교신저자：이도용, 501-717 광주광역시 동구 서석동 375 조선대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   암의 발생은 암유전자의 활성화나 종양억제 유전자의 비활성화에 의하거나 또는 세포의 성장, 분화 및 증식에 관여하는 여러 성장인자와 수용체들의 상호 불균형에 의해 세포의 형질전환이 일어나 종양세포로 발전한다고 알려져 있다.¹⁾²⁾ 두경부암에서 일정한 치료방침에 따라 치료를 하더라도 종양의 병기와는 무관하게 재발이나 진행이 현저한 증례를 경험하는 경우가 있다. 이것은 종래의 임상병리학적 인자로서 평가하기 곤란한 암세포 개개의 생물학적 특성 때문으로 해석할 수 있다. 최근에는 분자생물학의 발달에 따라 암의 임상적 악성도를 평가하는 변수로서 세포생물학적 지표를 이용하고 있다. p53유전자는 인간의 제 17 번 염색체의 단완(17q13)에 위치하며 세포증식을 조절하는 핵인단백질(nuclear phosphoprotein)로 세포주기의 조절, DNA교정 및 세포소멸(apoptosis)에 관여하여 세포의 증식과 변형을 억제한다.³⁾
   상피성장인자(EGF)는 호르몬과 유사하게 세포의 생존에 필수적이며 전환성장인자 알파(TGF-α)처럼 세포막에 위치하는 상피성장인자 수용체(EGFR)에 결합하여 세포의 성장, 증식 및 분화를 촉진시킨다.⁴⁾ 또한 c-erbB-2는 인간의 염색체중 17q21에 위치하며, 상피성장인자 수용체와 유사한 막단백질의 부호를 결정하는 원종양 유전자(protooncogene)로서 증폭(gene amplification) 기전에 의해 암의 발생에 관여하는 것으로 알려져 있고 예후를 예측할 수 있는 한가지 인자가 될 수 있다고 알려져 있다.⁵⁾
   이에 저자들은 두경부 악성종양에서 종양의 발생, 성장, 전이 및 악성도 등과 관련 있을 것으로 여겨지는 p53단백, EGF, c-erbB-2의 면역조직화학적 발현양상을 임상적 특징과 비교 검토하여, 악성도와 관련한 예후 인자로서의 가능성을 알아보고자 본 연구를 시행하였다.

대상 및 방법

대  상
   1995년 1월부터 1999년 6월까지 두경부 편평세포암종으로 수술을 받았던 환자의 조직표본 중 보관상태가 양호한 64예를 대상으로 하여 면역조직화학적 염색을 시행하였다. 환자의 남녀 비는 54：10으로 남자가 많았으며, 연령별 분포는 27세부터 85세로 평균연령은 60.8세였다. 발생부위별로는 후두암 19예, 설암 11예, 편도암 8예, 구강저암 7예, 하인두암 7예, 상악암 5예, 기타암종 7예였다. 병리조직학적 분화도는 고분화암이 48예, 중등도분화암이 11예, 저분화암이 5예였다. T- 병기, 경부 림프절 전이를 이용한 임상적 병기는 미국 암협회분류(AJC classification, 1997)에 따라 분류하였다. T- 병기는 T1 10예, T2 26예, T3 15예, T4 13예 이었으며, 림프절 병기는 N0 34예, N1 14예, N2 12예, N3 4예 이었으며, 임상적 병기는 제 1 기 9예, 제 2 기 13예, 제 3 기 18예, 제 4 기 24예 이었다.

방  법
   환자의 임상기록과 병리기록으로부터 나이, 성별, 원발부위의 구분과 종양의 크기, 림프절 전이, 병리조직학적 분화도 등을 후향적으로 분석하였고 조직표본 재료는 hematoxylineosin 염색표본을 검토하여 조직학적 아형과 등급을 정한 다음 종양조직이 50%이상 포함되고 파라핀 포매 조직의 보관상태가 양호한 부위를 선택하여 면역조직화학적 검사를 시행하였다.

면역조직화학적 염색
   일반 광학현미경 검경 후 선택된 파라핀 블록(block)을 찾아 각각 4 μm로 연속 박절하여 탈 파라핀과 함수 과정을 거친 후 항원성 복구가 요구되는 항체인 경우 saline sodium citrate 용액에 담구어 Pleco^TM laboratory microwave oven(Ted Pella Inc, CA, USA)에 5분씩 3회 끓였다. 면역조직화학적 염색은 Streptavidin-biotin universal detection system(Immunotech Co, CA, USA)을 이용하여 이용하여 ABC법으로 염색하였다. 일차항체 EGF(Calbiochem, CA, USA)는 1：20, c-erbB-2(Dako Co. CA, USA)는 1：100, p53단백(Dako Co. CA, USA)은 1：50으로 희석하여 반응시켰다. 발색은 3-acetyl-9-ethyl carbazole(AEC, Immunotech Co., CA, USA)를 이용하였으며, 과염색을 방지하기 위하여 발색시작 5분 경과 시점으로부터는 수시로 현미경을 통한 감시를 하여 적정한 시점에서 발색을 마쳤다. 그후 Mayer's hematoxylin으로 대조염색을 하고 universal crystal mount(Biomeda co., USA)로 봉입하여 관찰하였다.

면역 조직화학적 염색의 결과 판정 
   염색결과의 평가는 주관성을 배제하기 위해 1인의 병리의에 의해 동일한 기준으로 일관성을 가지고 관찰하여 정하였다. p53단백(Fig. 1)이나 EGF(Fig. 2)는 세포의 핵에 염색된 경우를 양성으로, c-erbB-2(Fig. 3)는 세포막이나 세포질에 염색된 경우를 양성으로 판정하였다. 광학현미경에 나타난 종양 부위를 정하고 100배 시야에서 종양세포 중 양성으로 염색된 세포의 수를 세었다. 그러나 종양세포의 5% 미만에서 나타난 경우는 음성으로 판정하였다.

통계학적 검증
   p53단백, EGF, c-erbB-2의 양성 발현율과 원발종양의 크기, 경부 림프절 전이유무, 병리조직학적 분화도, 임상적 병기 등 예후 관련 요소들과 발현율과의 상관성은 Chi-square test를 통해 시행하였으며 유의수준은 p<0.05로 정하였다.

결     과

p53단백, EGF 및 c-erbB-2의 발현
   전체 64예의 두경부 악성종양에서 각 항체의 면역조직화학적 염색의 발현결과 p53단백의 양성 발현율은 34예(53.1%), 음성 반응은 30예(46.9%)였다. EGF는 19예(29.7%)에서 양성 발현을 보였으나 염색성이 낮게 나타났으며, 45예(70.3%)는 음성 반응이었다. c-erbB-2는 37예(57.8%)가 양성 발현을 보였고 27예(42.2%)가 음성 반응을 나타냈다.

원발부위와 발현율의 비교
   p53단백에 대한 발현은 구강저암과 기타암에서 42.9%로 가장 낮았고 편도암에서 62.5%로 가장 높았다. EGF는 편도암에서 12.5%로 가장 낮은 발현을 보였고 구강저암에서 42.9%로 가장 높은 발현율을 보였으며 c-erbB-2는 구강저암에서 14.3%의 발현율을 보였고 편도암에서 87.5%로 가장 높은 발현율을 보였으나 통계학적 의미는 없었다(Table 1).

T- 병기와 발현율의 관계
   T- 병기에 따른 양성 발현 율은 T1, T2를 조기 군으로, T3,T4를 진행 군으로 나누어 비교하였다. p53단백의 경우는 조기 병기인 경우 41.7%의 양성 발현율이었고 진행된 병기인 경우 67.9%의 발현율로서 진행된 병기에서 발현율이 높았으며 이는 통계학적인 유의성이 있었다(p<0.05). 그러나 c-erbB-2의 경우 47.2%와 71.4%로 진행 군에서 발현율이 증가하였고, EGF의 경우 병기가 증가할수록 발현율이 감소하였으나 이들은 통계적인 유의성은 없었다(Table 2).

경부 림프절 전이와 발현율의 관계
   임상적 소견상 경부 림프절 전이가 없었던(N0) 군과 있었던(N1-3) 군으로 구분하여 비교하여 보면 p53단백의 경우 경부 림프절 전이가 있었던 군이 63.3%로 없었던 군 44.1%에 비교하여 발현율이 높았고, EGF의 경우는 23.3%와 35.3%의 발현율로서 림프절 전이가 있었던 군에서 발현율이 낮았으며 c-erbB-2 경우 비슷하게 발현하였으나 통계학적 유의성은 없었다(Table 3).

임상적 병기와 발현율의 관계
   조기 병기인 제 1, 2기와 진행된 병기인 제 3, 4기의 2군으로 나누어 비교하면 p53단백의 양성 발현율은 각각 31.8 %와 64.3%로서 통계학적으로 유의하게 진행된 병기에서 발현율이 높았다(p<0.05). 그러나 c-erbB-2의 경우 진행된 병기에서 발현율이 높았고, EGF의 경우는 초기병기에서 발현율이 높았으나 통계학적인 유의성은 없었다(Table 4).

병리조직학적 분화도와 발현율의 관계
   p53단백의 경우와 c-erbB-2경우에서 분화도가 낮을수록 발현율이 높게 나타났으며, EGF의 경우는 분화도가 좋을수록 발현율이 높았으나 통계학적인 유의성은 없었다(Table 5).

고     찰

   종양의 악성도는 그 종양의 특성을 결정하며 진단 및 치료나 예후 등이 동일종양에서도 다르게 나타나므로 최근에는 성장인자와 그 수용체, 변형된 암유전자, 암유전자 단백산물, 혹은 암억제유전자 단백산물을 종양세포에서 규명하여 종양의 악성도 및 예후와의 관계를 밝히려는 노력이 진행되고 있다.⁶⁾ 이러한 관점에서 두경부암의 특성 및 자연경과를 예측할 수 있는 다양한 인자를 찾고자 하는 많은 연구가 이루어지고 있으며 최근에는 암의 분자유전학적 측면에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나 아직까지 뚜렷한 결론을 얻지 못하고 있는 실정이다.
   p53유전자는 핵인단백질을 암호화하여 세포주기 중 특히 G0기에서 G1로의 이행에 관여한다고 알려져 있으며 p53유전자 산물인 정상 p53(wild type p53)은 단백질로서 세포핵 내에 존재하고 세포주기의 조절에 관여하며 세포의 증식과 변형을 억제하는 기능을 가지고 있으나, 정상세포에서는 세포핵 내 p53의 양이 적고 매우 빠른 반감기로 인하여 면역조직화학적 검색이 불가능하다. 그러나 주로 점변이에 의해 일어나는 것으로 알려진 변이형 p53(mutant-type p53)단백은 증식을 유도하는 암유전자로 작용하여 악성 종양을 일으키고, 생성물은 구조적으로 안정되어 면역조직화학적 검사로 이들 비정상적 p53단백을 검출할 수 있다.⁷⁾⁸⁾ 현재 여러 종류의 암에서 p53단백과 임상적 경과 혹은 예후와의 관련성에 관한 많은 연구가 이루어지고 있으며 악성변화 및 암종의 파괴적 행태를 예측할 수 있는 초기 식별인자로서 역할이 기대되고 있다.⁹⁾ 본 연구에서는 두경부 편평세포암종 64예중 34예(53.1%)에서 p53단백에 양성 발현을 보였고 T- 병기 및 임상적 병기와의 발현율 관계를 비교한 결과 p53단백은 진행된 병기에서 발현율이 통계학적으로 유의하게 높게 나타나 임상적 예후인자로 사용할수 있을것으로 생각된다. 그러나 Dolcetti 등¹⁰⁾은 후두 편평세포암종에서 p53단백의 발현은 임상병기나 조직학적 분화도 및 생물학적 성상과는 관련이 없으며 p53단백의 발현이 침윤성 암종의 초기변화라고 하여 저자들의 연구 결과와 다른 견해를 보였으나 Field 등⁹⁾은 말기 두경부 편평세포암종의 약 16%에서 p53단백에 양성으로 발현되었고 이들의 예후가 p53단백에 음성발현을 보인 경우 보다 예후가 나빴으며, 암 말기에 종양의 생물학적 성상에 p53유전자가 중요한 역할을 한다고 주장하여 저자들과 같은 견해를 보였다.
   상피성장인자(EGF)는 TGF-α처럼 상피성장인자 수용체(EGFR)에 결합하여 세포의 성장, 증식 및 분화를 촉진시킨다.¹¹⁾ Aasland 등¹²⁾은 유두상 갑상선 암에서 EGF가 과발현되면 재발빈도가 높다고 하였고 Sugiyama 등¹³⁾은 EGF의 염색강도가 위암의 악성도와 생물학적 활성도와 연관이 있다고 하였다. 그러나 본 연구에서는 EGF의 경우 29.7%의 양성 발현율을 보였으나 T- 병기, 임상적 병기, 경부림프절 전이 및 병리조직화학적 분화도 등에서 발현율이 통계학적으로 유의성이 없어 EGF는 두경부암의 예후 추정인자로 상호 연관성이 없을 것으로 생각된다. c-erbB-2 암유전자는 transmembrane tyrosine kinase를 부호처리(coding)하는 암유전자로서 표피성장인자 수용체와 구조적 동질성을 갖고 있어서 일종의 성장인자 수용체로 여겨지고 있다.¹⁴⁾ 여러 선암종에서 c-erbB-2 암유전자가 비정상적 과발현을 보이는 사실이 보고되었으며 여러 장기의 선암종에서 과발현시 전이의 가능성이 높고 불량한 예후를 보이는 것이 밝혀졌다.¹⁵⁾ c-erbB-2 암유전자의 과발현은 특히 유방암환자에서 불량한 예후를 보이고¹⁶⁾ 특정한 항 종양화학 요법제에 반응하지 않아서¹⁷⁾ c-erbB-2 암유전자는 예후인자뿐만 아니라 치료의 반응에 대한 예측인자로서의 가능성도 제기되고 있다.¹⁸⁾ Moriyama 등¹⁹⁾은 방광암에서 이의 발현양상이 암의 악성도와 침윤성 및 전이성을 평가할 수 있는 중요한 표식자로 이용될 수 있다고 하였고 Choi 등²⁰⁾의 연구에 의하면 타액선 종양에서의 c-erbB-2 암유전자 발현은 악성종양에서 양성종양보다 높은 양성율을 보였고 병리조직학적으로 고등급인 경우에서 과발현율이 통계적으로 높았다고 했다. 그러나 본 연구에서 c-erbB-2는 T- 병기, 경부 림프절전이, 임상적병기 및 병리조직학적 분화도 등에서 통계학적으로 유의성이 없어 두경부암의 예후인자로서 연관성이 없었다. 이런 결과는 증례수가 충분하지 못하였던 점도 있어 보다 많은 증례를 이용한 객관적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

결     론

   두경부 편평세포암종을 대상으로 p53단백, EGF 및 c-erbB-2의 면역조직화학적 염색을 시행하여 그 발현율과 여러 임상적 특징들과의 연관성을 분석한 결과 종양의 발생에 관여하는 것으로 생각되며 p53단백은 두경부 편평세포암종의 임상적 예후인자로서 사용될 수 있을것으로 생각된다. 그러나 c-erbB-2와 EGF의 경우는 두경부암의 예후추정 인자로서 상호 연관성은 없었다.

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