교신저자：정종우, 138-736 서울특별시 송파구 풍납동 388-1  울산대학교 의과대학 서울아산병원 이비인후과학교실
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서     론

   코티기관은 내이로 전달된 청각신호를 증폭하고 조절하여 청신경으로 전달하는 역할을 하고 있다. 코티기관의 증폭, 조절기전에 관하여 많은 연구가 이루어져 왔으며, 코티기관 세포 중 감각유모세포인 외유모세포에 관한 연구가 집중적으로 이루어져 왔다.¹⁾ 외유모세포는 능동적인 움직임을 가지고 있어²⁾ 코티기관의 물리적인 움직임을 증폭 또는 조절하여 내유모세포로 전달하고 여기서 구심성 섬유를 통해 대뇌청각피질로 신호가 전달된다. 그러므로 외유모세포는 청각신호전달과정에서 매우 중요한 역할을 담당하고 있다. 소음성난청이나, 이독성 난청때 청각기능이 떨어지며, 이는 외유모세포의 손상이 대표적인 조직학적인 소견이다. 외유모세포의 손상을 최소화하였을 때 청각역치가 보존되어 외유모세포가 가지는 중요성은 매우 크다.
   코티기관내의 유모세포들 사이에 여러 종류의 지지세포들이 존재하고 있어서 이들 유모세포를 지지하고 코티기관의 모양을 유지하는 것으로 알려져 왔다. 그러나 최근의 연구에 의하면 내이 코티기관의 지지세포는 코티기관의 구조를 유지하는 역할과 더불어 내이의 물리적인 성질을 능동적으로 조절할 수 있는 것으로 추정되고 있다. 즉, 지지세포인 Deiters 세포, Hensen 세포, pillar 세포 등에 신경접합이 존재한다고 보고 되었고,³⁾⁴⁾⁵⁾ 이들 세포가 신경전달물질인 ATP나 아세틸콜린에 대한 세포내의 반응이 보고 되어^6)7)8)9)10) 점차 지지세포에 대한 관심이 고조되고 있다.
   이중 코티기관 지지세포 중 비교적 많은 연구가 이루어진 Deiters 세포는 대뇌로부터 원심성 신경섬유 접합이 세포기저부에 분포하며,⁷⁾⁸⁾ 원심성 신경전달물질로 여겨지는 아세틸콜린과 ATP에 대하여 세포내 Ca^2＋ 농도가 증가되며 이는 산화질소/환식구아노신 모노포스페이트(cyclic GMP) 경로를 통하여 억제되는 조절기전을 가지고 있다.⁹⁾ 더욱이 Deiters 세포에 존재하는 아세틸콜린 수용체는 외유모세포에서 발견되는 것과 같은 a-9형의 수용체로 알려져 외유모세포에서와 같은 신호전달기전이 Deiters 세포내에 존재할 가능성을 높여주고 있다.¹⁰⁾¹¹⁾ 특히 외유모세포에 접하여 있고, 세포내 Ca^2＋ 농도의 증가로 인한 phalangeal process의 움직임이 보고 되어 외유모세포에 대한 물리적인 조절기전의 가능성이 제기되고 있다. 그러므로 Deiters 세포에 의한 외유모세포의 조절은 청각신호전달과정에서 중요한 조절기전으로 작용할 것으로 추정할 수 있다.
   이온통로는 세포의 신호전달에 중요한 역할을 하며, 이를 통한 이온의 흐름에 따라 막전압을 변화시키고 세포내 2차 신호전달계를 활성화 시키며 조절한다. 이러한 이온통로는 와우로 들어오는 물리적인 진동에너지를 전기신호로 바꾸어 주는 역할을 하며, 외유모세포에서는 주파수 특이적인 반응을 유발하는 역할을 한다. 그러므로 코티기관내의 Deiters 세포에 존재하는 이온통로를 밝히고 이의 특성을 이해하는 것은 이 세포내의 신호전달기전을 이해하게 됨과 동시에 코티기관의 조절작용을 이해하여 청각신호전달과정을 파악하는데 도움을 준다. Nenov등¹²⁾은 막전압고정법을 이용하여 Deiters 세포에서 K^＋ 선택적인 외향 정류성 전류를 기록하였으며, 이는 Kv1.5 이온통로와 유사한 형이라고 하였고, 전압의존성 Ca^2＋ 전류와 비선택성 전류는 기록하지 못하였다. Deiters 세포도 외유모세포와 마찬가지로 세포의 대부분은 외림프액 내에 존재하지만 phalangeal process의 일부는 내림프액 내에 면해있으며, 내림프액의 K^＋ 농도는 외림프액과는 정반대로 약 150 mEq/l 정도이다. 그러므로 Deiters 세포내에 K^＋ 통로가 존재하여 K^＋ 농도경사에 따른 생리학적인 역할을 담당할 가능성이 매우 높다. 또한 Deiters 세포막에 존재하는 a-9형의 아세틸콜린 수용체는 리간드의존성 Ca^2＋ 통로의 형태를 하고 있으므로¹¹⁾ Ca^2＋의 세포내 유입에 의한 K^＋ 통로의 조절 가능성도 있다. 그러나 아직까지 Deiters 세포의 세포막 이온통로, 특히 K^＋ 통로에 대한 연구 보고는 미미한 실정이다.
   본 연구에서는 기니픽 내이 코티기관에서 분리된 Deiters 세포의 세포막 전류를 측정하여 Deiters 세포에 존재하는 이온통로에 대해 알아보고자 하였다.

재료 및 연구방법

Deiters 세포의 분리
   백색 기니픽(200~250 g)에 sodium pentobarbital(50 mg/kg)을 복강내 주사하여 마취시킨 후 양측 측두골을 얻었다. Deiters 세포의 분리는 1형 collagenase(Sigma, St. Louis, MO, USA) 1 mg을 정상 Tyrode 용액 1 ml에 녹인 후 0.5 mg의 최종농도로 상온에서 20분간 소화시켜 얻어냈다. 분리된 세포를 50 μl의 정상 Tyrode 용액이 포함된 35 mm 배양용기에 넣어 약 20분간 세포가 바닥에 붙도록 기다린 후 분리된 세포 중 세포의 다각형 모양이며 긴 phalangeal process를 가지는 특징적인 모양의 Deiters 세포를 확인한 후 실험하였다(Fig. 1).

막전압고정법
   Deiters 세포가 들어있는 현탁액을 실험 용기에 옮겨 도립현미경(Olympus LH50A, Olympus Optical Ins LTD, Japan)시야에서 실험하였다. 도립현미경 상부에 위치한 용량 0.2 ml 정도의 실험용기에 세포가 함유된 저장용액을 떨어뜨린 후 세포들이 실험용기에 부착하도록 10분동안 기다렸다. 칼슘이온이 함유된 정상 Tyrode 용액을 계속 흘려 관류시켰으며 관류 속도는 2 ml/min로 하였고 용액 온도를 37°C로 유지하였다. 적당한 세포를 고른 후 400배 시야에서 미세조작기에 연결된 전극을 세포에 접근, 접촉시켜 gigaseal이 형성되면 음압을 가하여 세포막을 터뜨리는 방법으로 whole-cell mode의 패치고정을 시행하였다.¹²⁾ 단일 Deiters 세포를 대상으로 patch clamp 증폭기(List EPC-7)를 이용하여 막전류는 막전압 고정 방식으로 기록하였다.
   유리전극은 외경 1.5 mm의 유리모세관(WPI, USA)을 전극제조기로 제작하였다. 유리전극은 충전액을 채웠을 때의 전극 저항이 2~4 MW 되는 것을 사용하였다. 4극 베셀 필터에서 자료수집 빈도의 2~4배로 필터된 자료를 A-D 변환기(Digidata 1200, Axon Instrument, Germany)로 수치화하여 pClamp 8.0.2 소프트웨어로 개인용 컴퓨터에 기록 저장하였다.
   K^＋ 전류는 막전위를 -40 mV로 유지하다 10 mV씩 -110~50 mV까지 5초 동안 탈분극 시키는 계단펄스를 15초 간격으로 주어 유발하였다.

사용된 시약
   세포외 용액(mM)은 정상 Tyrode 용액을 기본으로 사용하였다. 정상 Tyrode 용액의 조성은 mM 단위로 NaCl 143.5, KCl 5.4, CaCl₂ 2.0, MgCl₂ 1.0, HEPES 10, Glucose 11이었고 pH는 NaOH로 적정하여 7.4로 맞추었다. 유리전극내를 채우는 용액의 조성은 mM 단위로 KCl 140, NaCl 5.0, HEPES 10, Mg-ATP 2.0, MgCl₂ 1.0, EGTA 0.1이 포함된 용액(pH는 KOH로 적정하여 7.4로 유지)으로 채워 사용하였다.

연구결과

활성화된 전류의 특징
   Deiters 세포에서 측정된 전압의존성 전류와 전류-전압관계곡선은 Fig. 2와 같다. 전류전압곡선은 세포의 크기에 따른 효과를 보정하기 위하여 발생한 전류의 크기를 세포의 capacitance로 나눈 값을 사용하였다(pA/pF, y축). 세포외 용액을 정상 Tyrode로, 유리전극내 용액을 140 mM의 K^＋을 포함한 용액으로 하였고, -40 mV의 유지전압에서 -110부터 ＋50 mV까지 10 mV 간격으로 계단펄스를 5초 동안 주었을 때 외향전류가 주로 발생하였다. 내향전류의 크기는 아주 작았고, 외향전류의 크기가 큰(>100 pA/pF) 전류가 발생하여 외향 정류성 전류의 모양을 보였다.
   활성화된 외향전류의 Ca^2＋-의존성을 보기 위하여 세포외 용액의 Ca^2＋을 모두 제거한 정상 Tyrode 용액에서 동일한 계단펄스를 주어 전류를 기록하였다. 이 때 기록된 전류의 전류-전압곡선은 Ca^2＋이 2 mM 포함된 정상 Tyrode 용액에서의 전류-전압곡선과 거의 유사하였다(Fig. 3).

항정상태의 활성 및 비활성 특징
   비활성화곡선은 0 mV의 유지전압에서 -100 mV부터 50 mV까지 10 mV의 간격으로 10초간 전자극을 주고 50 mV의 자극을 주었을 때 나타나는 항정상태의 전류를 이용하여 나타내었다. 즉, 미리 여러 가지의 전 자극을 주고 50 mV의 자극을 주었을 때 전 자극에 의하여 얼마나 이온통로가 비활성화 상태로 남아있는가를 측정하여 최대치에 대한 %로서 나타내었다. 비활성화곡선은 하나의 식으로 부합되어 최대 전류값으로 표준화 한 값이 50%일 때의 전압(Vh：half inactivation voltage)은 -29.72 mV, slope factor(K)는 7.36 mV를 나타내었다. 활성화곡선은 0 mV의 유지전압에서 -80 mV의 전자극을 150 msec간 주고, -80 mV부터 50 mV까지 10 mV 간격으로 계단펄스를 주어 나타나는 활성화 된 전류의 항정상태의 전류값을 측정하여 나타내었다. 활성화곡선 역시 최대 활성전류에 대한 %로서 나타내었다. 활성화곡선은 두개의 Boltzmann 식으로 표현되어 최대 전류값으로 표준화 한 값이 50%일 때의 전압은(Vh)은 각각 Vh₁＝10.12 mV, Vh₂＝8.21 mV이었고, slope(K)는 각각 K₁＝4.28 mV, K₂＝9.73 mV이었다(Fig. 4)

세포외 용액의 K^＋ 농도에 따른 전류
   세포외 용액 중 K^＋의 농도를 변화시키고, 나머지 양이온을 모두 NMDG로 채운 후 -120 mV부터 60 mV까지 10 mV 간격으로 계단펄스를 주어 자극한 전류-전압곡선은 K^＋ 농도에 따라 변화하였다(Fig. 5A). 이 곡선의 역전전압을 [K^＋]o에 따라 도시하였을 때 Fig. 5B와 같다. 실측곡선을 이론곡선과 비교하여 보았을 때 실측곡선의 기울기가 이론곡선의 92.4%에 해당하였다.

재활성화
   0 mV의 유지전압에서 -120 mV부터 60 mV까지 2초간 전자극을 주어 자극한 후 0 mV의 자극을 주어 재활성화 되는 전류를 측정하였다(Fig. 6A). -80 mV의 전자극을 주고 25 ms의 시간간격으로 측정한 재활성화전류는 Fig. 6B와 같다. 이는 2초간의 전 자극을 주고 시간이 지남에 따라 이온통로가 재활성화 되어 점점 전류의 크기가 커짐을 의미한다. 항정상태의 전류의 크기와 시간간격을 도시하였을 때 Fig. 6C와 같고, 이 전류의 시정수(Tau)는 19 ms였다.

Na^＋과 Cs^＋에 의한 투과성
   Na^＋의 투과성을 알아보기 위해 세포외 용액의 Na^＋을 148.5 mM으로 하고 유리전극내 용액을 140 mM Na^＋로 하였다. -40 mV의 유지전압에서 -110 mV부터 50 mV까지 10 mV 간격의 계단펄스를 주고 전류를 측정하였다. 50 mV의 자극에서 항정상태의 전류의 크기는 외향성 K^＋ 전류에 비하여 약 10% 정도의 투과성을 나타내었다. Cs^＋의 투과성을 알아보기 위하여 세포외 용액을 148.5 mM의 Cs^＋으로 하였고, 유리전극내 용액의 Na^＋대신 Cs^＋으로 대치하여 동일한 자극을 하였다. 50 mV의 자극에서 항정상태의 전류는 약 20%의 투과성을 나타내었다(Fig. 7)

Ca^2＋ 전류의 측정
   유리전극내 용액을 140 mM Cs^＋으로, 세포외 용액을 143.5 mM Cs^＋, 5.4 mM K^＋, 2 mM Ca^2＋로 하여 -40 mV의 유지전압에서 30 mV까지 10 mV 간격으로 500 ms동안 자극하여 측정한 Ca^2＋ 전류는 나타나지 않았다.

Gadolinium에 의한 영향
   비특이성 양이온 통로의 차단제인 gadolinium을 100 μM 첨가한 세포외 용액에서 -110 mV부터 50 mV까지의 계단펄스를 주었을 때 전류의 모양은 차이를 보이지 않았으며(Fig. 8A), 50 mV의 자극에서 약 20%정도 감소된 전류를 나타내었다(Fig. 8B).

고     찰

   본 연구를 통하여 자극전압을 변화시키면서 측정한 전류가 주로 외향성 전류이므로 Deiters 세포에 존재하는 주요한 전압의존성전류는 외향 정류성 K^＋ 전류임을 알 수 있었다. 외향전류가 발생하며, 세포외용액의 K^＋ 농도를 변화시키면서 측정한 전류-전압곡선의 변화와 역전전압의 실측치가 이론치와 거의 유사하였다(92.4%). 이 전류는 Ca^2＋에 의존적이지 않았으며, 이 전류의 활성화 곡선은 두개의 Boltzmann 식에 의해 부합되어, 2개 이상의 전압의존성 K^＋ 통로가 존재할 가능성을 나타내었다.
   Nenov등¹³⁾은 Deiters 세포에서 측정한 외향전류를 분석하여 하나의 외향 정류성 전류의 존재가능성을 주장하였고 이는 Kv1.5 이온통로일 것이라고 하였다. 그러나 이들도 외향전류의 전압의존성이 두개의 Boltzmann 식으로 표현되었지만 하나의 이온통로에서도 개폐기에 따른 비대칭성에¹⁴⁾ 의할 것이라고 생각하였다. 본 연구에서는 외향전류의 활성화 곡선이 2개의 Boltzmann 식으로 부합되어 각각 서로 다른 Vh와 K값을 보여주고 있어서 하나의 외향전류에 의한 결과로 보기는 어렵다. 그러므로 하나의 이온통로에서 생기는 비대칭성보다는 2개 이상의 전류가 존재할 것으로 추정된다.
   Cs^＋과 Na^＋는 모두 K^＋ 통로를 통하여 어느 정도 통과되는 것으로 알려져 있다. Na^＋은 K^＋ 통로를 통과하지 못할 것으로 생각되었으나,¹⁵⁾ 최근 K^＋ 통로를 통한 상당한 양의 Na^＋ 투과가 보고 되고 있다.¹⁶⁾¹⁷⁾ 느리게 비활성화 되는 Shaker 이온통로도 Na^＋가 투과하며,¹⁸⁾¹⁹⁾ Streptomyces lividans의 K^＋ 통로(KcsA 이온통로)의 외측입구(outer mouth)에 K^＋과 Na^＋이 결합하는 것으로 알려져 이 이온통로도 두 가지를 모두 통과시키는 이온선택성을 갖는 것으로 보고 되었다.²⁰⁾ Deiters 세포에 존재할 것으로 생각되는 Kv1.5 이온통로¹³⁾에서도 세포내외의 농도에 따라 일과성 Na^＋ 전도도가 조절된다고 하여²¹⁾ 이 이온통로를 통한 Na^＋ 투과의 가능성이 매우 높다.
   본 연구에서는 50 mV의 자극에서 K^＋ 전류에 비하여 약 10%정도의 Na^＋ 투과가 관찰되었다. Cs^＋의 경우는 심근 근장그물(sarcoplasmic reticulum)의 K^＋ 통로를 통과하며,²²⁾ 쥐의 시상하핵 신경의 Kv3와 유사한 K^＋ 통로를 K^＋와 거의 동일한 수준으로 통과한다.²³⁾ 또한 사람의 Kv1.5 이온통로를 HEK-293 세포주에 발현시킨 후 이온의 투과성을 보면 Cs^＋이 K^＋에 비하여 약 10%정도의 수준으로 투과하였다.²⁴⁾ 본 연구에서는 50 mV의 계단펄스를 주었을 때 K^＋ 전류에 비하여 약 20%정도의 Cs^＋의 투과율을 보였다. 이러한 결과들로 미루어 보아 본 연구에서 측정된 전류는 Cs^＋과 Na^＋를 일부 통과시키는 외향 정류성 K^＋전류라고 할 수 있다.
   이러한 K^＋ 통로의 존재는 Deiters 세포가 능동적으로 코티기관의 조절에 참여한다는 기존의 가정들^6)7)9)10)을 가능케 한다. 즉, K^＋ 통로의 활성화에 의하여 Deiters 세포가 쉽게 재분극 될 가능성이 높다.
   Deiters세포는 또한 P2x와 P2y형의 퓨린형 수용체를 가지고 있다.²⁵⁾²⁶⁾ 세포 바깥에 ATP를 투여한 후 whole cell patch clamp 방법으로 측정한 세포막 전류는 내향전류를 나타내며 이는 세포외 용액에서 Ca^2＋을 제거함으로 인하여 감소되어 P2x형의 퓨린형 수용체임을 나타낸다.²⁷⁾ 또한 Housley등²⁶⁾은 P2x2 수용체 아단위 전령 RNA(subunit mRNA)를 이용하여 이 수용체를 밝혔으며 이는 청각신호전달에 중요한 조절역할을 할 것으로 주장하였다. 그리고 ATP의 자극에 의하여 세포내 Ca^2＋ 농도의 증가도 보고 되어 P2y 수용체가 존재할 가능성도 있다. Deiters 세포는 ATP에 의하여 탈분극 될 수 있으며,²⁷⁾ ATP 자극에 의하여 세포내 Ca^2＋ 농도의 증가와 세포내 2차 신호전달계의 활성화가 일어난다.⁹⁾ 또한 원심성 신경전달물질인 아세틸콜린에 의해서도 세포내 Ca^2＋ 농도가 증가하여¹⁰⁾ 바로 인접한 외유모세포나 코티기관의 조절기능을 할 것으로 생각되고 있다. 또한 Deiters세포에서는 ATP에 의한 세포내 Ca^2＋의 증가가 산화질소(nitric oxide)에 의하여 억제되며 이는 산화질소/환식구아노신 모노포스페이트(cyclic GMP) 경로를 따라 이루어지는 것으로 밝혀져 이들 세포내에 신경전달물질에 의한 신호전달체계를 조절하는 기전이 있음을 알 수 있다. 산화질소체계의 시작경로에 필요한 산화질소합성효소(NOS)는 코티기관에서는 지지세포층에 존재하는 것으로 알려져²⁸⁾²⁹⁾ 이러한 조절 가능성이 높아지고 있다. 그러므로 K^＋ 통로의 존재는 이러한 신경전달물질에 의한 자극 후 세포를 정상상태로 되돌리는 역할을 할 것으로 생각할 수 있으며, 이를 통하여 Deiters 세포가 코티기관의 조절에 중요한 역할을 담당할 것으로 생각할 수 있다.
   외유모세포는 외부의 자극에 의하여 빠른 운동성(fast motility)과 느린 운동성(slow motility)을 나타내어 음자극의 증폭과 소음자극에서의 보호역할을 할 것으로 생각되고 있다.³⁰⁾ 이러한 움직임은 Deiters 세포에서도 보고 되어 Dulon등²⁵⁾은 ATP에 의하여 Deiters세포내의 Ca^2＋ 농도의 증가를 보고하였고, 또한 세포내 Ca^2＋ 농도의 증가가 Deiters세포의 phalangeal process의 능동적인 움직임을 나타냄을 보고하였다. 그러므로 이러한 Deiters 세포의 성질은 지금까지 많은 연구가 이루어진 외유모세포에서의 성질과 유사한 점이 많으며 본 연구에서 밝혀진 외향 정류성 K^＋ 전류도 세포내 신호전달과정을 통해 조절됨 으로써 세포의 흥분성을 조절하여 그 역할을 할 것으로 생각되며 앞으로 이 이온통로를 통한 코티기관의 조절기전에 대한 연구가 필요하다고 사료된다.

결     론

   기니픽 코티기관 Deiters 세포에 존재하는 K^＋ 통로는 TEA에 의하여 약 3/4정도 억제되며 Cs^＋을 일부 통과시키는 외향 정류성 이온통로의 형태를 나타내며 이는 활성화 곡선의 특성에서 미루어 2개 이상 존재할 가능성이 높다. 이러한 K^＋ 통로는 Deiters 세포를 쉽게 탈분극할 수 있는 상태로 복구시키는 역할을 담당할 것으로 추정된다.

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