교신저자：왕수건, 602-739 부산광역시 서구 아미동1가 부산대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   재발성 호흡기 유두종증(recurrent respiratory papillomatosis, 이하 RRP)은 호흡기에 양성 편평상피 유두종(benign squamous papilloma)의 잦은 재발과 증식을 특징으로 하는 바이러스성 질환으로 특히 소아에 생기는 경우에 다발성이고 자주 재발하여 여러번의 시술을 필요로 할 뿐만 아니라 기도를 막아 생명을 위협하기도 하므로 임상적으로 소아형과 성인형으로 분류하고 있다. 그러나 Doyle 등⁴⁾은 이러한 두 가지 형을 비교하고 성인에서도 다발성이고 재발율이 높은 유두종이 많은 비율을 차지한다는 점을 강조하여 RRP를 침습형과 비침습형으로 분류하였다.
   RRP의 발생에 가장 중요한 원인은 유두종 바이러스(human papilloma virus, 이하 HPV)의 감염으로 생각되며 잠복감염으로 인하여 재발된다고 알려져 있다. 최근에 개발된 분자생물학적 기법은 HPV에 대해 민감도가 매우 높을 뿐 아니라 HPV의 형까지 감별해낼 수 있게 되었다. 원인 바이러스는 Mounts 등⁵⁾에 의해 HPV 6형이 발견되고 Grissman 등⁶⁾에 의해 HPV 11형이 발견되었음이 보고된 이래 최근까지도 HPV 6, 11형이 RRP의 주원인이 된다고 알려져 있다.
   분자생물학적 기법중 southern blot hybridization은 민감도는 높으나 수술후 즉시 냉동 보관된 조직을 사용해야 하는 단점이 있고 in situ hybridization은 파라핀을 입힌 조직을 이용할 수 있으며 민감도가 높고 바이러스가 감염된 위치도 알 수 있으나 많은 HPV의 복제를 요하므로 바이러스를 복제할 수 없는 세포에서는 음성으로 나올 수 있다. 이에 반해 polymerase chain reaction(PCR)은 바이러스가 감염된 위치는 알 수 없으나 염기서열 수백만배 까지 증폭시킬 수 있어 가장 민감도가 높으며 파라핀을 입힌 조직도 사용할 수 있다.
   본 연구에서는 RRP의 임상적 분석을 시행하고, CO₂ 레이저 및 수술 전 인터페론을 사용한 치료 결과를 비교분석하였고, 중합효소반응을 이용하여 유두종 바이러스의 형을 증명하고 임상양상과의 관계를 규명하고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   1983년 8월부터 1999년 7월까지 부산대학교병원 이비인후과에서 재발성 호흡기 유두종증으로 확진된 60명을 대상으로 하였다. 치료결과의 분석은 1년 이상 추적관찰이 되지 않았거나, 다른 병원으로 전원 후 추적관찰이 불가능하였던 15명을 제외한 45명을 대상으로 하였으며, 3회 이상 치료자 중에는 일부 경희의료원 이비인후과에서 치료를 받은 환자도 포함하였다. 환자의 병력지와 후두텔레스코피로 촬영한 성대의 국소소견을 후향적으로 검토하였으며, 이중 보관된 파라핀블록의 이용이 가능했던 23예를 대상으로 중합효소반응을 시행하여 HPV를 검출하였다.

임상분석
   60명의 환자를 대상으로 연령, 성별, 병변의 위치와 형태를 분석하였다.

치료결과의 판정
   1년 이상 추적관찰이 가능했던 45예를 대상으로 기관절개술의 시행 여부, 평균 수술 횟수, 침습정도, 여러 가지 변수에 따른 치료결과 및 술 후 합병증 등을 관찰하였다.
   침습형태는 침습형과 비침습형으로 분류하였는데 침습형이란 총 수술회수 10회 이상 또는 1년 동안 3회 이상의 수술을 받았거나 성문하 혹은 기관침범이 있는 경우이고 이러한 범주에 속하지 않은 경우를 비침습형이라 정의하였다.⁴⁾
   치료결과의 판정은 마지막 치료 후 1년 이상 추적 관찰시 병변의 재발소견이 보이지 않았던 경우를 치유(no evidence of disease, NED)로, 초기치료 이후 재발을 보인 경우를 재발(not improved, NI)로 판정하고 성인형과 소아형, 침습형과 비침습형, 단발성과 다발성 병변에서의 빈도를 조사하였다.
   45명의 환자 중 본 병원에서 CO₂ 레이저를 사용하기 전에 단순절제를 시행하였던 18예를 제외한 27예 중 CO₂ 레이저 단독으로 치료한 경우와 CO₂ 레이저와 인터페론을 병용 치료한 경우의 치료결과를 분석하였다. 수술시 사용한 레이저는 Sharpran^® CO₂ 레이저를 3W 100 m/s intermittent하게 사용하였다.

호흡곤란 환자에서 수술전 알파-인터페론(α-interferon)의 효과판정
   유두종에 의해 심한 호흡곤란을 호소한 5명을 대상으로 수술전 알파-인터페론 150만 단위를 주 4회 1달간 근육주사 후 기관절개술을 시행하지 않고 수술할 수 있었던 경우를 알파-인터페론에 효과가 있었다고 판정하였다.

PCR을 이용한 HPV 검출

Oligonucleotide primer의 준비
   HPV 6,11,16,18,31,33의 증폭을 위하여 이용되는 oligonucleotide primer는 Queen과 Korn⁷⁾의 염기서열을 사용하여 DNA synthesizer를 이용하여 제조하였다. HPV 형에 따른 각각의 증폭되는 base pair는 6형 280, 11형 360, 16형 152, 18형 216, 31형 153, 33형 455이었다(Table 1).

DNA의 분리
   후두유두종환자의 파라핀포매한 조직을 10 μm 두께의 절편으로 잘라 1.5 ml 원심관에 xylene 1 ml와 함께 넣고 잘 흔든 다음 5분간 실온에 둔 후 12000 rpm에서 5분간 원침한 후 상층을 제거하였다. 원침된 침전물에 순수 ethanol 1 ml를 가하여 강하게 섞은 후 다시 원침하여 상층을 제거하고 90% ethanol과 75% ethanol을 이용하여 차례로 이 과정을 반복한 후 침전된 조각만 남기고 ethanol을 제거한 뒤 10분간 진공 건조시켰다.
   건조된 조직을 1.5 ml 원심관에 TEN buffer 300 μl, 10% SDS 25 μl와 proteinase-K(10 mg/ml) 20 μl를 주입하여 37°C에서 14시간 방치한 후 400 μl의 phenol/chloroform/isoamyl alcohol(25：24：1)을 가한 다음 5분간 12,000 rpm에서 원침한 후 상층액을 취하여 ch-loroform/isoamyl alcohol(24：1) 400 μl로 이 과정을 1회 더 반복하였다. 각 검체에 5 M NaCl 10 μl, cold absolute ethanol 1 ml를 주입하여 -20°C에서 2시간 방치 시킨후 12,000 rpm에서 20분간 원침분리를 실시한다. DNA pellet을 취하여 70% ethanol 1 ml를 주입한 후 12,000 rpm에서 5분간 원침, 상층을 제거후 30분간 건조시킨 후 30 μl의 증류수로 녹여 PCR에 이용하였다. 또한 분리된 DNA 상태를 확인하기 위하여 β-globin test를 시행하였으며 전기영동상 267 bp 크기의 single band가 확인된 조직의 DNA만을 각 HPV 형에 대한 중합효소반응을 실시하였다. β-globin test상 불량한 상태의 조직의 DNA는 파라핀블록을 이용하여 DNA를 다시 분리하였다.

중합효소반응(PCR)
   각 PCR 반응액 25 μl에 한쌍의 primer(10 pmole/μl) 2.5 μl deoxynucleotide 혼합액(2.5 mM) 2 μl, 10X buffer 2.5 μl, MgCl2(25 mM) 1.5 μl와 AmpliTag Gold^TM(Perkin-Elmer사) 1 unit를 DNA template 용액 4 μl에 넣어 증폭시켰다.
   PCR반응은 Programmable thermal cycler(Perkin-Elmer 2400, Norwalk, USA)를 사용하여 먼저 95°C에서 10분간 Tag polymerase를 활성화시킨 후 95°C에서 30초간 denaturation, 55°C에서 30분간 anealing, 그리고 72°C에서 1분간 extension시키는 과정으로 모두 40사이클을 반복 시행하고, 마지막 72°C에서 10분간 post-extension을 실시하였다.

PCR 결과의 확인
   PCR이 종료된 검체들에서 각 산물을 10 μl씩 취하여 6X loading buffer(0.25% bromphenol blue, 0.25% xylene cyanol, 30% glycerol in water) 2 μl와 혼합하여 2% 한천겔(agarose gel)에서 100 volt, 20분간 전기영동을 실시하고 ethidium bromide로 염색하여 자외선 투사기로 관찰한 다음 폴라로이드 카메라로 촬영하였다.

통계처리
   통계처리는 Pearson's χ²-test를 이용하였으며 유의수준은 p<0.05 범위로 하였다.

결     과

임상분석

연령과 성별 분포
   연령분포는 4세부터 74세까지였으며 남자 37명, 여자 23명이었다. 발병연령 또한 32개월부터 69세까지 다양하였고 발병 평균연령은 36세이었다. 15세를 기준으로 분류하였을 때 소아형 14예(23.3%), 성인형 46예(76.7%)으로 양 그룹에서 모두 남자의 비율이 높았다(p<0.05)(Table 2).

병변의 부위와 형태
   병변의 부위는 성문부만 침범한 경우가 소아형 14예중 8예(57.1%), 성인형 46예중 28예(60.9%)로 가장 많았으며, 성문부와 성문하부를 침범한 경우는 소아형의 4예(28.6%), 성인형의 6예(13.0%)로 소아형에서 의의 있게 많았다(p<0.05). 양군 모두 다발성의 경우가 많았으나 소아형에서 다발성의 비율(92.9%)이 성인형(56.5%)에 비해 높았다(p<0.05)(Table 3). 단발성은 전부 성문부에 국한되었다.

치료결과
   추적관찰이 불가능했던 15명을 제외한 45명의 추적관찰 기간은 1.2년부터 16.2년까지 평균 3.7년이었다.
   기관절개술을 시행한 경우는 소아형 12예중 6예(50%), 성인형 33예중 5예(15.2%)로 소아형에서 빈도가 의의있게 높았다(p<0.05). 평균 수술횟수는 소아형에서 6.3회, 성인형은 3.5회로 소아형에서 수술횟수가 의미있게 많았다(p<0.05). 침습형은 소아형에서 6예(50%), 성인형은 5예(15.2%)로 소아형에서 의미있게 많았다(p<0.05)(Table 4).
   치료 후 소아형, 성인형 모두에서 66.7%가 1년 이상 추적 관찰시 병변의 재발을 보이지 않았으며 침습형은 36.4%, 비침습형의 경우는 76.5%가 치유로 판정되었다. 또한 병변이 단발성인 경우 7.7%에서 재발을 보였으나 다발성인 경우는 43.7%에서 병변의 재발을 보였다(p<0.05)(Table 5).
   치료방법별 치료효과를 보면 CO₂ 레이저 단독으로 치료한 11예 중 치유는 8예(72.7%), CO₂ 레이저와 알파-인터페론을 병용 치료한 16예 중 치유는 10예(62.5%)로 나타났다(Table 6).
   수술 후 합병증은 격막(web)형성이 소아형 12예중 4예(33.3%), 성인형 33예중 8예(24.2%)에서 발생하였다.
   악성으로 이행한 예는 없었다.

호흡곤란 환자의 수술전 알파-인터페론의 효과
   국소소견상 유두종이 거의 전체 성대를 막고 있는 소견을 보인 5명에서 술전 알파-인터페론 치료를 시행하여 3명(60%)이 기관절개술을 시행하지 않고 기관삽관에 의한 CO₂ 레이저수술이 가능하였다.

중합효소반응

HPV의 검출
   중합효소반응을 이용한 HPV의 검출은 파라핀포매조직의 사용이 가능했던 23예를 대상으로 하였으며 이중 치유는 13예, 재발은 10예이었으며, 침습형은 6예, 비침습형은 17예이었다.
   10예(43.5%)에서 HPV 6, 11에서 양성반응이 나왔으며 HPV 6형이 8예, HPV 11형의 경우 2예에서 양성반응이 나왔으며 HPV 6형과 11형이 동시에 나온 경우는 없었다. 나머지 HPV 16, 18, 31, 33형에서는 모두 음성으로 나왔다(Table 7, Fig. 1).

HPV 아형과 재발과의 관계
   HPV 6형에서 치유가 1예, 재발이 7예이었고, HPV 11형에서는 치유만 2예이었다. HPV 6형에서 침습형 4예, 비침습형 4예이었고, HPV 11형에서는 비침습형만 2예이었다(Table 7).
   HPV 6형은 재발 10예중 7예(70%)에서, 비침습형 6예중 4예(66.7%)에서 양성반응이 나왔다.
   전체적으로는 재발 10예중 7예(70%), 치유 13예중 3예(23.1%)에서 HPV 양성으로 나왔으며, 침습형 6예중 4예(66.7%), 비침습형 17예중 6예(35.3%)에서 HPV 양성반응이 나왔으나, 각군에서 통계학적 의의는 없었다.

고     찰

   재발성 호흡기 유두종증(recurrent respiratory papillomatosis, RRP)은 후두에 발생하는 양성종양으로 가장 흔하여 수술적 제거에도 불구하고 주변부위로 전파가 잘 되고 재발을 잘하는 것이 특징이다. 이는 다른 양성종양과는 달리 유두종바이러스의 감염에 의하기 때문이다.
   호흡기와 소화기의 점막을 모두 침범할 수 있고 주로 성문부와 성문하부에 호발하지만, 기도와 기관지, 폐에도 침범할 수 있다.
   RRP는 연령, 성별, 유전, 호르몬의 영향, 만성적 자극 등 여러 가지 원인이 제시되었으나 DNA 바이러스인 HPV의 감염이 가장 확실한 원인으로 생각되고 있다. HPV는 약 70여종이 있으며, 8000 base pairs를 갖는 이중나선 구조의 DNA 바이러스로, 상기도에 잠복 감염 형태로 존재하다가 어떤 요인에 의해 활성화되어 질환을 일으키는데, 이중 6형과 11형은 RRP 등 양성 종양을 유발하고, 고위험군인 16형, 18형, 31형, 33형, 35형 등은 악성 종양을 유발하는 것으로 알려져 있다.⁸⁾ HPV가 두경부암의 발생과 연관이 있다는 것은 후두암, 설암, 편도암 등 여러 부위에서 연구되어 왔으나 HPV에 의한 상기암들의 예후에 관해서는 별로 알려진 바가 없다.
   RRP는 병리조직학적으로는 차이가 없다. 임상적으로는 소아형과 성인형으로 구분하고 있으나, 15세 이하의 소아형은 재발을 잘하며 주로 다발성 병변으로 나타나며, 성인형은 재발이 소아형보다 흔하지 않으며 단발성 병변으로 나타나는 경우가 많다. 저자들의 경우는 양군에서 모두 다발성으로 발생한 경우가 많았으며 특히 소아형에서는 14예중 13예(92.9%)로 성인형에 비해 월등히 많았다.
   Holinger 등⁹⁾은 RRP가 15세 이전, 특히 5세 이하에서 호발함을 보고하였으나, Kim 등¹⁾은 29%가 소아연령에서 발생하여 소아에만 국한되어 나타나는 것은 아니라고 하였다. 본 연구에서도 소아연령에서는 23.3%의 비교적 적은 빈도로 발생하여 RRP가 모든 연령에서 생길 수 있음을 알 수 있었다. 남녀별 발생빈도는 소아형과 성인형에서 모두 남자의 비율이 높은 것으로 나타났다.
   RRP의 치료는 확실한 기도를 유지하고 음성을 보존하면서 가능한 모든 병변을 제거하는 것이다. 치료방법으로는 항생제, 호르몬제, 국소 부식제, 알킬화 용제(alkylating agent), 알파인터페론 등을 이용한 내과적 약물요법과 전기소작법, 초음파, 레이저, 냉동수술 등의 물리적 요법, 현미경하 미세적출술 또는 개방성 수술 등의 수술적 요법이 있다. 현재는 1976년 Strong 등¹⁰⁾이 유두종 치료에 처음 사용한 CO₂ 레이저를 이용한 기화제거법을 가장 많이 사용하는데, 병변을 정확하게 제거할 수 있고 지혈효과가 비교적 좋은 장점이 있다. 그 외에 방사선 치료, 그리고 약물요법으로 indole-3-carbinol, 시도포비어(cidofovir),¹¹⁾ 5-FU 등이 있다. 방사선 치료는 후두연골파괴와 협착등의 문제가 생길 수 있을 뿐만 아니라 악성화의 가능성이 있어 호흡장애가 심하거나 다른 치료에 효과가 없을 때를 제외하고는 가능한 사용하지 않는다.¹²⁾ 최근에 연구되고 있는 cidofovir는 cystein nucleotide analog로서, 세포내 활동성 cidofovir dihydrate가 DNA polymerase를 억제하여 치료효과를 나타내며, Pransky 등¹¹⁾은 병변내 주입으로 5명의 RRP환자중 4명에서 병변의 호전을 보였다고 하였다. 한편 레티노이드(retinoid)는 비타민 A(Vitamin A) 유사체로서 정상세포와 악성세포의 증식을 억제하고 사람의 각질세포(keratocyte)와 유두종 세포(papilloma cell)을 포함한 상피조직의 분화를 조정하여 RRP의 악성변화를 예방하는데 도움이 된다고 알려져 있다.¹³⁾
   알파인터페론 치료는 1981년 Haglund 등¹⁴⁾에 의해 처음 시도되었는데 7명의 소아형 유두종환자에서 치료 후 모두 효과가 있었으나 치료 중단 후 2명은 재발이 없었고 5명은 다시 재발하였음을 보고하였다. 그 외 다른 보고자들도 비슷한 성적을 보고하고 있으나 치료효과에 대하여 계속 연구중에 있으며, 최근에는 알파인터페론의 병변내 주입요법으로 치료하는 방법도 소개되고 있다. 저자들은 레이저와 인터페론 치료를 병용한 군에서 치료성적이 향상됨을 밝히지는 못하였다. CO₂ 레이저 단독 치료군에서 치료 효과가 더 높게 나타난 것은 치료 방법의 선정시 단독 치료군보다 병용 치료군의 대상자들에서 다발성 병변이 두 배정도 많았기 때문으로 생각된다. 그러나 수술시 기관절개술이 필요할 정도의 심한 기도폐색을 가진 5명의 환자에서 술전에 인터페론을 사용하여 3명에서 기관절개술을 시행하지 않고 수술을 시행함으로서 인터페론의 효과가 인정되나 예수가 적어 단언할 수 없어 추후 더 많은 연구가 필요하다고 사료되었다.
   호흡곤란으로 기관절개술이 필요한 경우, 이때 기관절개술 자체가 기관이나 폐로 유두종이 퍼지는 것을 조장한다는 보고¹³⁾가 있다. 그러나 기관절개술을 시행한 환자의 단지 50%에서만 원위부로 전파가 있었고 병의 전파도 기관절개술을 시행한 부위에만 국한되어 있어 기관절개술이 효과적인 치료라는 보고¹⁵⁾도 있다. 현재 여러 학자들의 공통된 의견은 가능한 기관절개술은 피해야 하고 기관절개술이 필요한 경우 가급적 빨리 케뉼(cannula)을 제거해야 한다는 것이다. 저자의 경우 기관절개술은 소아형의 50%, 성인형의 15.2%에서 필요하였으며, 침습형과 비침습형으로 살펴볼 때 11예의 침습형 중에서 7예(63.7%)에서 기관절개술을 시행한 반면 비침습형에서는 34명중 4명(11.8%)에서만 기관절개술이 필요하였다.
   치료효과에서 저자의 경우 치유는 소아형과 성인형에서 모두 66.7%로 동일한 결과로 나타난 반면 비침습형은 76.5%가 치유로 침습형의 36.4%에 비해 약 2배 정도의 차이를 보였다. 물론 소아형에서 침습형이 많은 것으로 나타났으나 연령을 기준으로 소아형과 성인형으로 분류한 것은 질병의 특성을 확실히 구별하기에 부족한 점이 많으므로 적어도 기관절개술의 필요성 여부나 치료효과의 판정에 있어서는 침습 및 비침습형으로 분류하여 관찰하는 것이 더 합당한 것으로 생각된다.
   HPV의 검출은 조직학적으로나 면역학적인 방법 이외에 southern blotting이나 hybridization 방법이 이용되어 왔고 최근에는 보다 민감한 방법인 중합효소반응(PCR)이 사용되고 있다. In situ hybridization 방법은 민감도과 특이도가 낮은 반면에 세포내에서 바이러스의 형태별 검출이 가능하고 southern blot방법은 민감도와 특이성이 높아서 비록 시간이 소비되는 과정이지만 바이러스의 형태를 규명하는 데는 필요한 과정이다. 최근 개발된 PCR은 감염된 바이러스의 위치를 알 수는 없으나 특정부위의 DNA를 기하급수적으로 증폭시켜 검사하는 방법으로 겸상적혈구빈혈의 진단에 이용된 이래 불과 수년 사이에 각종 유전병의 진단은 물론 유전자 보유의 검색, 암유전자의 연구 및 법의학등에 매우 활발하게 이용되고 있는데, 특정 유전자 의 증폭이 가능하므로 감염성인자의 검색에 매우 예민하게 적용될 수 있다.
   Tsutsumi 등¹⁶⁾은 20예의 후두 유두종 환자를 대상으로 in situ hybridization을 이용하여 HPV 6예(30%)에서만 검출할 수 있었고, Costa 등¹⁷⁾은 면역조직화학방법을 이용하여 50%의 소아형 유두종에서 HPV 항원이 검출되었다고 보고 하였다. Kim 등²⁾은 12예의 후두유두종에서 PCR을 이용하여 HPV 6형과 11형을 9예(75%)에서 검출하였으나 본 연구에서는 23예중 10예(43.5%)에서 6형과 11형에서 양성을 보여 검출율이 낮아 이는 기법에 문제가 있으리라 생각되었다.
   Steinberg 등¹⁸⁾은 바이러스형과 RRP의 임상양상과는 관계가 없다고 보고하였으며, Phoebe 등¹⁹⁾은 HPV 6형을 다시 c형부터 f형 까지의 4가지로 분류하고 그 중 c형이 가장 예후가 나쁘다고 하였다. Jang 등³⁾은 재발된 후두 유두종에서 HPV 6형과 11형이 6예중 4예(66.7%) 에서 관찰되었으나 5예의 비재발성 유두종환자에서는 HPV가 관찰되지 않았다고 하였다. 본 연구에서는 재발 10예중 7예(70%)에서 바이러스가 검출되어 13예중 3예(23.1%)가 양성으로 나온 치유례보다는 높았으며 특히 7예 모두 HPV 6형으로 검출되었다. 침습형은 6예중 4예(66.7%)에서 바이러스가 검출되어 17예중 6예(35.3%)가 양성으로 나온 비침습형보다는 높았다. HPV가 검출된 예에서 재발이 많아 이는 RRP의 치료반응과 임상양상이 HPV 아형에 따라 달라질 수 있다는 것을 암시해 주며, 특히 본 연구에서는 HPV 6형이 치료가 잘 되지 않고 재발을 많이 하는 예에서 검출되었으나 통계학적 의의는 없었다. HPV 아형이 예후인자와 관련이 있다는 증명은 더 많은 증례와 추적관찰이 필요할 것으로 생각된다.

결     론

   재발성 호흡기 유두종증에 있어서 치료효과의 차이는 침습형 및 비침습형으로 나누어 분석하는 것이 임상적으로 적절하다고 생각되며, 수술 전 인터페론 치료는 기관절개술이 필요한 유두종증 환자의 기도확보에 효과가 있을 것으로 사료된다. HPV 아형과 예후인자와의 관계는 더 많은 증례와 추적관찰이 필요할 것으로 생각된다.

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