조군과 1 주 후의 zinc sulfate군 및 SCG군에서 H-E 염색을 시행하였다.
   면역조직화학적염색은 다음 과정을 따랐다. 슬라이드에 부착한 조직을 건조시킨 후 xylene으로 파라핀을 제거하고, 90%, 80% 및 70% 알코올로 순서대로 함수시킨 후, dextrose water로 세척하였다. 상온에서 0.3% 과산화수소에 20분간 처리한 후 세척하고, 희석된 정상 염소 혈청과 30분간 반응시킨 다음, 1：1000으로 희석한 1차 항체(OMP에 대한 goat antiserum)를 실온에서 1시간 반응시켰다. PBST(phosphate balanced saline Triton-X100)로 5분간 세척한 후 2차 항체(biotinylated anti-goat IgG)와 30분간 반응시키고, 다시 세척한 후 Vectastatin Elite ABC reagent(Vector Laboratories)로 30분간 처리한 다음 세척하였다. AEC(3-amino-9-ethyl carbazole)로 10분간 발색시킨 후 hematoxylin으로 대조염색을 한 후 crystal mount를 하였다.

OMP 양성 세포 관찰
   염색된 슬라이드를 광학 현미경하에서 각 조직 절편마다 비중격 상부를 덮고 있는 후각상피를 400배 시야에서 관찰하였다. 15×15 μm² 크기의 격자를 후각상피 고유판에 맞추고 격자 안의 면역 반응된 후각신경세포 수를 세었다. 이때 격자 선에 세포가 걸쳐진 경우에는 상측과 좌측 선에 걸린 것은 포함하였고 하측과 우측 선에 걸린 것은 제외하였다. 각 개체의 후각 신경세포 수는 서로 다른 6 시야에서 측정한 수치의 평균으로 하였다.

통계 처리
   모든 자료는 평균±표준 오차로 표시하였고, 통계 검정 상 p<0.05를 유의한 것으로 간주하고 두 군간의 세포수 분석은 SPSS V10.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)의 paired t-test, ANOVA를 사용하였고, 시간 경과에 따른 세포수에 대한 분석은 ANOVA 다중 분석(Tukey test)을 사용하였다.

결     과

일반 조직학적 소견(H-E 염색)
   H-E 염색 관찰에서 정상대조군의 후각상피는 거짓중층원주형으로서 후각세포(olfactory cell), 지지세포(supporting cell, sustentacular cell) 및 기저세포(basal cell)의 세 가지 세포들의 핵이 여러층을 이루고 있었으며, 상피의 맨 바깥 층은 원주형 지지세포의 핵상부 세포질이 비교적 넓게 차지하고 있었다. 그러나 zinc sulfate 주입 1주일 후에는 zinc sulfate군과 SCG군 모두에서 후각상피의 두께가 현저히 감소하였다. 즉 후각상피내 핵의 수가 현저히 감소되어 있었으며, 맨 바깥 세포질층은 거의 보이지 않았다(Fig. 1). 

OMP 면역조직화학적 소견
   정상대조군의 후각상피에서 OMP에 대한 면역반응성은 상피의 가운데 넓게 퍼져 있는 후각세포의 핵 주위 세포질 및 가는 세포질 돌기에서 주로 관찰할 수 있었으며, 맨 바깥층의 지지세포나 기저층의 기저세포에서는 관찰할 수 없었다.
   Zinc sulfate 투여 1주 후 후각상피의 층이 현저히 감소되었으며, 상경신경절 절단 여부에 관계없이 후각상피에서 OMP에 대한 면역반응성을 관찰할 수 없었다. Zinc sulfate 투여 2주 후에서도 OMP-양성세포는 zinc sulfate군이나 SCG군 모두에서 거의 관찰되지 않았다. Zinc sulfate 투여 후 3주부터는 두 군 모두에서 후각상피의 층이 두꺼워져 핵이 여러 층으로 증가하였으며 맨 바깥 세포층이 뚜렷하게 관찰되기 시작하였다. 특히 OMP-양성세포가 3주 후부터 관찰되기 시작하였다. 4주 후에는 후각상피의 층과 OMP-양성세포의 수가 좀더 증가하였으며, 7주 후에는 정상대조군과 거의 비슷하여졌고, 이러한 변화는 SCG군에서 보다 현저하였다(Fig. 2).

OMP-양성세포의 수(Fig. 3)
   Zinc sulfate 투여 후 1주와 2주에서는 zinc sulfate군과 SCG군 모두 OMP-양성세포를 거의 관찰할 수 없었다. 즉 단위 면적(225 μm²/격자)당 zinc sulfate군의 1주, 2주는 각각 0.40±0.27, 0.88±0.14개였으며, SCG군의 1주, 2주는 각각 0.20±0.06, 0.68±0.15개였다. 그러나 zinc sulfate 투여 후 3 주에서부터는 OMP-양성세포가 나타나기 시작하였으며, OMP-양성세포의 수가 zinc sulfate군(9.19±0.08개)보다 SCG군(12.13±0.59개)에서 유의하게 많았다(t=4.91, df=8, p<0.01). Zinc sulfate 투여 후 4주부터 7주까지 OMP-양성세포의 수는 3주의 수에 비하여 점차 증가하였으며 특히 SCG군의 값이 zinc sulfate군의 값보다 유의하게 많았다. 즉 SCG군의 4주 값과 7주의 값은 각각 14.27±1.84, 19.33±0.89개로 zinc sulfate군의 4주와 7주의 9.76±0.50, 15.09±1.33개보다 유의하게 많았다(4주의 값：t=2.36, df=8, p<0.05；7주의 값：t=2.65, df=8, p<0.05). 한편 7주 후의 SCG군의 OMP-양성세포의 수는 정상 대조군의 세포수(20.80±1.87개)와 거의 비슷하였으나 zinc sulfate 군의 세포수는 정상 대조군의 것보다 유의하게 적었다(t=2.48, df=8, p<0.05).
SCG군의 시간 경과에 따른 OMP-양성세포의 수는 유의하게 증가하였으며(p<0.05), zinc sulfate군에서도 시간 경과에 따라 유의하게 증가하였다(p<0.05). 그러나 SCG군의 증가 경향은 zinc sulfate군의 것보다 유의하게 컸다(F=76.80, p<0.05).

고     찰

   인간의 후각장애는 바이러스 감염, 종양, 독성 물질에의 노출, 호흡 기류의 기계적 폐쇄, 두부외상 그리고 노화, 선천성 기형, 내분비 질환 등 많은 원인에 의하고, 그 기전은 첫째, 후각세포로 전달되는 후각 물질의 접근이 불가능한 경우(전도성), 둘째, 후각세포의 감각신경 손상(감각성), 셋째, 후각신경 혹은 중추성 후각전달과정의 손상(중추성)으로 분류할 수 있다.⁶⁾
   특히 상기도 감염 후 생기는 후각장애는 발병기전이 정확히 알려져 있지는 않으나 바이러스에 의한 후각상피의 손상에 의한다고 추정되며 조직검사 소견상 다수의 후각상피에서 섬모가 소실되어 있으며 정상 섬모를 가진 후각상피세포의 감소를 보이게 된다. 즉, 외상성이나 상기도 감염성에 의한 후각장애는 신경상피세포 또는 신경전달과정에 직접 손상을 주기 때문에 특별한 치료가 불가능하다고 알려져 있다.⁷⁾ 후각 장애 치료는 그 작용기전이나 효과가 잘 알려져 있지 않지만, 경구 및 국소 스테로이드 치료도 시행되어지고 있고, 다른 보조적인 치료로 경구 비타민 A, aminophylline, theophylline 및 zinc sulfate 등의 약물요법이 있다. 그러나 어떠한 치료방법도 후각장애 환자에서 높은 치유율을 보이는 것은 없다고 알려져 있다.⁸⁾
   본 실험은 인간의 감각신경성 후각장애에서 효과를 보인 교감신경차단술를 동물실험에 적용하여 확인하고자 하였고, 이 방법이 효과가 있음을 조직학적으로 확인하고자 하였다.
   OMP는 처음 마우스와 쥐의 후구에서 분리된 것으로⁹⁾¹⁰⁾ 후각 경로에서만 발견되는 수용성 산성 단백질로¹¹⁾ 성숙 후각 수용체 신경세포의 뛰어난 표지자로 알려져 있다. 본 실험도 이를 이용하여 형태학적으로 후각 기능을 평가할 수 있었다.
   Zinc sulfate는 0.05~5%의 비강 세척으로 무취증을 만들 수 있고, 이는 선택적으로 감각상피만을 파괴하고 그 외의 상피는 보존한다고 알려져 있다.¹²⁾ 따라서 실험적으로 가역적인 무취증 모델을 만드는데 널리 사용되고 있으며, 후구절제술(bulbectomy)은 행동장애와 스트레스를 야기하고 조작의 어려움으로 더 이상 무취증 모델을 만드는데 사용하지 않는다. 본 실험은 1% zinc sulfate 용액을 쥐에 비강 주입하여, 후각상피에 직접 손상을 주어 상기도 감염 또는 외상에 의한 후각 장애와 유사한 동물 모델을 만들었다.
   본 실험에서 1주째 후각상피의 두께가 현저히 줄어들었으며, OMP 양성세포가 거의 관찰되지 않은 것으로 보아 zinc sulfate 투여로 후각세포가 파괴되었음을 보였으며, 후각세포는 1주와 2주째 상피의 층이 낮아져 OMP-양성인 후각세포와 지지세포도 함께 감소됨을 보였다. Zinc sulfate 투여 후 3주부터 후각상피의 두께가 현저히 증가하기 시작하였으며, 특히 후각세포의 핵이 위치하는 것으로 알려진 가운데층에 핵의 수가 증가하는 것으로 보아 후각세포가 1, 2주에 비하여 현저히 증가되어 있음을 알 수 있었다. 또한 3주쨰 지지세포의 원주형 세포질 층이 뚜렷이 관찰되는 것은 이때부터 후각세포 뿐 아니라 지지세포도 재생되는 것으로 생각된다. 흰쥐에서 olfactory bulbectomy후에는 OMP의 재발현이 49일 후부터 볼 수 있었다는 보고가 있었으나¹³⁾ 본 실험에서는 3주에 급격한 OMP 양성세포의 재발현을 볼 수 있었는데, 이는 본 실험이 bulbectomy를 한 것이 아니라 zinc sulfate로 후각상피세포에 가역적인 손상을 준 것이므로 OMP 재발현 시기에 차이가 있는 것으로 생각된다. OMP가 후각세포 중 성숙세포에만 표지된다고 하였는데,¹¹⁾ 본 실험에서 zinc sulfate 투여후 3주에 후각상피 가운데층의 핵 중 일부만 OMP에 양성반응을 띠는 것으로 보아 대부분의 후각세포는 분화중에 있고, 성숙한 후각세포는 일부임을 알 수 있었다. 또한 4, 7주에서 세포의 층과 OMP-양성세포의 수가 증가하는 것으로 보아 후각세포의 분열과 분화가 계속 증가하는 것으로 생각한다.
   Zinc sulfate 투여 후 상경신경절을 절단한 SCG군에서는 2주부터 후각상피의 두께가 증가하였고, 후각세포의 핵이 위치하는 것으로 알려진 가운데층에 핵의 수가 증가하였으며, 표면의 지지세포의 원주형 세포질 층이 뚜렷이 관찰되는 것으로 보아 SCG군은 zinc sulfate군에 비하여 1주일 빠른 2주부터 지지세포가 재생되어 가는 것으로 생각되나 OMP-양성세포는 관찰되지 않은 것으로 보아 대부분의 후각세포는 분화과정의 어린세포일 가능성이 있다. 3주째에서부터 OMP-양성세포가 두 군 모두에서 나타나기 시작하나 zinc sulfate군보다 SCG군에서 유의하게 많았으며, 또한 4, 7주에서 OMP-양성세포의 수는 3주에 비하여 점차 증가하되 zinc sulfate군보다는 SCG군에서 유의하게 많았다. 이 결과는 교감신경절 차단인 상경신경절절단이 후각세포의 증식과 분화에 효과가 있음을 의미하는 결과로 여겨진다.
   근래에 성상신경절(교감신경절 일종) 차단이 안면신경, 청신경 또는 시신경으로 가는 미세혈류를 증가시켜 안면신경마비, 돌발성 감각신경성난청, 시신경염 등에 효과를 보인다는 보고들이 있다. 후각상피에서도 같은 기전에 의하여 성상신경절 차단이 효과가 있는 것으로 여겨지며 그 자세한 기전에 대해 추후 많은 연구가 이루어져야 할 것으로 생각한다.^14)15)16)
   이상의 결과를 종합하여 볼 때 상경신경절 절단이 기계적 자극에 의한 후각세포 손상의 회복에 유의한 효과가 있음을 동물 모델을 통해 조직학적으로 확인하므로써, 임상적으로 경험한 후각장애 환자에서 성상신경절 차단 효과를 설명하는 하나의 기전으로 제시하고자 한다.

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