교신저자：강성호, 380-062 충북 충주시 교현1동 620-5 건국대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   모든 세포가 항상성을 유지하는 목적은 세포내·외의 환경에 적응하여 생존을 영위하기 위함이며, 이러한 항상성은 세포의 정상적인 발달과 회복 및 재생 등 모든 과정에 참여한다.
   내이의 항상성에 대해서 Hawkins¹⁾가 코르티기의 조합성, 감수성 및 미세 항상성 기전의 다양성 등을 처음으로 보고하였다. 여기에는 에너지 요구에 대한 변화, pH, 이온 평형, 감각변형 등의 생리적 기능이 포함되며, 특히 세포내의 이온 조성과 pH는 세포의 대사, 단백질과 DNA의 안정화, 막 전위의 유지, 이온수송 과정, 세포의 용적과 모양을 유지하여 외부환경에 반응하는 능력을 안정된 상태로 유지시키는 역할을 담당하고 있다고 하였다.
   내이는 전해질 조성이 상이한 외림프와 내림프를 함유하는데, 외림프는 혈장과 유사한 조성을, 내림프는 고농도의 K^＋과 저농도의 Na^＋으로 구성되어 있다. 내림프는 외림프나 혈액에 비해 60~100 mV의 양성 전위를 갖는데, 이를 Endocochlear potential(EP)이라 명하였다.²⁾ 그러나 이 전위차가 혈관선조에서 발생됨을 알았지만 그의 정확한 기전에 대해서는 확립된 바가 없었으나, Sellick과 Bock³⁾이 EP는 변연세포의 기저외측막에서 능동적인 electrogenic K^＋ transport에 의해 생성됨을 보고하였다. 이러한 K^＋ 농도는 기저세포가 가장 낮고, 변연세포의 와우관쪽에서 가장 높으며, intrastrial space에서는 electrogenic K^＋ transport의 확산에 의함을 알았으나 그 외 중간세포나 기저세포에 대한 생리적 기능에 대해서는 잘 알려져 있지 않았다.⁴⁾
   이러한 기전에는 변연세포의 와우관쪽에서 K^＋의 전도경로를 통한 수동적 확산에 의해 K^＋ 분비를 설명하는 ‘single pump model’(one-pump model or theory)⁵⁾과 기저세포 및 중간세포의 내부 세포막에서 K^＋ 전도도(conductance)가 내림프 전위에 작용한다는 ‘two-pump model’⁶⁾의 가설이 있다. 이 두 가설들의 공통적인 요소로는 변연세포의 기저외측막에 Na^＋, K^＋-ATPase가 존재하며 이곳에서 Na^＋, K^＋-pump에 의해 이온 수송이 이루어진다는 것이다.⁷⁾
   와우의 이온 수송기전은 미세 전자침 기법(whole-cell patch clamp)을 사용하여 내이액의 직류전위와 이온 농도의 측정으로 확립되어지는 바, 세포의 전기적 흥분성과 세포의 성장 및 용적을 조절하는데 중요한 역할을 하는 전압 의존성 K^＋ channel(voltage-dependent K^＋ channel, Kv, I_K, 이하 Kv)에 포함되는 I SK protein(min K),⁸⁾ maxi K^＋ channel,⁹⁾ inward rectifying K^＋ channel¹⁰⁾ 등 대부분의 연구가 변연세포에서 시행되어 왔다. 그러나 변연세포의 단독적인 기전만으로는 와우관내에 내림프의 높은 K^＋ 농도(150 mM)와 양성 전위(＋80 mV)를 유지하는 기전을 설명하기는 부족하였으나 혈관선조의 미세한 해부학적 구조와 중간세포 및 기저세포에 대한 직접적인 분리와 배양 및 접근 방법의 어려움 때문에 그에 대한 연구가 제한적일 수밖에 없었다.
   최근 Takeuchi와 Ando¹¹⁾는 중간세포에서 미세 전자침 기법으로 전압 의존성 K^＋ channel을 관찰하였는데, 그들은 들쥐(gerbil) 와우 혈관선조의 중간세포에서 전압 의존성 K^＋ channels 중의 하나인 outward type(Kv)을 관찰하였다. 그 결과로 변연세포의 Na^＋, K^＋-ATPase와 Na^＋-Cl^--^＋ cotransporter의 역할과 함께 중간세포에서 K^＋ 확산 전위가 존재함과 동시에 EP의 생성과 직접 관련된 voltage jump의 원천이 중간세포에 존재한다는 ‘two-cell model’(혹은 ‘five-compartment model’)의 가설⁴⁾이 되었다.
   본 연구에서는 기니픽 와우의 외측벽에서 전압 의존성 K^＋ channels중에서 I_K(delayed, outward rectifying type)와 I_A(transient, outward rectifying type)의 단백질 유무와 그의 발현 장소를 알아봄으로써 그 기능을 추정하고자 하였다.

재료 및 방법

실험 동물
   Preyer 양성 반응과 고막 및 중이가 정상 소견을 보이는 체중 250~350 gm의 백색 기니픽 50마리를 암수 구별없이 사용하였다.

일차 항체, 이차 항체 및 발색제
   일차 항체로는 UBI사(Upstate Biotechnology. Inc., NY, U.S.A.)의 전압 의존성 K^＋ channel 항체인 1.1[synthetic peptide corresponding to amino acid residues 458-476(EEDMNNSIAHYRQANIRTG) of the C-terminus of rat brain Kv1.1 Clone K20/78], 1.2[Bacterially-expressed GST-fusion protein corresponding to amino acids 428-499 of rat heart Kv1.2 Clone K14/16], 1.4[Synthetic peptide corresponding to amino acids 13-37 of rat brain Kv1.4(NSHMPYGYAAQAR-ERERLAHSR)], 2.1[Bacterially expressed GST-fusion protein corresponding to amino acids 509-853 of rat Kv2.1]을 사용하였다.
   Western blot의 이차 항체는 biotin이 결합된 anti-mouse IgG(H＋L)(Vector Laboratories, Inc., CA, U.S.A.)와 Vectastain^® Elite ABC KIT(Vector Laboratories, Inc., CA, U.S.A.)를, 면역조직화학염색의 이차항체는 FITC(Fluorescein isothiocyanate)가 결합된 F(ab‘)2 fragment(Rabbit antimouse immunoglobulins, DAKO Laboratories, Denmark)를 사용하였다. 발색제로는 western blot의 경우 DAB(3,3'-diaminobenzidine)를 이용하였다.

전기영동 및 Western blot
   15마리의 실험 동물에 30% chloral hydrate(2 mg/kg)를 복강내 주사하여 마취한 후, 신선한 상태에서 가급적 빨리 머리를 자르고, 측두골을 분리한 후 골포를 얻었다. 실체 줌 현미경(Olympus SZH-10, Japan)하에서 0.1 M PBS(phosphate buffered saline, pH 7.5)에 담근 상태에서 와우 감각상피(내·외 유모세포, 지주세포), 와우 외측벽(나선인대, 혈관선조)을 분리하였고, 양성 대조군으로 토끼의 심장(Transduction Laboratories, San Diego, CA, U.S.A)을 사용하였다.
   각 조직을 10 mM HEPES buffered solution(sodium N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid, pH 7.4)과 함께 균질화하였다. 균질화된 조직들을 1분간 원심 분리한 후, 상층액을 BSA(Bovine serum albumin)를 이용한 dye binding protein assay를 통해 단백질의 농도를 측정하여 각각의 조직에 대한 단백질의 농도를 동일화하였다.
   동일 농도의 각 조직 17 μg에 sample buffer(62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% sodium dodecyl sulfate, 10% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol, 0.003% bromophenol blue)를 5 μl 첨가한 뒤, 100°C에서 5분간 가열하고 원심 분리한 후, 각 조직을 10% Tris-HCl(READY GEL, Precast Gel for Polyacrylamide Electrophoresis, Bio-Rad Labaratories, CA, U.S.A)의 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)에 걸어 전기영동조에서(Mini PROTEAN^® 3 System, Bio-Rad Labaratories. CA. U.S.A.) 200 V로 2시간동안 단백질을 분리하였다.
   전기영동된 겔을 전사용액에 30분간 충분히 적신 nitrocellulose 막(0.45 μm, Bio-Rad Labaratories. CA, U.S.A.)에 전기이동장치(Mini Trans-Blot^® Electrophoretic Transfer Cell, Bio-Rad Labaratories, CA, U.S.A.)를 사용하여 전사하였다. 전사된 nitrocellulose 막의 비특이적 반응을 제거하기 위해 실온에서 0.1 M PBS(phosphate buffered saline)로 희석된 3% 탈지유(skim milk)로 안구형 진탕기 위에서 12시간동안 반응을 시킨 후, 3% 탈지유로 희석된 일차 항체들을 실온에서 3시간 처리하였다.
   일차 항체는 1：250으로 희석하였고, 이차 항체는 일차 항체에 상응하는 용액을 1：200으로 희석하여 30분씩 실온 반응시킨 후 발색제로 약 20초간 반응시켰다. 전기영동 용액은 premixed running buffer^®(Tris/Glycine/SDS, Bio-Rad Labaratory, CA, U.S.A.)로, 전사용액은 premixed running buffer(r) (Tris/Glycine, Bio-Rad Labaratory, CA, U.S.A.)를 사용하였으며, 전사 후 각 단계 사이는 0.1 M PBS로 15분씩 3회 세척하였다.

와우의 면역조직화학 염색
   35마리의 실험 동물에 30% chloral hydrate(2 mg/kg)를 복강내 주사로 마취한 뒤 흉강을 열고 0.1M PBS와 4% paraformaldehyde를 각각 100 ml씩 좌심실을 통해 관류 고정하였다. 머리를 자른 후 측두골을 제거한 뒤, 0.1 M PBS 용액하에서 골포를 열고 실체 줌 현미경을 통해 등골을 적출하고 와우 첨단의 외부 골편을 제거한 뒤 난원창과 정원창으로 1 ml의 4% paraformaldehyde로 재관류 후, 24시간 동안 재 고정하였다.
   10% EDTA(ethylenediaminetetraacetate, Sigma, U.S.A.)로 1주일간 탈회하였으며 용액은 매일 교환하였다. 통상적인 파라핀 포매 후, 6 μm 두께로 종단하여 aminoprophyl coated APS slide에 부착시켰다. 조직의 처리는 100% xylene으로 5분씩 3회 탈파라핀화 및 100%, 95%, 85%, 75% ethanol에 5분씩 함수한 뒤 0.3% H₂0₂가 섞인 methanol에 10분간 넣고, 흐르는 물에 10분 동안 세정하였다. 혈관선조의 cell type을 확인하기 위하여 면역조직화학 염색 절편의 인접 절편에 H & E 염색을 시행하였다. 일차 항체에 상응하는 0.3% TRITON X-100이 첨가된 5% rabbit serum으로 상온에서 1시간 blocking한 후 다시 0.1 M PBS로 세척하였다. 각각의 일차 항체를 1% rabbit serum으로 1：8-10으로 희석하여 4°C에서 12시간 처리하였고, 이차 항체는 1：10으로 1시간 30분 반응시켰다. 각각의 반응마다 0.1M PBS로 5분간 3회 총 15분간 세척하였다. 각각의 slide를 cover glass로 봉합한 후, 암실에서 형광 현미경(Nikon ECLIPSE TE300, Tokyo, Japan)으로 관찰하였고, 필름 노출시간은 1분 30초였다. 대조 실험은 상기의 과정에서 일차 항체를 생략하고 시행하였다.

결     과

Western blot
   와우관의 외측벽에서 각각의 전압 의존성 K^＋ channels의 항체를 전기이동장치를 사용하여 관찰하였다. 약 80 kDa 근처에서 delayed outward rectifiers(I_k) Kv 1.1, Kv 1.2, Kv 2.1 뿐만 아니라 transient outward rectifier(I_A) Kv 1.4의 항체에 대한 띠가 대조군으로 사용한 토끼 심장에서와 같이 관찰되었다. 그 외에 각 항체보다 분자량이 적은 띠들이 관찰되었으나 비특이적 반응으로 간주하였다(Fig. 1).

와우의 면역조직화학 염색
   와우 종단 절편 표본의 외측벽에서 FITC를 이용한 면역조직화학 염색을 통해 각종 K^＋ channel의 항체를 관찰하였다. 면역조직화학 염색 절편에서 인접한 부위의 절편을 H & E 염색하여 와우 외측벽의 구조 즉 나선인대와 혈관선조의 변연세포, 중간세포, 기저세포를 확인하였고(Figs. 2 and 3), 양성 대조군으로는 나선신경절 세포를 사용하였다(Fig. 4).
   그 결과는 다음과 같다.
   1) Delayed, outward rectifiers(I_K)인 Kv 1.1, 1.2 및 2.1 항체 모두 와우 외측벽 중 혈관선조의 중간세포에서 강하게 반응을 보였고, 중간세포 이외의 혈관선조에서는 약한 반응을 보였다(Figs. 5, 6 and 7).
   2) Transient, outward rectifiers(I_A) 1.4 항체는 와우 외측벽 중 혈관선조의 중간세포에서 강하게 반응을 보였고, 중간세포 이외의 혈관선조에서는 약한 반응을 보였다(Fig. 8).

고     찰

   와우 외측벽은 외배엽 기원의 변연세포, 신경외배엽 기원의 중간세포, 중배엽 기원의 기저세포들로 이루어진 혈관선조와, 혈관내피세포, 혈관주위세포 및 다양한 형태의 섬유세포들이 존재하는 나선인대로 구성되어 있다.
   와우관의 외측에 존재하는 변연세포와 기저세포들은 서로 tight junction으로, 중간세포와 중간세포, 중간세포와 혈관내피세포, 중간세포와 기저세포, 기저세포와 기저세포, 기저세포와 섬유세포 및 섬유세포들은 gap junction으로 연결되어 있어 나선인대의 섬유세포에서 혈관선조의 중간세포까지는 이온과 분자들이 서로 자유롭게 이동된다. 즉 중간세포는 외림프로부터 intrastrial space로 K^＋을 이동시키기 위해 잘 짜여진 구조 내에서의 완벽한 결합을 제공하며, 변연세포와 기저세포 사이를 수많은 gap junction으로 지지해 주고 있는 것이다. 기저세포 내로의 K^＋ 이동은 나선인대의 섬유세포와의 gap junction에 의한 것으로 섬유세포들로부터 에너지를 제공받으며, Na^＋, K^＋-ATPase와는 무관하게 작용한다.¹²⁾ 변연세포의 tight junction은 선택적인 이온 수송과 용질들을 유지하는데 많은 에너지를 필요로 하는데, 분자의 농도와 전위차(potential difference)에 의해 내림프쪽의 전위가 ＋80~90 mV로 유지시킨다. Gap junction은 1 kDa 이하의 작은 분자 수송에 필요한 통로를 제공하는데, 세포내 전위, pH, Ca^2＋ 농도, 종양유발인자, 호르몬, retinoic acid 등에 의해 조절되며, K^＋을 수동적으로 이동시킨다.¹³⁾
   본 연구에서는 기니픽 와우 종단 절편 표본의 외측벽에서 H & E 염색으로 혈관선조의 변연세포, 중간세포, 기저세포를 확인할 수 있었고, 또한 FITC를 이용한 면역조직화학 염색을 통해 각종 K^＋ channels의 항체를 관찰하였다. 백색 기니픽 와우의 혈관선조, 특히 중간세포가 Kv 항체들에 강하게 발현되었고, 중간세포 이외의 혈관선조의 세포에서는 약한 반응을 보였다.
   이상의 결과로 와우관내에 내림프의 높은 K^＋ 농도(150 mM)와 양성 전위(＋80 mV)의 유지는 혈관선조의 중간세포에서 이루어지는 것으로 유추할 수 있어 현재 많은 지지를 받고 있는 ‘two-cell model’이 가장 합당한 이론이라고 생각한다.
   와우 감각상피의 K^＋은 inward rectifying type으로 코르티기 세포외 공간에 완충역할(buffer)을 제공해 주고,¹⁴⁾ 신경감각 활성도(sensory & neural activity)를 증가시키면서, 지지세포와 기저막에 존재하는 gap junction을 통해 재순환된다.¹³⁾ 유모세포의 섬모들에 존재하는 mechanoelectrical transducer channel은 내림프와 접하고 있고, transducer channel이 열릴 때 유모세포 내부로 K^＋이 유입되게 된다. transducer channel을 통한 K^＋ 이동의 driving force는 EP와 유모세포의 안정막 전위(resting membrane potential, -50~-40 mV)에 의해 생성되는 전기적 변화(electrical gradient)인 것이다.¹⁵⁾ 따라서 본 연구에 사용된 Kv channel 항체들이 와우의 감각상피계에서 발현되지 않은 것은 K^＋ channel들의 특성이 서로 다르기 때문에 Santos-Sacchi의 보고¹⁴⁾와 일치하는 결과라고 생각된다.
   K^＋의 와우내 흐름은 나선인대의 root cells이 K^＋의 원천으로서 II형과 IV형 섬유세포의 양성 Na^＋, K^＋-ATPase 반응으로 능동적으로 K^＋이 흡수되고, 각각의 gap junction을 통해 기저세포에서 중간세포로 단계적으로 통과되어 intrastrial space로 들어가 변연세포의 기저외측막에 존재하는 Na^＋, K^＋-ATPase에 의해 흡수되어 내림프로 유입된다. 내림프로 유입된 K^＋은 라이스너막과 기저막을 거쳐 전정계와 고실계를 통과하여 다시 나선인대의 섬유세포들로 재 순환된다.¹³⁾ 또한 I형과 II형의 섬유세포들은 이온 수송 효소와 Ca^2＋-binding protein이 풍부하여 와우의 체액과 이온 평형의 조절에 참여함을 알 수 있다.¹⁶⁾
   Takeuchi 등¹¹⁾은 patch-clamp 기법으로 선택적 K^＋ 투과를 허용하는 maxi K^＋ channels의 존재를 변연세포에서 측정하였는데, 이는 large-conductance Ca^2＋-activated K channel로 세포내 Ca^2＋ 농도와 탈분극 전압에 의해 활성화된다. 그러나 Ca^2＋의 활성화에 의해서 만이 K^＋의 이동이 일어나기 때문에, maxi K^＋ channel과 non-selective cation channel 만으로는 내림프의 풍부하고 고농도의 K^＋ 이온을 유지시킬 수 없음을 알았다. 그러므로 한번에 빠른 속도로 다량의 K^＋을 이동시키게 하는 또 다른 통로가 있음을 증명함이 와우내 EP 생성 기전을 규명하는 중요한 열쇠라 말할 수 있는 것이다. 또한 변연세포의 와우관측에서 inward rectifying K^＋ channels의 존재를 알았는데 이는 세포내 Ca^2＋과 관계없이 독자적으로 작용을 한다고 하였고,¹⁰⁾ Kv인 outwardly rectifying current 역시 inwardly rectifying current와 함께 존재함을 발견하였으나,¹⁷⁾ 변연세포에서 전압 의존성(voltage dependency)의 존재는 연구 결과마다 다르게 보고 하고있다.¹⁸⁾ 본 연구에서 Kv 항체에 대한 면역반응이 중간세포의 결과와 다른 양성 반응으로 보여지고 있어 이는 변연세포에서의 전압 의존성이 존재하기는 하나 그 역할은 중간세포에 비해 미미할 것으로 추정된다.
   중간세포에서의 K^＋ conductance로 inwardly rectifying K^＋ current가 존재한다는 사실은 미세 전자침 기법을 사용하여 밝혀내었는데, 이는 혈관선조의 ‘two-cell model’을 뒷받침해주는 사실로 상대적으로는 K^＋의 outward current가 존재한다는 것을 암시하기도 하였다.¹¹⁾ 또한 전압 의존성 outward K^＋ current 역시 동일한 방법으로 실험하였으며, K IR channel의 활동이 감소되었을 때 보조적인 역할을 한다고 하였다.¹¹⁾ 중간세포에서 Kv conductance와 K_IR channel의 역할은 EP의 생성에 공헌하고,¹¹⁾ intrastrial space로의 K^＋ 분비는 외림프에서 내림프로의 K^＋-recycling pathway의 부분에 중요하며,¹⁹⁾ 이는 변연세포의 Na^＋, K^＋-ATPase 와 Na^＋-K^＋-Cl^- cotransporter에 의해 재 흡수된다고 생각된다. 따라서 중간세포에서의 K_IR channels은 outward current를 조절한다고 여겨진다. 본 연구 결과를 보면 Kv 중에서 I_K의 항체에서 강양성 반응을 나타내어 Takeuchi와 Ando의 보고¹¹⁾와 일치하며, 섬유세포에서 이동된 다량의 K^＋을 기저세포에서 변연세포로 빠르게 이동시켜 EP를 생성하게 하는 역할을 한다고 생각되나, I_A 항체에 대해서는 향 후 생리학적 검증을 통해 규명해야 될 과제라고 생각된다.
   또한 Kv channels는 여러 형태의 세포에서 세포분열에 관여하므로,²⁰⁾ 중간세포에서 세포의 증식에 참여한다고 추정되었으며²¹⁾ 이는 이온 수송과 세포의 발달, 성장 회복 및 재생에 관여하는 성장인자 수용체의 와우내 연구에서 기저세포를 제외한 변연세포와 중간세포에서 강양성 반응을 보고가 있었다.²²⁾ 본 연구 결과로는 변연세포와 중간세포는 이온 수송과 세포의 분열 및 재생을, 기저세포는 이온 수송만을 담당하는 기능을 가지고 있으리라 생각된다. 그리고 전압 이외에 잘 알지 못하는 다른 활성화 기전이 와우의 외측벽 특히 혈관선조에 존재함을 증명하는 것과 혈관선조 세포들의 생리적 기능과 조절 기전을 확립하는 것이 앞으로 수행해야 할 연구 과제이다.
   본 연구에서는 기저세포에서의 Kv 양성 반응을 명쾌하게 제시하지 못하였는데, 이는 Kv 단백질이 미량으로 존재하므로 통상적인 염색(예, DAB 염색)으로는 발현 양상을 보기 어렵기 때문이라고 생각되며, 이에 대한 지속적인 연구가 필요하겠다.

결     론

   본 연구에서는 delayed outward rectifiers(I_K) Kv 1.1, Kv 1.2, Kv 2.1과 transient putward rectifier(I_A) Kv 1.4에 대한 항체를 사용한 western blot을 통해 이들 channels이 백색 기니픽 와우관의 외측벽, 특히 혈관선조의 중간세포에서 많이 발현됨을 관찰하였고, 또한 이를 FITC를 이용한 면역조직화학 염색을 통해서도 입증하였다.
   이와 같은 결과는 EP 발생에 있어서 현재 많은 지지를 받고 있는 ‘two-cell model’이 가장 합당한 이론이라고 생각된다. 특히 Kv는 혈관선조 세포 각각의 구조, 이온 조성 및 직류 전위의 차이에 의해 모두 존재하지만 본 연구의 결과를 검토하면 중간세포에서 가장 능동적으로 작용하여 와우관-변연세포-기저세포-섬유세포로 이어지는 고리에 있어서 다량의 빠르고 강한 K^＋의 흐름을 형성하여 내림프와 EP의 생성, 종국에는 와우의 항상성 유지·조절에 중심적인 역할을 담당한다고 생각된다.
   또한 본 연구에서 Kv 항체에 대한 변연세포에서의 면역반응이 중간세포의 결과보다 약하게 보여지고 있어 변연세포에서의 전압 의존성 K^＋ channels이 존재하기는 하나 그 역할이 중간세포에 비해 미미할 것으로 추정된다.

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