서     론

   산화질소를 생성하는 유발성 산화질소합성효소(inducible nitric oxide synthase：iNOS)는 대식세포, 섬유모세포, 활성화된 호중구, 혈관 평활근세포 등에서 사이토카인이나 내독소 등의 자극에 의해 유발되며 비유발성 산화질 소합성효소(constitutive NOS：cNOS)와는 달리 스테로이드에 의해 발현이 억제된다.¹⁾
   알레르기 비염과 산화질소의 관계에 대하여 많은 연구가 이루어져 왔으며 최근에는 알레르기 비염환자에서 호기 내 산화질소의 농도가 증가되는 것으로 알려졌다.²⁾ 증가된 산화질소는 혈관확장, 모세혈관 유출, 평활근의 이완, 선분비의 증가를 일으켜 비폐색과 비루 등의 증상을 일으키는 것으로 생각하고 있다.³⁾ 알레르기 비염환자의 증가된 호기내 산화질소의 농도는 스테로이드에 의해 억제된다고 알려져 있으며 이는 화학발광법을 이용하여 증명된 바가 있으나⁴⁾ 조직내에서 iNOS 발현의 감소를 직접 확인한 연구는 아직까지 보고된 바가 없다.
   이에 저자들은 비과민성 및 알레르기성 비염을 유발하는 것으로 알려진 toluene 2,4-diisocyanate(이하 TDI)를 기니픽의 비전정에 국소도포하여 감작을 유발시켜 비점막에서 iNOS의 증가를 확인하고 스테로이드가 iNOS의 발현을 억제하는지의 여부를 확인하여 알레르기성 비염의 병태생리에서 산화질소의 역할을 이해하고자 본 연구를 시행하였다.

재료 및 방법

실험동물

   체중 300~350 g의 건강하고 상기도 감염증상이 없는 기니픽 28마리를 사용하였다. 상기도 감염증상의 유무는 실험 시작 전 3일간 30분씩 실험동물을 관찰하여 비루와 재채기가 없음을 확인하였다. 기니픽 28마리를 3군으로 나누어 A군 10마리는 TDI도포로 비과민성을 유발하고, B군 10마리는 TDI 도포로 비과민성을 유발한 후 스테로이드를 사용한 스테로이드 투여군으로, C군 8마리는 ethyl acetate만으로 도포한 대조군으로 하였다.

방  법

비과민성 동물모델의 제작
   TDI(Sigma, St. Louis, MO)를 ethyl acetate에 용해하여 사용하였으며 약품의 불안정성을 감안하여 용액은 사용하기 직전에 만들어서 사용하였다. 스테로이드제재로는 triamcinolone acetate 분말(한국 롱프랑, 서울, 한국)로 0.15 w/v% triamcinolone acetate 혼합용액을 만들어 사용하였다. A군의 실험동물은 Tanaka의 방법⁵⁾을 응용하여 10% TDI ethyl acetate 용액을 면봉을 이용하여 동물의 양측 비전정에 1일 1회, 연속 5일간 도포하고 2일간 휴지기를 둔 후 다시 연속 5일간 도포하였다(감작도포기간). 3주간의 무처치 기간을 둔 후(도포휴지기간) 감작시와 같은 방법으로 5% TDI ethyl acetate 용액을 이용하여 1주에 3회씩 2주간 유발시켰다(유발도포 기간). B군은 A군과 같은 방식으로 TDI ethyl acetate용액을 도포하면서 도포휴지기간과 유발 도포기간에 triamcinolone acetate 10 μg을 1일 1회 양측 비강에 micropipette을 이용하여 투여하였다. C군은 ethyl acetate만을 사용하여 A군과 같은 방식으로 도포하였다(Fig. 1).

비 증상의 평가
   5% TDI 도포시 동물들은 1분 이내에 재채기, 수성비루, 코를 긁는 동작 등의 알레르기 비염과 유사한 증상들을 보였다. 유발도포기간중 위 증상들을 도포 후 10분간 관찰하였으며, 각각의 증상을 경중에 따라 4단계로 나누고 점수의 합을 비반응의 정도로 판단하여 각 군을 비교하였다(Table 1).⁶⁾

표본제작
   Ketamin(75 mg/kg)과 xylazine(10 mg/kg)의 혼합용액을 근육주사하여 전신마취시킨 후 양측 비강을 노출시켰다. 점막에 손상을 주지 않도록 주의 하면서 비중격에서 비점막을 채취하여 4% paraformaldehyde로 4°C에서 하룻밤 조직고정한 후에 파라핀 포매하였다. 5 μm 두께로 박절하여 절편을 얻어 H-E 염색과 면역조직화학적 염색을 시행하였다.
   H-E 염색을 한 조직절편에서는 호흡점막의 전반적인 조직소견을 관찰하고, 호산구의 조직 내 침윤도를 각 군별로 400배율 시야에서 관찰하여 한 시야당 호산구수를 세고, 한 절편당 10시야의 평균을 산술하여 호산구수를 산출하였다.

면역조직화학적 염색
   Probe On slide(Fisher Scientific, Los Angeles, CA)에 부착된 파라핀절편을 xylene으로 탈파라핀하였고 알콜로 가수시킨 후 증류수로 세척하였다. 37°C에서 2% 과산화수소수로 10분간 처리하여 내인성 과산화효소반응을 억제시킨 후 pH 7.6의 Tris 완충액으로 3회 세척하였다. 비특이적인 염색을 없애기 위해 정상 말 혈청(Transduction Laboratories, Lexington, KY)과 37°C에서 20분간 처리하였다. 일차항체는 mouse antihuman iNOS monoclonal antibody(Transduction Laboratories, San Diego, CA)를 사용하였으며 희석비율 1：100으로 37°C에서 90분간 반응시키고 Tris 완충액으로 3회 세척하였다. 이차항체로는 biotin과 결합된 horse antimouse IgG(Transduction Laboratories, San Diego, CA)를 사용하여 37°C에서 20분간 반응시킨 후 Tris 완충액으로 3회 세척하였다. 발색을 위하여 streptavidin-peroxidase(Zymed Laboratories, San Francisco, CA)를 37°C에서 20분간 반응시키고 다시 3회 세척하였다. AEC(3-amino-9-ethyl carbarzole, Zymed Laboratories)로 발색을 유도하였으며 Mayer's hematoxyline으로 대조염색한 후 crystal mounting하여 광학현미경으로 관찰하였다. 염색할 때마다 음성대조군으로 항체대신 완충용액으로 반응시켰다. 현미경관찰시 iNOS의 발현정도를 측정하기 위하여 실험군에 대해 내용을 모르는 세 명의 실험자가 염색된 슬라이드를 검사하여 음성(0), 약양성(1), 중등도(2), 강양성(3)으로 구분하여 그 평균수치를 구하여 각 실험군의 발현정도를 비교하였다.

통  계

   실험군들의 각 데이터를 비교하기 위하여 Wilcoxon rank sum test를 시행하였으며 5% 유의수준에서 통계적 분석을 하였다.

결     과

비 증상

   TDI로 감작된 실험군에서 재채기, 수성비루, 킁킁거림 등을 관찰할 수 있었고 증상점수의 합은 평균 7.5±1.2점으로 대조군의 2.5±0.6점보다 많았다(p<0.05). 스테로이드 투여군은 증상의 평균이 3.2±0.9점으로 TDI 감작군보다 통계적으로 유의하게 감소하였다(p<0.05). 스테로이드 투여군과 대조군 간에는 통계적으로 유의한 차이는 없었다(p<0.05)(Table 2).

스테로이드의 투여가 비강점막의 호산구 침윤과 iNOS의 발현에 미치는 영향

   TDI 감작군은 전반적인 호산구의 조직 내 침윤을 보였으며 호산구는 주로 상피층과 기저막 아래 고유층에서 관찰되었고 점막부종, 혈관 확장 등의 소견이 관찰되었다(Fig. 2). TDI 감작군은 대조군보다 의미있게 호산구 수가 증가하였고 400배 현미경 시야에서 TDI 감작군의 호산구수는 평균 23.2±6.9개로써 대조군의 0.8±0.7개보다 많았다. 스테로이드 투여군에서는 호산구의 수가 10.2±4.1개로써 TDI 감작군보다 통계적으로 유의하게 감소하였다(Table 2).
   대조군에서 iNOS는 비점막 상피의 섬모세포와 비선의 분비세포에서 약한 양성 면역반응을 보였다. TDI 감작군에서 iNOS는 비점막 상피의 섬모 세포, 혈관 내피세포, 비선의 분비세포, 일부의 염증세포에서 강하게 발현이 나타났으며, 상피의 배상세포에서는 양성 면역반응을 보이지 않았다. 스테로이드 투여군은 TDI 감작군과 같은 부위에서 염색이 되었으나 TDI 감작군에 비해 iNOS의 발현정도가 미약하였다(Fig. 3). iNOS의 발현정도를 점수로 계산하여 비교해 본 결과 TDI 감작군에 비해 스테로이드 투여군이 통계적으로 유의하게 발현정도가 감소하였다(Fig. 4).

고     찰

   알레르기 비염환자에서 비강내 산화질소 농도가 정상인에 비하여 증가되어 있다는 사실은 많은 연구에서 밝혀진 바 있지만⁴⁾⁷⁾⁸⁾ 비강내 산화질소의 기원에 대하여는 아직 확실히 밝혀져 있지 않은 상태이다. Lundberg 등⁹⁾은 호기내 산화질소의 기원이 부비동 점막상피에 항시적으로 존재하는 iNOS의 활성에서 비롯하며, 비점막내의 상피세포에는 매우 미약한 NOS의 활성이 있을 뿐이라고 하였다. 그러나, 비점막의 상피세포에서도 면역조직화학적 염색법으로 NOS의 발현이 확인되었다.¹⁰⁾ 혈관내피세포 산화질소합성효소(endothelial NOS：eNOS)는 혈관내피세포, 상피세포에서 발현되며 염증반응에 의해 그 발현이 증가되지 않아 정상적인 항상성 유지에 기여하는 것으로 생각된다. iNOS는 염증세포, 상피세포, 혈관 내피세포, 선세포에서 발현되는데 정상 상태에서는 활성이 미약하나 염증상태에서는 그 발현이 증가된다.³⁾ 그러므로 알레르기 비염환자에서 증가되는 산화질소는 iNOS에서 기원한 것으로 추정된다.
   본 연구에서는 TDI를 이용하여 기니픽에서 알레르기 비염을 유발하였으며 TDI로 감작된 실험군은 대조군에 비해 비증상 점수와 비점막 조직에 침윤된 호산구수에서 유의한 차이가 있었다. TDI로 감작된 비점막에 iNOS에 대한 면역조직화학적 염색을 시행하여 실험동물군의 비점막에서 대조군의 비점막 보다 강한 양성 면역반응을 확인하였다. 알레르기 염증조직에서 iNOS 발현의 증가는 알레르기 반응에서 증가되어 있는 IL-1β와 TNF-α와 같은 사이토카인의 증가와 관계 있다고 알려져 있다.¹¹⁾
   알레르기 비염에서 증가된 산화질소의 기능에 대해서는 아직 확실히 밝혀진 바가 없지만 산화질소는 정상인의 비점막에서 점액섬모 수송기능을 향상시키고 염증 등에 의하여 발현이 촉진되는 경우 항바이러스작용과 정균작용이 있어 비강과 부비동의 국소적 방어체계에 관여한다고 알려져 있다. 또한 강력한 혈관확장제로서 혈장의 삼출을 일으켜 점막의 부종에 관여하며,¹²⁾ 과산화물(superoxide)과 결합하여 peroxynitrite를 만들어 조직 손상을 일으킨다.¹³⁾ 그리고 T세포의 기능에 영향을 주어 Th1세포의 증식을 억제하여 Th2세포의 증식을 유도함으로써 알레르기 발생기전에 기여한다고 한다.¹⁴⁾
   본 연구에서는 알레르기 비염을 유발한 기니픽에 스테로이드를 투여하여 iNOS 발현의 감소를 확인하였으며 이는 스테로이드가 산화질소를 감소시킨다는 기존의 연구 결과들과 일치한다.^4)15)16) iNOS는 cNOS와는 달리 스테로이드에 의해 발현이 억제되는데 Baraldi 등¹²⁾은 알레르기 비염환자의 산화질소가 스테로이드에 의해 억제되는 반면 정상인의 산화질소는 억제되지 않는 점을 들어 산화질소가 알레르기 비염환자에서는 iNOS에서, 정상인에서는 cNOS에서 기원한다고 하였다. 스테로이드는 iNOS 유전자의 전사에 필수적인 전사인자 NF κB(nuclear factor κB)를 억제함으로써 iNOS의 발현을 막는 것으로 알려져 있다.¹²⁾ 스테로이드가 호산구의 침윤을 억제하는 것은 잘 알려져 있는 사실이며¹⁷⁾ 본 연구에서 스테로이드 투여군이 TDI 감작군 보다 호산구 수의 유의한 차이를 보여 스테로이드의 호산구 억제작용을 알 수 있었다.
   이상의 결과로 알레르기에서의 증가된 산화질소는 iNOS의 발현증가에 의하며 스테로이드가 iNOS의 발현을 억제함으로써 산화질소의 농도를 감소시키는 것으로 생각된다. 즉 알레르기 비염의 치료에 있어서 스테로이드의 투여는 스테로이드가 갖는 많은 약리작용 외에도 iNOS의 발현을 억제함으로써 일부 효과를 갖는 것으로 사료된다.

결     론

   결론적으로 저자들은 알레르기 기니픽의 비점막에서 증가된 iNOS의 발현을 확인할 수 있었으며, 스테로이드의 비강 내 투여가 iNOS의 발현을 억제하는 것을 볼 수 있었다. 산화질소는 알레르기 비염의 발생에 있어서 중요한 역할을 한다고 생각되며 향후 알레르기 비염 치료의 새로운 시도로서 iNOS를 억제하는 방법들에 대한 연구가 진행되어야 할 것으로 생각된다.

1. Gaston B, Drazen JM, Loscalzo J, Stamler JS. The biology of nitrogen oxides in the airways. Am J Respir Crit Care Med 1994;149:538-51.

2. Garrelds IM, Van Amsterdam JG, Veld CG, Van Wijk RG, Zijlstra FJ. Nitric Oxide metabolites in nasal lavage fluid of patients with house dust mite allergy. Thorax 1995;50:275-9.

3. Furukawa K, Harrison DG, Saleh D, Shennib H, Chagnon FP, Giaid A. Expression of nitric oxide synthase in the human nasal mucosa. Am J Respir Crit Care Med 1996;153:847-50.

4. Kharitonov SA, Yates D, Robbins RA, Logan-Sinclair R, Shinebourne EA, Barnes PJ. Increased nitric oxide in exhaled air of asthmatic patients. Lancet 1994;343:133-5.

5. Tanaka K, Okamoto Y, Nagaya Y, Nishimura F, Takeoka A, Hanada S, et al. A nasal allergy model developed in the guinea pig by intranasal application of 2,4-toluene diisocyanate. Int Arch Allergy Appl Immunol 1988;85:392-7.

6. Abe Y, Ogino S, Irifune M, Imamura I, Liu YQ, Fukui H, et al. Histamine content, synthesis and degradation in nasal mucosa and lung of guinea-pigs treated with toluene diisocyanate (TDI). Clin Exp Allergy 1993;23:512-7.

7. Martin U, Bryden K, Devoy M, Howarth P. Increased levels of exhaled nitric oxide during nasal and oral breathing in subjects with seasonal rhinitis. J Allergy Clin Immunol 1996;97:768-72.

8. Arnal JF, Didier A, Rami J, M'Rini C, Charlet JP, Serrano E, et al. Nasal nitric oxide is increased in allergic rhinitis. Clin Exp Allergy 1997;27:358-62.

9. Lundberg JO, Szallasi TF, Weitzberg E, Rinder J, Lidholm J, Anggard A, et al. High nitric oxide production in human paranasal sinuses. Nature Medicine 1995;1:370-3.

10. Sawada T, Nishimura T, Saki M, Nagatsu I. Immunohistochemical examination of NOS and SOD in nasal mucosa. Acta Otolaryngol (Stockh) 1998;539:83-6.

11. Robbins RA, Barnes PJ, Springall DR, Warren JB, Kwon OJ, Buttery LD, et al. Expression of inducible nitric oxide synthase in human bronchial epithelial cells. Biochem Biophys Res Commun 1994;203:209-18.

12. Baraldi E, Azzolin NM, Carra S, Dario C, Marchesini L, Zacchello F. Effect of topical steroids on nasal nitric oxide production in children with perennial allergic rhinitis: a pilot study. Respir Med 1998;92:558-61.

13. Sato M, Fukuyama N, Sakai M, Nakazawa H. Increased nitric oxide in nasal lavage fluid and nitrotyrosine formation in nasal mucosa-indices for severe perennial nasal allergy. Clin Exp Immunol 1998;28:597-605.

14. Feder LS, Stelts D, Chapman RW, Manfra D, Crawley Y, Jones H, et al. Role of nitric oxide on eosinophilic lung inflammation in allergic mice. Am J Respir Cell Mol Biol 1997;17:436-42.

15. Yates DH, Kharitonov SA, Robbins RA, Thomas PS, Barnes PJ. Effect of a nitric oxide synthase inhibitor and a glucocorticosteroid on exhaled nitric oxide. Am J Respir Crit Care Med 1995;152:892-6.

16. Kharitonov SA, Rajakulasingam K, O'Connor B, Durham SR, Barnes PJ. Nasal nitric oxide is increased in patients with asthma and allergic rhinitis and may be modulated by nasal glucocorticoids. J Allergy Clin Immunol 1997;99:58-64.

17. Meltzer EO, Orgel HA, Rogenes PR, Field EA. Nasal cytology in patients with allergic rhinitis: Effects of intranasal fluticasone propionate. J Allergy Clin Immunol 1994;94:708-15.