| Expression of Inducible Nitric Oxide Synthase in Rat and Guinea PigRespiratory Epithelium after Capsaicin Treatment. |
| Byung Uk Song, Sea Young Jeon, Cheon Gyu Kim, Jong Pil Byun, Jung Jee Park, Dae Sik Oh |
1Department of Otolaryngology, Dongkang Hospital, Ulsan, Korea.
2Department of Otolaryngology, College of Medicine,Gyeongsang National University, Chinju, Korea. |
| apsaicin에 의한 흰쥐 및 기니픽 호흡기도 점막 상피세포내 Inducible Nitric Oxide Synthase의 발현 |
| 송병욱1 · 전시영2 · 김천규2 · 변종필2 · 박정제2 · 오대식1 |
| 울산동강병원 이비인후과1;경상대학교 의과대학 이비인후과학교실2; |
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| 주제어:
호흡기도점막ㆍi NOSㆍCapsaicinㆍNADPH-diaphoraseㆍSubastance P. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Nitric oxide (NO) production in the respiratory epithelium and the demonstration of inducible nitric oxide synthase in ciliated epithelium of the upper airway have recently been reported. The aim of this study was to investigate the expression of inducible nitric oxide synthase in the nasal epithelium after capsaicin treatment, which stimulates the substance P innervation.
MATERIALS AND METHODS:
In vivo treatment -Capsaicin (112 nM) was applied to the nasal cavities of the rat and guinea pig, and 30 nl of normal saline was applied for the control groups. After 2 hours, animals were sacrificed with cardiac perfusion of 4% paraformaldehyde and septal mucosa were removed. The 8 nm serial frozen tissue sections were made, and the expression of inducible nitric oxide synthase was determined using nicotinamide adenine diphosphate-diaphorase histochemistry. In vitro treatment- The nasal septum of the rats and the trachea of the guinea pigs were incubated in DMEM culture media with or without 112 nM capsaicin for experimental or control groups. After 0, 30 or 120 minutes of incubation, the tissues were fixed and processed for nicotinamide adenine diphosphate-diaphorase histochemistry.
RESULTS:
Both in vivo and in vitro studies demonstrated that the strong positive histochemical reactivity were observed in the respiratory epithelium of the rats and guinea pigs after capsaicin treatment compared to control groups.
CONCLUSION:
These data imply that capsaicin induces the expression of inducible nitric oxide synthase and that the substance P innervation of the nasal mucosa may have a protective role in the airway defense mechanism through nitric oxide production. |
| Keywords:
Nasal epitheliumㆍInducible Nitric oxide synthaseㆍCapsaicinㆍNADPH-diaphoraseㆍSubstance P |
서론
호흡기도는 점액섬모운동(mucociliary clearance), 상피폐쇄소대(epithelial tight junctions), 및 substance P (SP) 신경지배와 이에 연관된 신경반사 등에 의하여 흡인성 유해물질로부터 보호되고 있다. 따라서 호흡기도 점막은 흡인성 유해물질에 대한 일차적 방어기전이 이루어지는 곳이다.1)2) 호흡기도 점막상피는 기도평활근 이완물질(ED-RF, epithelium derived relaxing factor)을 분비한다고 추정되어 왔다.3) 최근 기니픽 기도 점막 상피에 대한 포타슘 유발 탈분극은 기도평활근의 이완을 초래하며, 점막상피층을 제거하거나 nitric oxide synthase(NOS) 길항제를 투여하였을 경우 평활근 이완이 소실됨이 관찰되어 점막상피층에서 생성되는 기도평활근 이완물질이 nitric oxide(NO)일 것이라고 보고하였다.4) 나아가 흰쥐와 인간의 호흡기도 점막의 섬모상피 세포층에서 inducible NOS( i NOS)의 존재가 면역조직화학적 방법으로 동정되었다5). 또한 공기중 NO의 농도를 직접 측정할 수 있게 됨에 따라, 사람의 호기중에 NO가 상당량 포함되어 있으며 특히 부비동내 농도가 아주 높아 NO는 주로 부비동 점막의 i NOS에 의해 생성된 것이라고 보고되었다.6) 따라서 호흡기도 점막상피세포는 i NOS에 의해 NO를 생산하며, 점막상피에서 생성된 NO는 기도평활근의 운동성과 기도점막의 혈관활동성에 대한 생리적 조절 뿐 아니라, free radical인 NO가 가진 높은 활성으로 병원체와 같은 유해물질을 비활성화 시킴으로서 호흡기도 점막의 방어기전에도 관여할 것이라고 추정된다.
호흡기도에서의 NO에 대한 지금까지의 연구는 NO가 신경전달물질로 관여하는 신경지배에 대하여 주로 이루어졌으며, 이 NO성 신경지배는 콜린성 신경지배와 함께 혈관, 분비선 및 상피하층에 주로 분포함이 잘 밝혀져 있다.1)7) 그러나 최근 인간의 호흡기도 점막상피에서 i NOS가 동정되고,5) 나아가 염증반응에 관여하는 여러 가지 싸이토카인들은 이 i NOS를 발현시킨다고 보고되었다.8)9) 따라서 호흡기도 점막상피에 존재하는 i NOS는 유해물질의 자극에 의해 NO를 생산하며, 점막상피에서 생성된 NO는 그 높은 활성으로 유해물질을 비활성화 시키고, 기도평활근의 운동성, 기도점막의 혈관활동성 및 선분비에 대한 조절을 통하여 유해물질에 의한 호흡기도점막의 염증반응을 조절하므로서 유해물질에 대한 호흡기도점막의 방어기전에 중요한 역할을 할 것이라고 추정된다. 따라서 호흡기도점막의 방어기전에 있어 NO의 역할은 호흡기도에서의 NO 작용기전에 대한 연구의 새로운 방향을 제시하고 있다.
SP는 지각신경계의 주된 신경전달물질 중 하나이다. 호흡기도에 분포하는 SP 신경지배는 호흡기도내로 침입한 유해 자극을 감수하고 이에 따른 재채기 및 기침반사로 기도내 유해물질을 배출한 뿐 아니라, 국소 축삭반사 기전에 의해 혈관투과성을 증가시키고 기도내 혈장의 삼출을 유도하여 유해물질에 대한 상피투과성을 감소시키므로 서 기도를 보호한다고 알려져 있다.2) 따라서 유해자극에 대한 호흡기도점막의 방어기전에 있어 호흡기도에 분포하는 SP 신경지배, 호흡기도 점막상피에 존재하는 i NOS 및 점액섬모운동간에 동시성의 유기적 상관관계가 있다고 추정된다. 따라서 SP 신경지배를 선택적으로 자극한 capsaicin은 호흡기도 점막상피에서 i NOS를 발현시켜 NO를 생성하고, 점막상피에서 생성된 NO는 그 높은 활성으로 유해물질을 비활성화 시키고, 기도평활근의 운동성, 기도점막의 혈관활동성 및 선분비에 대한 조절을 통하여 유해물질에 의한 호흡기도점막의 염증반응을 조절할 것이라고 생각된다.
본 연구의 목적은 capsaicin으로 흰쥐 및 기니픽 호흡기도점막의 SP 신경지배를 선택적으로 자극하고, 점막상피세포내 i NOS의 발현여부를 nicotinamide adenine diphosphate(NADPH)-diaphorase 조직화학염색법으로 확인하여, 호흡기도내 유해자극에 의한 점막상피세포내 i NOS의 발현여부를 밝히는 것이다.
대상 및 방법
In vivo 실험
실험동물로서 체중 250∼350g의 외견상 건강해 보이는 3 마리의 Sprague-Dawley계의 흰쥐와 기니픽을 사용하였다. 흰쥐와 기니픽에 ketamine hydrochloride(유한양행, 서울, 75 mg/kg)와 xylazine(한국바이엘, 서울, 10 mg/kg)의 혼합용액을 복강내 주사하여 전신마취하고 기관절개를 하였다. 실험군에서는 양측 비강에 112 μM capsaicin 30 μl씩을 주입하였고 대조군에는 양측 비강에 생리식염수 30 μl씩 주입하여 2시간 후, 전 흉벽을 절개하여 심장을 노출시켰다. 노출된 심장의 좌심실을 통하여 대동맥에 16게이지 침을 고정시킨 후 0.9% 생리식염수 300∼400 ml로 관류시키고 곧이어 4% paraformaldehyde 용액 400∼500 ml로 관류 고정시켰다. 비배부의 중앙에서 피부로부터 골막까지 약 2 cm 정도 수직 절개하여 비강을 노출시킨 후 비중격의 점막에 손상을 주지 않도록 주의하면서 비중격을 조심스럽게 박리한 후 3×4 mm의 크기로 절편을 취하였다. 전술한 방법으로 얻은 조직을 4% paraformaldehyde용액에 4℃에서 4시간동안 더 침습고정을 한 후 0.1 M 인산 완충액에 5분간 3회 세척하고, 4℃에서 25% sucrose 첨가 인산 완충용액에서 24시간 담궈두었다. 조직을 OCT compound에 포매, 동결시킨 후 -21℃ 동결박절기에서 8 μm 두께로 연속 냉동절편을 제작하여 gelatin을 처리한 슬라이드에 올린 후 보관하였다. 냉동절편을 실온에서 건조시켜 0.1 M 인산 완충용액에서 3분간, 5회 세척한 후 1mg/ml NADPH(Sigma, USA), 0.1 mg/ml nitroblue tetrazolium(NBT) (Sigma, SA), 0.2% triton X-100을 혼합한 기질액과 37℃에서 30분 동안 반응, 발색시키고 0.1 M 인산 완충용액으로 3분간, 3회 세척한 후 methyl-green 용액으로 30분간 대조염색하고 증류수에 담궈낸 후 glycerol gelatin으로 포매하여 광학현미경하에 관찰하였다.
In vitro 실험
실 험동물로서 체중 250∼350 g의 외견상 건강해 보이는 3 마리의 Sprague-Dawley계의 흰쥐와 기니픽을 사용하였다. 흰쥐 및 기니픽에 ketamine hydrochloride(유한양행, 서울, 75 mg/kg)와 xylazine(한국바이엘, 서울, 10 mg/ kg)의 혼합용액을 복강내 주사하여 전신마취를 하였다. 전 흉벽을 절개하여 심장을 노출시켜 심장의 좌심실을 통하여 대동맥에 16게이지 침을 고정시킨 후 0.9% 생리식염수 300∼400 ml로 관류시키고 흉벽의 절개부위를 상부로 확장하여 기관지를 노출시킨 후 기관지를 얻고, 배부의 중앙에서 피부로부터 골막까지 약 2 cm 정도 수직 절개하여 비강을 노출시킨 후 비중격의 점막에 손상을 주지 않도록 주의하면서 비중격을 조심스럽게 박리한 후 각각 3×4 mm의 크기로 4개씩의 절편을 취하였다. 전술한 방법으로 얻은 조직을 실험군에는 capsaicin 투여용액 (112 μM capsaicin, DMEM：F12, 10% fetal bovine serum, 50 IU/ml penicillin, 50 μ/ml streptomycin)에서 30분과 120분 동안 조직배양하고, 대조군은 배양액만으로 곧바로(0분) 그리고 120분 동안 배양하여 4% paraformaldehyde용액에 4℃에서 4 시간동안 침습고정을 한 후 0.1 M 인산 완충액에 5분간 3회 세척하고, 4℃에서 25% sucrose 첨가 인산 완충용액에서 24시간 담궈두었다. 조직을 OCT compound에 포매, 동결시킨 후 -21℃ 동결박절기에서 8 μm 두께로 연속 냉동절편을 제작하여 gelatin을 처리한 슬라이드에 홀린 후 보관하였다. 냉동절편을 실온에서 건조시켜 0.1 M 인산 완충용액에서 3분간, 5회 세척한 후 1mg/ml NA-DPH (Sigma, USA), 0.1 mg/ml NBT(Sigma, USA), 0.2% triton X-100을 혼합한 기질액과 37℃에서 30분 동안 반응, 발색시키고 0.1 M 인산 완충용액으로 3분간, 3회 세척한 후 methyl-green 용액으로 30분간 대조염색하고 증류수에 담궈낸 후 glycerol gelatin으로 포매하여 광학현미경하에 관찰하였다.
결과
In vivo 실험
흰쥐
흰쥐의 비강에 생리식염수 30 μl씩을 점적한 대조군(Fig. 1A)과 112 μM capsaicin 용액 30 μl씩을 점적한 실험군(Fig. 1B)에서 2시간 후 비점막을 채취하여 NADPH-diaphorase 조직화학염색을 하였을 때 실험군에서 비점막 상피세포층에서 대조군에 비하여 현저한 NADPH-diaphorase 양성반응을 보였다(Fig. 1B).
기니픽
기니픽의 비강에 생리식염수 30 μl씩을 점적한 대조군(Fig. 2A)과 112 μM capsaicin 용액 30 μl씩을 점적한 실험군(Fig. 2B)에서 2시간 후 비점막을 채취하여 NADPH -diaphorase 조직화학염색을 하였을 때 실험군에서 비점막 상피세포층과 점막하 분비선에서 대조군에 비하여 현저한 NADPH-diaphorase 양성반응을 보였다(Fig. 2B).
In Vitro 실험
흰쥐
흰쥐의 비점막을 capsaicin이 포함되어 있지 않은 배양액에서 곧바로(0분) 꺼내어 고정한 대조군(Fig. 3A)에 비하여 112 μM capsaicin을 함유한 배양액에서 30분 동안 배양한 실험군(Fig. 3B)에서 점막상피층과 점막하 분비선에서 보다 강한 NADPH-diaphorase 양성반응을 관찰할 수 있었다. 또한 120분 동안 capsaicin을 함유하지 않은 배양액에서 배양한 대조군(Fig. 3C)에 비하여 112 μM capsaicin을 함유한 배양액에서 120분 동안 배양된 실험군(Fig. 3D)은 점막상피층과 점막하 분비선에서 NADPH- diaphorase 조직화학염색 양성반응을 보였다.
기니픽
기니픽 기관지를 capsaicin을 함유하지 않은 배양액에서 곧바로(0분) 꺼내어 고정한 대조군(Fig. 4A)에 비하여 112 μM capsaicin을 함유한 배양액에서 30분 동안 배양한 실험군(Fig. 4B)에서 점막상피층과 기관지 평활근에서 보다 강한 NADPH-diaphorase 양성반응을 관찰할 수 있었다. 또한 120분 동안 capsaicin을 함유하지 않은 배양액에서 배양한 대조군(Fig. 4C)에 비하여 112 μM capsaicin을 함유한 배양액에서 120분 동안 배양된 실험군(Fig. 4D)은 점막상피층과 기관지 평활근에서 NADPH-diaphorase 조직화학염색 양성반응을 보였다.
고찰
NO는 강력한 혈관확장물질인 Endothelium derived relaxing factor로 그 존재가 처음 알려졌으며, 혈관 내피세포에서 생성되어 국소 혈관운동성을 조절하고, 중추 및 말초신경계의 주요 신경전달물질로 존재하며, 대식세포내에서 생성되어 병원체나 종양세포에 대한 생체 방어기전에 관여한 등, 다양한 생리적 조절기능을 가진 활성물질로 밝혀졌다.5) 현재 생체내에서 NO의 작용기전에 대한 많은 연구가 여러 장기별로 활발히 이루어지고 있어 NO와 관련된 연구는 의과학의 여러 연구분야 중 가장 새롭고 활발한 연구분야이다.
호흡기도에서의 NO에 대한 지금까지의 연구는 NO가 신경전달물질로 관여하는 신경지배에 대한 형태학적 연구가 주로 이루어졌다.1)7) 그러나 최근, 호흡기도점막의 섬모상피 세포층에서 i NOS의 존재가 면역조직화학적 방법으로 동정되었고,10) 공기중 NO의 농도를 직접 측정할 수 있게 됨에 따라, 호기중에 NO가 상당량 포함되어 있음이 관찰되었다. 또한 염증반응에 관여하는 여러 가지 싸이토카인들은 이 i NOS를 발현시킨다고 보고되었다.5) 따라서 호흡기도 점막상피에 존재하는 i NOS는 유해물질의 자극에 의해 NO를 생산하며, 점막상피에서 생성된 NO는 그 높은 활성으로 유해물질을 비활성화 시키고, 기도평활근의 운동성, 기도점막의 혈관활동성 및 선분비에 대한 조절을 통하여 유해물질에 의한 호흡기도점막의 염증반응을 조절하므로 써 유해물질에 대한 호흡기도점막의 방어기전에 중요한 역할을 할 것이라고 추정된다. 따라서 호흡기도점막의 방어기전에 있어 NO의 역할 규명은 호흡기도에서의 NO 작용기전에 대한 연구의 새로운 방향을 제시하고 있다고 생각된다.
본 연구는 capsaicin으로 흰쥐와 기니픽 호흡기도점막의 SP 신경지배를 선택적으로 자극하고, 이에 따른 점막상피세포내 i NOS의 발현여부를 NADPH-diaphorase 조직화학염색법으로 확인하였다. 이는 호흡기도점막의 방어기전에 있어 SP 신경지배와 점막상피세포내 i NOS의 발현이 서로 유기적인 상관관계를 갖고 있으며, 호흡기도 방어기전에 있어 NO의 역할은 호흡기도내로 침입한 유해물질은 SP 신경지배를 자극할 뿐 아니라 호흡기도 점막상피에서 i NOS를 발현시키고, 점막상피에서 생성된 NO는 그 높은 활성으로 유해물질을 비활성화 시키며, 점액섬모운동을 촉진시켜 유해물질의 배출을 도보하고, 기도평활근의 운동성, 기도점막의 혈관활동성 및 선분비에 대한 조절을 통하여 유해물질에 의한 호흡기도점막의 염증반응을 조절한다고 생각된다.
시간에 따른 i NOS 발현을 동정하기 위하여 in vitro study를 시행하였다. Kolios 등11)은 인간 세포배양에서 interleukine-1 a (IL-1 a )와 interferon(IFN)의 혼합물을 투여한 in vitro 실험에서 투여 후 6시간에 i NOS mRNA의 발현을 관찰하여 i NOS mRNA의 발현에 시간 의존성이 있음을 보고하였다. 또 Nakayama 등12)은 배양된 쥐의 폐동맥 평활근에 lipopolysaccharide(LPS) endotoxin, IL-1 a , IFN- g 및 Tumor necrosis factor- a 를 혼합 투여한 in vitro 실험에서 투여 후 4시간에 i NOS mRNA의 발현을 관찰하고 시간 의존성이 있음을 보고하였다. 본 실험에서 i NOS의 발현은 30분에 관찰되었다. 문헌들과 비교하여 볼 때 발현시간이 현저히 짧았으며, 이는 자극물질과 반응장기의 차이가 있고, 또한 capsaicin은 유해자극에 대하여 가장 먼저 반응하는 SP 신경지배의 선택적 자극물질인만큼 i NOS의 발현도 그만큼 빨리 발현되었다고 생각된다.
NADPH-diaphorase 조직화학검사법은 i NOS를 동정함에 있어 비특이적 방법이다. 따라서 NADPH-diaphorase 양성반응이 곧 i NOS의 발현을 의미하지는 않는다. 그러나, Furukawa 등13)은 상피에서의 NADPH-diaphorase 양성반응이 i NOS에 의한 것이라고 실험에서 밝혔고, 본 연구에서도 NADPH-diaphorase 양성반응이 i NOS에 의한 것이라고 추정하였다. 향후 i NOS에 대한 특이항체를 이용한 면역조직화학적 방법이나, i NOS의 mRNA의 발현을 분자생물학적 방법으로 동정함이 필요할 것으로 생각된다.
향후 본 연구의 결과는 SP 신경지배와 점막상피세포내 i NOS와의 유기적인 상관관계를 밝히고, 호흡기도점막의 방어기전에 있어 점막상피세포내 i NOS의 역할을 규명하여 천식, 비염 및 비점막 과민반응과 같은 호흡기 질환의 병인을 밝히고, 나아가 이들 질환의 진단 및 치료제 개발에 필요한 기초 자료로 활용될 수 있다고 생각된다. 즉, 호기내 NO의 농도를 측정하거나 기도 점막상피세포내 i NOS의 발현 여부와 그 정도에 따라 호흡기 질환의 진단에 응용할 수 있으며, NO 생성물질이나 i NOS 길항제 등을 이용하여 호흡기 질환의 치료제 개발에 응용할 수 있는 형태학적 단서를 제공할 수 있다고 생각된다.
결론
In vivo 실험에서 비점막에 점적한 capsaicin은 호흡 점막상피에서 현저한 i NOS를 발현을 보였다. 또한, in vitro 실험에서 capsaicin을 함유한 배양액에서 배양된 비점막과 기관지는 점막상피층과 점막하 분비선 및 기도평활근에서 시간의 경과에 따른 i NOS의 발현을 보였다. 그러나, 실험동물에 따른 결과의 차이는 특별히 발견할 수 없었다.
호흡기도점막의 방어기전에 있어 SP 신경지배와 호흡기도 점막상피세포내 존재하는 i NOS는 상호 동시성의 유기적 상관관계로 조절된다고 생각된다.
REFERENCES
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