교신저자：정대건, 130-709 서울 동대문구 전농동 620-56 가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   비용은 이비인후과 영역에서 흔히 관찰할 수 있는 질환으로 적극적인 외과적 치료에도 불구하고 재발을 잘한다. 비용은 조직형태학적으로 비 점막의 만성 염증성 질환으로 염증 세포 침윤과 구조적인 변형을 동반한다. 구조적인 변형은 상피세포층과 고유층(lamina propria)에서 일어나는데. 상피세포에서는 분비성 증식과 편평상피세포성 이형성을 그리고 고유층에서는 세포외 기질의 축적 및 섬유화가 일어난다.¹⁾
   최근 연구는 이러한 구조적인 변형에 초점을 맞추고 변형에 관여하는 cytokine의 연구가 이루어지고 있다. 연구는 주로 두 가지 방향에서 이루어지고 있는데, 하나는 상피세포의 변화와 관련된 연구이며,²⁾³⁾ 다른 한 연구는 고유층의 변화와 연관된 연구이다.⁴⁾
   상피세포와 관련된 연구들을 살펴보면, 비용의 형성에 상피세포가 중요한 역할을 할 것으로 생각하고 상피세포의 증식 및 이와 관련된 cytokine을 연구하였다. 이런 연구들의 근거는 외부적 손상에 대한 점막 보호를 위하여 호흡 상피세포가 계속적인 세포 분화와 증식을 하는 성향을 들 수 있다.⁵⁾ 그러므로 비용의 상피세포 변화는 상피세포 손상후 정상 호흡 상피세포의 분화와 증식의 변형으로 생각된다.⁶⁾ 비용 생성에 관한 동물실험에서도 상피세포 결손 부위를 뚫고 증식된 섬유 조직과 이 섬유 조직위로 증식 및 재생되는 상피세포를 관찰할 수 있었다.⁷⁾ 또한 최근 고유층에 관련된 연구를 살펴보면 세포외 기질의 축적에 관여하는 근섬유모세포(myofibroblast)가 비용을 해부학적으로 나눈 기저(base), 목(pedicle), 몸(body), 꼭지(tip) 부위중 목에서 특히 증가해 있음이 보고되었다.⁴⁾
   고유층의 변화가 비용의 해부학적 부위에 따라 다르다면 염증성 변화의 한 부분을 담당하는 상피세포의 증식도 차이가 있을 것으로 예상된다. 현재까지 상피세포의 증식과 이와 관련된 cytokine의 연구는 시행되었으나,²⁾³⁾ 비용의 해부학적 부위별 상피 세포의 증식에 관한 연구는 아직까지 이루어지지 않았다. 이에 저자는 비용의 해부학적 부위별 상피세포의 증식이 활발한 부위가 고유층에서 염증성 변화가 큰 목 부위와 일치하는지 살펴보고자 하였다. 비용 환자의 비내시경 수술시 완전한 해부학적 형태를 가진 비용, 구상돌기, 중비갑개 및 하비갑개의 점막을 채취하고 대조군으로 비중격 성형술 시행시 하비갑개와 비중격에서 정상 점막을 채취하여, proliferating cell nuclear antigen(PCNA) index를 비교함으로써 비용 조직과 정상 조직의 상피 세포 증식의 차이와 비용의 해부학적 부위별 상피 세포 증식의 차이점을 관찰하고자 하였다.

재료 및 방법

대상 및 재료
   비용 환자군은 낭종성 섬유증 및 일차성 섬모운동 부전증으로 진단받지 않았으며 비내시경 검사상 비용이 확인되고 전산화 단층촬영에서도 비용이 의심되는 21명을 대상으로 하였다. 대조군은 알레르기, 천식 및 비질환의 과거력이 없고 비내시경 검사에서 비용이나 비갑개 비후가 없으며 단순 부비동 촬영에서 정상 소견인 비중격 만곡증 환자 10명을 대상으로 하였다. 비용 환자군에서는 비내시경 수술시 가능한 한 주변 정상 조직을 포함하여 목(pedicle)을 포함한 완전한 형태의 비용을 채취하였고, 대조군에서는 비중격 성형술시 비중격과 하비갑개의 점막을 채취하였다.

방  법

조직 준비
   비용 환자군에서는 하비갑개, 중비갑개 및 구상돌기의 점막과 비용을, 대조군에서는 하비갑개와 비중격의 점막을 수술 중 채취하였다. 그리고 비용 조직은 육안적으로 기저, 목, 몸 및 꼭지의 4부분으로 구분하였다(Fig. 1). 비용을 채취하는 과정에서 비용은 Fig. 1과 같이 목과 기저 부위가 뚜렸하게 구분 가능한 비용만을 채취하였고 너무 작아 구분이 되지 않는 비용이나 너무 기저와 목 부위가 넓은 비용은 채취하지 않았다. 각 조직을 10% paraformaldehyde에 넣고 12시간 뒤에 파라핀에 포매하였다. 포매된 조직을 6 μm 두께의 관상 절편으로 만든 다음 Probe On slide(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)에 부착시켰다.

면역조직화학염색
   슬라이드에 부착된 조직을 60°C에서 xylene으로 탈파라핀한 후 100% 알코올로 탈수시킨 후 증류수로 세척하였다. 내인성 peroxidase 활성을 억제하기 위해 37°C에서 3% H2O2로 10분간 처리하고 나서 인산완충용액(phosphate buffered saline)으로 세척하였다. 주변부의 비특이적인 반응을 억제하기 위해 37°C에서 희석된 정상 horse 혈청으로 30분간 항온 반응시킨 후 1：50으로 희석된 일차 항체와 37°C에서 90분간 반응시켰다. 인산완충용액으로 세척하고 이차 항체(biotinylated anti-mouse IgG)와 37°C에서 30분간 반응시킨 다음 인산완충용액으로 세척하고 horseradish peroxidase-labelled avidin과 37°C에서 30분간 반응시켰다. 인산완충용액에 발색제로 사용한 AEC(3-amino-9-ethylcarbazole)와 0.3% H₂O₂ 용액을 잘 혼합한 다음 37°C에서 10분간 반응시키고 증류수로 세척한 다음 hematoxylin으로 5분간 대조 염색하였다. 증류수 세척 후 봉입 과정을 거쳐 광학현미경으로 관찰하였다. 양성 대조 염색은 인체의 편도선 조직을 이용하여 위와 동일한 방법으로 염색하였고 음성 대조 염색은 일차 항체 대신 인산완충용액만을 첨가하여 위와 동일한 방법으로 염색하였다.
   면역조직화학염색을 위한 일차 항체로 mouse monoclonal anti-PCNA IgG, PC 10(Oncogene Research Products, Cambridge, MA), 일차 항체의 항원-항체 결합을 검출하기 위해 Vectastrian Elite ABC Kit(Vector Laboratories, Burlingame, CA), 발색제로는 AEC(3-amino-9-ethylcarbazole)를 사용하였다.

PCNA index 검사
   광학 현미경 400배 배율로 무작위로 10곳을 정하여 핵이 자홍색으로 염색된 상피 세포를 양성으로 계수하였다. PCNA index는 10곳에서 양성으로 계수된 총 세포 수를 10으로 나눈 평균값으로서, 두 명의 관찰자가 각각 구한 PCNA index의 평균값을 최종 PCNA index값으로 정하였다

통계학적 검증
   통계학적 검정을 위하여 Jandel Scientific 사의 Sigmastat을 이용하였으며, 대조군과 비용 환자군의 비교는 Mann-Whitney rank sum test를 사용하였고, 비용 환자군내의 비교는 Kruskal-Wallis one way analysis of variance on ranks와 All pairwise multiple comparison procedure를 사용하였다. 유의 수준은 p<0.05로 하였다.

결     과

   대조군의 비중격과 하비갑개의 점막, 그리고 비용 환자군의 구상돌기, 중비갑개 및 하비갑개의 점막에서는 상피층의 일부에서 적색의 PCNA에 대한 면역조직화학적 염색 양성을 보이나 양성 세포 수가 적었다(Fig. 2A-E). 그러나 비용 환자군의 비용 조직은 기저 부위를 제외한 모든 부위에서 면역조직화학적 염색 양성 세포 수가 정상군에 비하여 많았으며, 특히 몸 부위가 월등하게 많이 염색되었다. 그리고 양성으로 염색된 세포의 분포를 살펴보면 기저 부위에서는 주로 기저 세포층에서 국한되나(Fig. 3A), 목 과 꼭지 부위에서는 주로 상기저 세포층에서 관찰되며(Fig. 3B and D), 몸 부위에서는 전 층에서 균등하게 분포하고 있었다(Fig. 3C).
   대조군의 비중격과 하비갑개 점막, 환자군의 구상돌기, 하비갑개 및 중비갑개 점막의 PCNA index는 양군간의 차이가 없었다. 환자군 내에서 비용 조직의 기저 부위를 제외한 나머지 부위가 통계적으로(Kruskal-Wallis one way analysis of variance on ranks) 유의하게 높게 나왔으며 그 중에서 몸 부위가(p value <0.0001) 비용의 다른 부위보다 유의하게 높은 값을 나타냈다(Table 1).

고     찰

   비용의 병인론으로 상피 파열론(epithelial rupture theory)과 소강(小腔)론(microcavity theory)이 있는데, 상피 파열론에서는 상피 파열이 있고 파열 부위에 섬유 조직의 증식 및 유탈(prolapse)이 일어난 후 상피세포가 유탈된 섬유 조직위로 재생된다는 이론이다.⁸⁾ 그리고 소강론에 따르면 상피 파열이 일어나고 육아 조직인 섬유 조직의 증식이 일어나는데 이와 함께 상피의 재생이 시작되나 일부는 고유층으로 이동하여 서로 만난다. 서로 연결된 상피세포는 소강(microcavity)을 이루고 비강(nasal cavity)과 연결되고 분활선으로 구분되어 비용이 형성된다는 이론이다.⁹⁾ 두 이론 모두 상피 파열과 섬유 조직의 유탈과 증식을 특징으로 한다. 특히 상피 파열론에서는 상피파열 부위가 비용이 생성되는 부위 즉 비용의 기저 부분이 된다.⁸⁾
   비용의 구조적인 형태 변화는 상피세포층과 고유층에서 일어난다.¹⁾ 최근 연구에서는 상피세포층과 고유층중 어느 부분이 비용 형성의 중요한 역할을 하고 있는지, 이와 동반된 cytokine은 무었인지 그리고 이와 관련된 cytokine을 제어하여 비용을 치료할 수 있는 방법이 무었인지에 대한 연구가 활발하였다.
   비용의 형성에서 상피 파열이 있은 후 초기에는 일반적인 상처 치유 과정을 거치며, 원인은 여러 가지로 제시되고 있으나 결과적으로 지속적인 만성 염증을 일으켜 비가역적으로 비용이 형성되는 것으로 생각된다.⁷⁾ 정상적인 상처 치유 과정을 살펴보면, 염증 세포중에서 주로 대식세포에서 분비되는 cytokine인 다단백질 성장 인자(polypeptide growth factor)가 관여하고 있다.¹⁰⁾ 또한 성장 인자는 상피세포의 분화, 섬유모세포의 분화와 증식 및 섬유 조직의 생성 그리고 신혈관 생성에 관여하는데, 성장 인자의 종류에 따라 관여하는 부분이 다르며, 성장 인자는 염증 세포뿐만 아니라 섬유세포 및 상피세포에서도 일부 생성되고 있다.¹¹⁾
   호흡상피는 내외적인 요인으로 인한 손상에 대해 치유 과정의 일환으로 지속적인 분화와 증식이 일어나는 특성이 있으며,⁵⁾ 비 점막 상피도 호흡상피의 일종이므로 비용의 상피세포 증식도 이러한 정상적인 분화와 증식의 변형으로 생각된다. 또한 비용의 상피세포는 성장 인자인 cytokine의 생산에 관여한다. 그러므로 비용의 상피세포는 상피 결손으로 발생된 염증에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.²⁾³⁾
   상피세포의 증식을 살펴보는 물질인 PCNA는 36 kd의 DNA polymerase-δ accessory protein으로 Miyachi등이 SLE 환자의 혈청에서 자가 항체를 이용하여 처음 발견하였다.¹²⁾ 그후 주로 종양 조직의 세포 증식에 관한 연구가 주로 이루어졌다.¹³⁾ 비(非)종양성 조직인 십이지장 염증 및 대장 용종성 조직에 관한 연구나 기관지 상피세포의 연구에서도 이형성 조직과 양성 종양의 상피세포 증식을 확인하는 방법으로도 유용함이 입증되었다.¹⁴⁾¹⁵⁾ 또한 최근 PCNA를 이용한 비용 조직 실험에서 비용 조직이 정상 비 점막보다 상피세포의 증식이 증가되어 있음을 볼 수 있었고,³⁾ 본 실험에서도 같은 결과를 얻을 수 있었다.
   상피세포층보다 고유층의 변화를 더욱 중요하게 생각하는 연구를 살펴보면 상피세포의 증식보다 섬유모세포의 증식이 더욱 크며 섬유모세포의 증식이 클수록 세포외 기질의 축적이 더욱 현저하여 비용 형성에 중요한 역할을 한다고 하였다.¹⁶⁾ 최근에 발표된 또 다른 연구 결과에서도, 고유층에서 섬유모세포의 collagen 생성을 유도하는 성장 인자인 TGF-β와 섬유모세포중 세포외 기질 단백질을 강력하게 분비하는 근섬유모세포(myofibroblast)의 분포가 비용의 해부학적 부위별로 살펴 보았을 때 목 부위에서 증가되어 있음이 밝혀졌다.⁴⁾ 즉 비용의 해부학적 부위별로 고유층이 염증에 관여하는 정도가 다름을 알 수 있다. 그러므로, 상피세포의 증식도 비용의 부위별로 차이가 있을 수 있으며, 고유층에서의 세포외 기질의 생성과 축적이 활성화된 부위가 상피세포의 변화도 역시 가장 클 것으로 예상하였다. 그러나 본 연구 결과 상피세포 증식이 가장 활발한 곳은 목 부위보다는 몸 부위였다.
   비용의 고유층에서 섬유모세포와 관련된 염증이 가장 활성화된 부위가 목 부위이고,⁴⁾ 본 실험에서 보듯 상피세포층의 증식이 가장 활발한 부위가 몸 부위로 서로 다르다면 비용의 조직형태학적인 특징을 다시 한번 상기하여 볼 때 구조적인 변형이 우세한 부분이 비용의 해부학적 부위별로 각각 다르게 존재한다. 또한 상피세포의 증식에 관여하는 성장 인자는 transforming growth factor-α(TGF-α)와 basic fibroblast growth factor(bFGF)가 있고, 고유층의 세포외 기질의 생산과 섬유모세포의 증식에 관여하는 성장 인자는 platelet-derived growth factor(PDGF)와 tranasforming growth factor-β(TGF-β)가 있다.¹⁰⁾ 그러므로 비용을 해부학적 부위별로 나누고, 각 각 부위별로 상피세포층과 고유층으로 나누어 세포 증식과 염증의 정도를 살펴보고 성장 인자의 관여를 동시에 살펴보는 연구가 비용의 형성을 포괄적으로 이해하는 방법으로 생각된다.
   상피세포층보다 고유층의 변화를 더욱 중요하게 생각하는 연구의 주장이 옳다면, 비용의 목 부위에서 주로 섬유 모세포에 의한 세포외 기질의 생산이 활발하게 시작되며 몸 부위에서 축적된다. 이 과정에서 비용의 모든 부위에서 상피세포의 증식이 수반되나 목 부위에 관여하는 성장 인자가 TGF-β로서 다른 성장 인자보다 더 주된 작용을 하여 상피세포의 성장을 억제하기 때문일 것으로 생각된다.¹⁰⁾ 즉 일단 초기 비용이 형성되면 염증 반응과 TGF-β와 같은 성장 인자는 비용의 입구인 목 부위에서 주로 고유층의 세포외 기질의 형성에 관여하고, 형성된 기질은 몸 부위에서 축적 및 성숙이 된다. 그리고 몸 부위의 상피세포 증식은 고유층의 기질의 축적에 수반된 수동적인 증식으로 생각된다.

결     론

   비용은 정상 비 점막에 비해 상피세포의 증식이 활발하며, 비용 조직의 해부학적인 부위에 따라 PCNA을 이용한 상피세포 증식을 비교한 결과 가장 활발한 부위는 비용의 몸 부위였다. 그리고 비용의 상피세포의 증식은 세포외 기질의 형성과 관련된 수동적인 반응일 수 있으며, 비용의 형성에 있어서 주된 역할을 하는 곳은 고유층의 변화일 가능성이 높다. 그러므로 비용에 관한 상피세포 증식의 연구는 고유층의 변화인 세포외 기질의 축적 및 성장 인자와 관련하여 더 자세한 연구가 필요하리라 생각된다.

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