교신저자：정종우, 138-736 서울 송파구 풍납동 388-1 울산대학교 의과대학 서울중앙병원 이비인후과학교실
              전화：(02) 3010-3710 · 전송：(02) 489-2773 · E-mail：jwchung@amc.seoul.kr

서     론

   내이내로의 혈액공급이 감소할 때 청력역치가 증가하는 현상은 기존의 많은 연구에 의해 밝혀져 있다.^1)2)3)4) 와우는 주로 전하소뇌동맥에서 혈류 공급을 받는데, 이 혈관을 일시적으로 차단하였을 때 청성뇌간유발반응(ABR)의 역치가 상승한다. 와우로의 혈액 공급을 감소시키기 위한 동물 실험 모델들이 보고된 이후⁵⁾ 기니픽(guinea pig)과 래트(rats)를 대상으로 많은 연구가 이루어져 왔다.
   일반적으로 세포는 에너지원으로 glucose를 사용하며 산소(O2)가 정상적으로 있을 경우에는 aerobic glycolysis 과정을 통해서 ATP를 생성하고 이를 에너지원으로 사용한다. 그러나 산소가 공급되지 않는 상태에서는 anaerobic glycolysis 과정을 통하게 되는데, 이때는 대사의 산물로 lactate가 생성되어 조직에 축적되며,⁶⁾⁷⁾ 이는 다른 증상들을 나타내게 된다. 일례로 근육내에 축적된 lactate는 통증이나 피로를 유발한다. 또한 lactate가 축적되면 pH의 저하가 생기며 이는 aerobic glycolysis의 과정중에서 필수적인 glycolytic enzymes의 활성을 저해한다. 그러므로 축적된 lactate는 결국 세포의 기능을 손상시키게 된다.
   내이내에서도 주요한 에너지원으로 glucose를 사용하며,⁸⁾ 이는 혈관을 따라 조직내로 이동하게 된다. 외림프에도 blood-perilymph barrier를 통해 들어온 glucose가 존재하며,⁹⁾¹⁰⁾ 이는 내이 코티기관세포에 대한 에너지원으로 사용된다.¹¹⁾
   내이내의 대사는 혈관조(stria vascularis)에서 왕성하여 산소나 에너지원의 이용이 코티기관에 비하여 월등히 높다.¹²⁾ 그러므로 허혈이나 저산소증때 혈관조에서의 lactate 형성이 많을 것으로 생각되며 이는 외림프에 축적되어 내이코티기관에 영향을 미칠 가능성이 높다.
   그러므로 세포외에 투여된 lactate가 청력역치를 증가시키는 지에 대해 알 수 있다면 난청의 원인을 한가지 알 수 있게 되는 셈이다. 이에 저자들은 lactate를 기니픽의 정원창을 통하여 내이에 투여하고, 이것이 청력에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

실험동물
   실험동물로는 정상적인 Preyer's reflex를 보이고, 청성뇌간유발반응(ABR)에서 정상 청력을 보인 200~300 g의 기니픽 22마리를 사용하였다.

실험용액
   HBSS buffer는 HEPES 5 mM, NaCl 136.0 mM, KCl 5.4 mM, Na₂HPO₄ 0.34 mM, D-glucose 5.5 mM, MgSO₄ 0.81 mM, KH₂PO₄ 0.44 mM, CaCl₂ 1.25 mM를 1 L의 H₂O에 섞고, pH를 7.4로 맞추고, 4°C에서 보관한 것을 사용하였다. Lactate sodium을 HBSS buffer에 넣어 10 mM로 농도를 맞추고(305 mOsm) 역시 실험 시작전까지 4°C에서 보관하였다.¹⁰⁾ 실험용액은 모두 Sigma(St Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

실험동물의 마취
   실험 동물의 마취는 ketamine hydrochloride(30 mg/kg)와 xylazine(2 mg/kg)을 근육 주사하였으며, 필요시 상기 용량의 반을 추가로 주사하였다.

청력역치의 측정
   ABR은 Traveler Express(Biologic Systems Co., Mundelein, IN, USA)를 사용하여 검사하였다. 자극음은 초당 13회의 교대상 click을 90 dBHL의 강도부터 10 dB씩 낮추면서 측정하였고, 파형이 불분명하게 나오는 음의 강도에 도달하면 5 dB씩 조절하면서 청력 역치를 측정하였다. 청력역치는 wave V를 기준으로 측정하였다. Click음의 frequency filter setting은 100~3000 Hz로 하였고, 총자극음의 횟수는 1024회로 하였다(Fig. 1).

정원창의 노출 및 전극의 고정
   기니픽의 귓바퀴의 내측으로 1.5 cm 정도 길이의 피부 절개를 가하고 Beckman 2×2 prong rectracter를 건 후 골성 외이도의 후내측(posteromedial) 부분의 유양동을 드릴을 이용하여 개방하여 정원창을 노출하였다. ABR측정을 위해서는 patch type의 전극(electrode)을 EEG paste에 묻혀서 피부에 고정하였다.

삼투압농도에 따른 청력역치의 변화측정
   Lactate에 의한 청력역치의 변화를 관찰하는 것이 이 실험의 목적이지만, 이러한 청력역치의 변화가 lactate 때문인지 아니면 buffer의 high osmolarity 때문인지를 감별하기 위하여 다음과 같은 실험을 pilot study로서 고안하여 실시하였다.
   실험을 시작하기 전에 항상 ABR로 청력역치를 baseline으로 측정하였고, 유양동을 열어서 정원창을 노출시킨 후 다시 ABR로 청력역치를 측정하였다. Lactate를 HBSS buffer(300 mOsm)에 녹여서 5 mM(302 mOsm), 10 mM(305 mOsm), 20 mM(313 mOsm), 50 mM(330 mOsm)의 농도를 만들었다. 각 농도별로 만든 lactate용액을 gel foam에 묻혀서 기니픽의 정원창에 유치시킨 후 1시간 간격으로 4시간까지 청력역치의 변화를 측정하였다. 각 농도별로 각각 3귀씩 실험하였다.
   삼투압 농도가 청력역치에 미치는 영향을 알아보기 위하여 NaCl을 HBSS buffer(300 mOsm)에 첨가하여 302 mOsm, 305 mOsm, 313 mOsm, 330 mOsm의 농도를 만들었다. 각 삼투압 농도별로 만든 용액을 gel foam에 묻혀서 정원창에 유치시킨 후 1시간 간격으로 4시간까지 청력역치의 변화를 측정하였다. 각 농도별로 각각 3귀씩 실험하였다.

Lactate에 의한 청력역치의 변화측정
   실험군(5마리, 10귀)과 대조군(5마리, 10귀)을 나누고, 유양동을 열기 전과 유양동을 열어서 정원창을 노출시킨 후 ABR로 청력역치를 측정하였다. 그리고, HBSS buffer(300 mOsm, pH 7.0)를 정원창에 유치시킨 후 다시 청력역치를 측정하였다.
   실험군에서는 10 mM의 lactate를 함유한 buffer(305 mOsm)를 gel foam에 묻혀서 정원창에 유치시킨 후 1시간 간격으로 4시간까지 청력역치의 변화를 측정하였다. 대조군에서는 lactate가 없는 buffer(305 mOsm)를 gel foam에 묻혀서 정원창에 유치시킨 후 역시 1시간 간격으로 4시간 동안 청력역치의 변화를 측정하였다(Fig. 2).

통계처리
   통계학적인 분석은 SAS version 6.12(SAS Institute Inc., USA)를 사용하였으며, 시험약물 처치전 측정한 청력역치들이 군 간에 차이가 있나를 검정하기 위하여 실험시작전에 측정한 청력역치들을 공변량으로 하는 repeated measures ANOVA를 수행하였다. 그리고, 대조군과 실험군 사이에 차이가 있는 지를 보기 위해서는 paired t-test를 수행하였다.

결     과

Lactate의 농도에 따른 청력 역치의 변화
   5 mM의 lactate(302 mOsm)를 투여하였을 때 청력 역치는 21.7±2.4 dB에서 40±4.1 dB로 증가하였으며, 10 mM(305 mOsm)의 경우는 23.3±2.4 dB에서 46.7±2.4 dB로, 20 mM(313 mOsm)의 경우는 23.3±8.2 dB에서 51.6±10.8 dB로, 50 mM(330 mOsm)의 경우는 23.3±2.4 dB에서 58.3±17.8 dB로 증가하여, lactate의 농도가 높아짐에 따라 청력 역치가 증가하는 결과를 보였다(Table 1).

Osmolarity에 따른 청력 역치의 변화
   HBSS buffer에 lactate를 첨가하지 않고 NaCl을 첨가하여 만든 302 mOsm의 buffer를 투여하였을 때 청력 역치는 21.7±2.4 dB에서 28.3±2.4 dB로 증가하였으며, 305 mOsm의 경우는 23.8±2.4 dB에서 31.7±8.2 dB로, 313 mOsm의 경우는 21.7±2.4 dB에서 45±0 dB로, 330 mOsm의 경우는 21.7±2.4 dB에서 53.3±2.4 dB로 증가하여, 305 mOsm까지는 통계학적으로 유의한 청력 역치의 변화가 없었으나 313 mOsm부터는 통계적으로 유의하게 청력 역치가 증가하는 결과를 보였다(Table 2). 그러므로 lactate 농도에 따른 청력역치변화와 비교하여 10 mM의 lactate를 삼투압 농도에 따른 영향을 배제할 수 있는 농도로 결정하여 앞으로의 실험용액으로 사용하였다.

Lactate 투여군(실험군)과 비투여군(대조군)의 청력 역치의 변화

대조군
   대조군에서 처음 청력역치는 29.5±3.7 dB(mean±SD)였으며, 유양동을 열고난 후의 청력역치는 30.5±4.9 dB, buffer를 투여한 직후의 역치는 33.5±4.7 dB였고, buffer 투여 1시간 후의 역치는 33.0±4.2 dB, buffer 투여 2시간 후의 역치는 35.0±4.1 dB, buffer 투여 3시간 후의 역치는 37.0±3.5 dB, 4시간 후의 역치는 37.5±3.5 dB이었다(Fig. 3).

실험군
   실험군에서 처음 청력역치는 27.0±5.8 dB(mean±SD)였으며, 유양동을 열고난 후의 청력역치는 31.0±6.9 dB, buffer를 투여한 직후의 역치는 32.5±4.8 dB였고, 10 mM의 lactate 투여 1시간 후의 역치는 48.0±4.1 dB, 투여한지 2시간 후의 역치는 52.0±6.7 dB, 3시간 후의 역치는 53.0±6.3 dB, 4시간 후의 역치는 54.5±5.9 dB이었다(Fig. 3).

통계학적 분석
   처음 유양동을 열은 후, buffer를 유치시킨 후에 대조군과 실험군 사이에 유의한 차이가 없었다(p>0.05). Lactate투여 1시간후, 2시간후, 3시간후, 4시간후에 대조군과 실험군 사이에는 유의한 차이가 있었다(p<0.05)(Table 3).
   그리고, 시간에 따른 청력역치의 변화는 대조군에서는 처음부터 buffer 투여 4시간후까지 유의한 차이가 없었고, 실험군에서는 처음부터 유양동을 열고 buffer를 유치시킨 후까지 유의한 차이가 없었지만, buffer 투여후와 lactate투여 1시간후 사이, 그리고 lactate투여 1시간후와 2시간후 사이에는 통계적으로 유의한 차이가 있었다(p<0.05).

고     찰

   조직내로의 혈류가 조직의 산소요구량을 충족시키지 못할 때 lactate의 농도가 증가한다는 것은 이미 잘 알려진 사실이고,⁷⁾ 전신적으로 조직내에 저산소증(hypoxia)이 있을 경우 혈액내 lactate가 증가하게 되고, 과락테이트혈증(hyperlactatemia)은 혐기성 대사(anaerobic metabolism)의 임상적 지표로도 사용되고 있다.¹³⁾
   와우로 가는 혈류량이 감소하거나 저산소증 때 청력 감소가 나타나는데, 이는 여러 가지 원인이 있을 수 있으나, 산소부족에 의한 lactate의 조직 내 축적도 청력감소의 한가지 원인이 될 수 있다는 것을 본 연구로부터 검증하였다. 심근세포(myocardial cell)에서 조직으로의 혈류 감소가 있을 때 기능적인 이상이 오는 이유가 세포외액의 lactate축적 및 pH저하로 인해 Ca^2＋의 과부하(overload)가 일어나기 때문이라는 보고가 있으며,¹⁴⁾¹⁵⁾ 내이에서도 이러한 lactate의 축적에 의한 유모세포의 손상이 일어나는 것이 중요한 원인으로 생각된다.
   Lactate가 어떤 조직에서 생성되어 축적되는지는 아직 밝혀져 있지 않다. 혈관조는 산소 및 에너지 요구량이 많은 조직이며 혈관조로 공급되는 혈류량도 대사부산물들에 의하여 영향을 받지 않는 것으로 알려져 있다. 이에 비해 유모세포는 산소요구량이 크지 않으며 주로 내림프에서 조절되는 electrochemical energy를 이용할 것으로 여겨지고 있다.¹⁶⁾ 그러므로 산소부족에 의하여 혈관조에서 생성되는 lactate가 내림프를 통해 코티기관 유모세포에 영향을 미치는 기전을 생각해 볼 수 있다. 그러나 본 연구에서는 외림프에 lactate를 투여하였기 때문에 이것이 내림프로 이동한다는 증거는 없으므로 앞으로 연구하여야 할 과제이다.
   Lactate에 의해 가능한 유모세포의 손상기전은 pH의 저하에 의해 정상적인 glycolytic pathway가 저해되어 생겼을 수 있으며, lactate 자체의 이독성, 또한 pH 변화에 의한 ion 조성의 변화에 의해 electrochemical 환경이 변하여 생길 수도 있다.
   본 실험에서는 lactate에 의한 pH의 효과를 보정하지 않았으며, lactate의 농도가 5 mM 일 때 pH 7.346이었으며, 10 mM일 때 pH 7.302, 50 mM일 때 pH 7.154로 감소하여 lactate 없이 propionic acid 등을 이용하여 buffer의 pH를 변화시켜 이것에 의해서 어떤 청력변화를 보이는지에 대한 추후 실험이 필요할 것으로 생각된다. 또한 lactate는 수용성이므로 정원창을 통해 외림프로 침투(diffusion)되는 데에는 별 문제가 없는 것으로 생각되며, 실제 산소공급이 감소되었을 때 외림프 내에 lactate가 증가되는 지에 대해서 알아보기 위한 실험이 필요하다.
   본 실험에서 HBSS buffer의 osmolarity를 300 mOsm로 맞추었는데, lactate 5 mMol의 용액은 osmolarity가 302 mOsm로 증가하였고, 10 mMol의 용액은 305 mOsm, 20 mMol 용액은 313 mOsm, 50 mMol 용액은 330 mOsm로 osmolarity의 상승이 있었다. 처음에 이 용액을 기니픽의 정원창에 투여했을 때 청력감소가 나타났고, 이는 lactate의 농도가 올라갈수록 청력 역치의 증가가 심해지는 결과를 나타내었다. 그러나 같은 삼투압농도의 HBSS를 투여하였을 때 313 mOsm 이상부터는 청력역치의 상승을 보여 20 mM 이상의 lactate 용액은 고삼투압에 의한 효과를 배제할 수 없었다.¹⁷⁾ Hallworth¹⁸⁾의 보고에 의하면 hyperosmolarity에 의해 외유모세포의 stiffness의 감소가 있을 수 있다고 하므로 10 mMol의 lactate를 사용하여 실험을 계획하게 되었다.
   305 mOsm의 buffer만을 투여한 대조군에서는 유의할 만한 청력감소가 일어나지 않았으며 lactate를 투여한 실험군에서만 청력감소가 일어났으며, 위와 같이 실험군과 대조군을 설정하였으므로, 본 실험에서 관찰된 청력 역치의 증가가 고삼투압에 의한 효과가 아니고, 내이에 투여된 lactate 때문이라고 생각할 수 있다.
   본 실험에서 아무런 처치를 하지 않은 상태에서 측정한 청력 역치가 실험군에서는 27.0 dB, 대조군에서는 29.5 dB로 다른 문헌에서보다²⁾³⁾⁴⁾ 높게 나왔으며, 이는 방음실에서 실험하지 못하여 생긴 결과로 생각되며, 또 한가지 이유로 생각해 볼 수 있는 것은 본 실험에서 subcutaneous needle electrode를 쓰지 않고 patch type의 electrode를 사용하였기 때문이라고도 생각해 볼 수 있다.
   Lactate 외에 NADH, NAD, ADP, acetylcholine 등도 조직내의 허혈이 있을 때 증가하는 지표로서,¹⁹⁾²⁰⁾ 혈류량 감소에 의한 청력저하^1)2)3)4)가 와우로의 혈류 감소에 의해 상기 물질들이 증가함으로써 일어날 가능성도 배제할 수 없으며, 그러므로 이에 대한 추가적인 연구도 필요할 것으로 사료된다.

결     론

   기니픽의 유양동을 열거나 유양동을 열고 buffer를 투여했을 때에는 ABR에서 청력역치의 변화가 없었으나, lactate를 정원창을 통해 투여한 후에는 ABR에서 청력 감소를 관찰할 수 있었다. 이를 통하여 와우내의 허혈 및 저산소증에 의한 청력 감소의 원인으로 산소부족에 의해 축적되는 lactate가 작용함을 알 수 있었다.

1. Mom T, Telischi FF, Martin GK, Lonsbury-Martin BL. Measuring the cochlear blood flow and distortion-product otoacoustic emissions during reversible cochlear ischemia: a rabbit model. Hear Res 1999;133:40-52.

2. Telischi FF, Mom T, Agrama M, Stagner BS, Ozdamar O, Bustillo A, et al. Comparison of the auditory-evoked brainstem response wave I to distortion-product otoacoustic emissions resulting from changes to inner ear blood flow. Laryngoscope 1999;109:186-91.

3. Baik MW, Branston NM, Bentivoglio P, Symon L. The effect of experimental brainstem ischemia on brainstem auditory evoked potentials in primates. Electroencephalogr Clin Neurophysiol 1990;75:433-43.

4. Inui H, Murai T, Matsunaga T. Auditory brainstem response findings in brainstem ischemia following selective occlusion of the anterior inferior cerebellar artery in the rat. Ear Arch Otorhinolaryngol 1995;252:181-5.

5. Hildesheimer M, Rubinstein M, Muchnik C, Sahartiv E, Aviv T. A model for research on cochlear hypoxia. Laryngoscope 1983;93:615-20.

6. Ljungdahl M, Rasmussen I, Raab Y, Hillered L, Haglund U. Small intestinal mucosal pH and lactate production during experimental ischemia-reperfusion and fecal peritonitis in pigs. Shock 1997;7:131-8.

7. Mizock BA, Falk JL. Lactic acidosis in critical illness. Clit Care Med 1992;20:80-93.

8. Kambayashi J, Kobayashi T, Demott JE, Marcus NY, Thalmann I, Thalmann R. Minimal concentrations of metabolic substrates capable of supporting cochlear potentials. Hear Res 1982;7:105-14.

9. Ferrary E, Sterkers O, Saumon G, Tran Ba Huy P, Amiel C. Facilitated transfer of glucose from blood into perilymph in the rat cochlea. Am J Physiol 1987;253:F59-F65.

10. Ito M, Spicer SS, Schulte BA. Immunohistochemical localization of brain type glucose transporter in mammalian inner ears: comparison of developmental and adult stages. Hear Res 1993;70:319-28.

11. Nakazawa K, Spicer SS, Schulte BA. Postnatal expression of the major mammalian stress protein in the rat cochlea following transient ischemia. Laryngoscope 1992;102:981-7.

12. Thalmann RR. Quantitative biochemical techniques for studying normal and nooise-damages ears. In: Henderson D. et al. (eds) Effects of noise in hearing. New York: Raven Press;1976. p.129-54.

13. Lee SH, Ho WK, Earm YE. Effects of intracellular Na^＋, Mg^2＋ and metabolites on Ca^2＋-activated K^＋ channels in pulmonary and ear arterial smooth muscle cells of the rabbit. Exp Physiol 1998;83:707-15.

14. Ladilov Y, Schafer C, Held A, Schafer M, Noll T, Piper HM. Mechanism of Ca^2＋ overload in endothelial cells exposed to stimulated ischemia. Cardiovasc Res 2000;47:394-403.

15. Cabrera ME, Saidel GM, Kalhan SC. A model analysis of lactate accumulation during muscle ischemia. J Clit Care 1999;14:151-63.

16. Ryan AF. Circulation of the inner ear: II. The relationship between metabolism and blood flow in the cochlea. In: Jahn AF, Santos-Sacchi J (eds) Physiology of the ear. 2nd ed. San Diego: Singular;2001. p.321-31.

17. Jefferis AF, Johnstone BM. Plasma osmolality variations and their effect on the hearing threshold of the guinea pig. J Laryngol Otol 1987;101:236-44.

18. Hallworth R. Modulation of outer hair cell compliance and force by agents that affect hearing. Hear Res 1997;114:204-12.

19. Katz A, Sahlin K. Effect of decreased oxygen availability on NADH and lactate contents in human skeletal muscle during exercise. Acta Phyiol Scand 1987;131:119-27.

20. Sahlin K, Katz A, Henriksson J. Redox state and lactate accumulation in human skeletal muscle during dynamic exercise. Biochem J 1987;245:551-6.