서     론

   Bekesy가 정상 청음에서 기저막(basilar membrane) 진동의 역할을 처음 보고한 이래,¹⁾ 와우막구조의 기계적운동의 측정은 청각기능을 이해하는 도구로 사용되어 왔다. 소리의 전달은 내이액 속에 떠있는 와우막구조의 진동을 통하여 이루어진다. 최근 기니픽의 첨부와우(cochlear apical turn)의 관찰에서 내이망상판(reticular lamina)이 기저막에 대하여 negative feedback을 한다는 보고가 있다.²⁾ Negative feedback은 기저막의 운동을 제한하여 진동을 작게 한다. 기니픽을 죽이면 와우 유모세포(sensory hair cell)의 운동 증폭 역할이 감소되고 이는 다시 negative feedback도 감소시켜서 그 결과 기저막의 운동이 크게 상승한다.²⁾ 저자들은 와우 유모세포를 선택적으로 파괴하는 cisplatin을 이용하여 유모세포의 역할을 감소시켜서 생기는 현상을 해석하여 결론적으로 유모세포가 기저막에 대하여 negative feedback을 행사함을 생체 기니픽에서 증명하고자 한다.
   Cisplatin은 현재 항암화학요법에 있어 가장 중요한 약제의 하나로 고용량의 cisplatin은 강력한 이독성 약제로 알려져 왔다. Cisplatin에 의한 청력 손상은 투여 용량이 증가함에 따라 거의 모든 주파수 영역에 영향을 미친다.³⁾ Cisplatin에 의해 유발된 형태학적 변화는 외유모세포(outer hair cell)와 지지세포들에 국한된다고 알려졌으나⁴⁾ 부분적으로는 혈관조(stria vascularis)의 변화에 의해 유발된다는 증거도 있다.⁵⁾⁶⁾ 와우 전위에 있어서, cisplatin은 compound action potential, cochlear microphonics와 summating potential을 감소시킨다.⁷⁾
   이 연구의 목적은 cisplatin의 와우 막구조의 미세 진동운동에 미치는 영향을 측정하고 이를 통해 청음과정에서의 외유모세포의 역할을 조명하고자 한다.

재료 및 방법

실험동물과 진동 측정기구의 준비

   체중이 200~350 g 범위인 11마리의 유색 기니픽를 사용하였다. 기니픽은 케타민과 xylazine을 각각 87 mg/kg, 13 mg/kg을 복강내에 주사하였다. 좌측 측두와(temporal bulla)를 노출시키는 방법은 Hao와 Khanna에 의해 기술되었다.⁸⁾
   측정기구에 기니픽을 고정한 다음 slit confocal microscope으로 와우를 관찰하였다.⁹⁾ 영상을 캡처(Dage MTI CCD 72)하여 비디오 모니터(Sony PVM 1354Q)로 보낸다. 비디오 영상으로 내이망상판(reticular lamina)의 각각의 세포를 명확하게 구별되어 계속 한자리에서 특정 세포의 변화를 추적할 수 있다. 내이의 각 세포단위의 움직임은 incident light confocal heterodyne interferometer를 사용하여 진동 운동을 측정하였다. 이것은 매우 낮은 광량에서 진동의 민감한 측정을 위해 개발되었다.¹⁰⁾ Interferometry의 레이저 광선의 촛점 크기는 약 7 μm였고, 광학적 절단 깊이(optical sectioning depth)는 9 μm였다. 이는 측정에 사용된 laser interferometer가 단일 세포의 크기가 10 μm 이상일 때, 세포 하나의 진동을 측정할 수 있다는 것을 의미하여 외유모세포와 내이 지지세포의 경우 단일세포의 진동을 관찰할 수 있었다.¹¹⁾ Microscope과 interferometer는 같은 대물렌즈를 공유하고 따라서 촛점이 한 위치에 고정된다. 초점은 X, Y, Z 의 세 개의 서로 직각인 축 운동과 수평 / 수직 회전을 하는 미세위치 고정장치를 가지고 동물을 움직이면서 선택하였다. 미세위치 고정장치는 1 μm의 정밀도로 동물을 삼차원적 좌표에 위치시킬 수 있게 하였다.¹²⁾¹³⁾
   2-채널의 Digital/Analog(D/A), Analog/Digital(A/D) 변환기를 이용한 16-bit 해상도의 Digital Signal Processor 장치를 이용하여 신호를 생성하고, 반응을 측정하였다.¹⁴⁾ 음향 장치의 상세한 것들은 이미 기술된 바 있다.¹⁵⁾ 이번 연구에서는 D/A와 A/D 변환기의 sampling rate은 20 ks/s(50 μsec)였다. 두 채널의 anti-aliasing filters의 cut-off 주파수는 10 kHz로 맞추었다. Samples은 1024 bins에 저장하였고, 50회 평균하였다. 와우 반응을 측정하기 위해 90 dB SPL의 음압을 가진 sinusoidal signals을 이용하였다. 매 음자극마다 진동의 측정은 60에서 3,000 Hz까지 주파수를 올리면서 모두 48개의 다른 주파수에서 진동을 수집하였으며 이 하나의 완전한 과정(run)은 약 2분이 소요되었다.

실험방법

   Reissner 막과 혈관조를 손상시키지 않고 첨단회전의 1/3을 노출시킨 후, 동물을 음차폐 부스로 옮겨 동물의 머리를 미세위치고정 장치에 고정한다. 노출된 와우 첨부는 실린더 모양의 3.5 mm 길이의 부드러운 고무관을 이용하여 slit-confocal microscope의 원추형 대물렌즈(IRI)와 광학적으로 일치시켜 연결한다. 고무관은 조직배양매체(minimum essential medium, Gibco)로 채우고 새어나지 않도록 장치하였다. 한편 우측 외경정맥에 cisplatin 투입을 위한 정맥 주입기기를 연결하였다.
   진동운동의 측정시에는 와우의 한 부위에서 한 과정(run)을 마친 후에, 측정하는 레이저 광선을 다음 위치로 옮기고, 동일한 세트의 측정을 반복한다. 측정위치는 내이망상판을 따라 행하고 이 실험에서는 외 Hensen 세포를 측정하고 그보다 약 130 μm 아래쪽에 위치한 기저막(basilar membrane)을 측정하였다. Cisplatin(16 mg/kg)을 우측 경정맥을 통해 주사하였다. 11마리 중 2마리는 2배 용량의 cisplatin을 투여하였다. 주사 전후에 동일한 경로를 따라 측정을 반복하였다. 한편 대조군 조사를 위해 같은 용량의 식염수도 투여하였다.
   The Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC) of Heath Sciences Division of Columbia University에서 이번 연구에서 보고된 동물의 관리와 사용을 승인하였다.

결     과

   약물과 같은 용량의 생리식염수의 투입은 와우의 진동운동에 아무 영향이 없다. Cisplatin을 투여하면, 약 40분 후 기저막의 진동 진폭이 증가하기 시작하며 Hensen 세포의 진동 감소가 이어서 일어난다. CF 주파수에서 기저막의 속도는 cisplatin 투여후 40분에서 50분 사이에 가파른 경사로 증가한다. 그리고 이후 1시간 동안 점진적으로 증가한다.
   외 Hensen 세포와 기저막의 진폭(vibration amplitude)는 meters/u bar로 표현되며 Fig. 1A는 cisplatin 투여 전후로 진폭을 측정한 Fig.이다. Hensen 세포의 동조곡선(tuning curve)은 두 첨부(peak)를 가져 일차 첨부(characteristic frequency, CF)는 280 Hz이며 이차 첨부는 480 Hz에서 관찰된다. Cisplatin의 투여로 Hensen세포의 진폭은 감소한다. 진폭의 감소는 200~500 Hz의 주파수에서는 2.25배로 감소하나 650 Hz 이상에서는 감소 폭이 적다. 한편 200 Hz 이하에서는 저주파수로 갈수록 감소의 정도도 적다. 일차첨부와 이차첨부의 진폭의 비율(A1/A2)는 약물 투여이전과 이후에 각각 1.59와 1.22이다.
   동조곡선의 Q_{10 dB}는 20 Log {f₀/(f₂­f₁)}로 정의되며 f 0는 일차첨부의 주파수이며 f₂와 f₁은 반응곡선의 진폭이 10 dB 감소하는 위치의 고, 저 주파수를 말한다. Hensen 세포의 Q_{10 db}는 cisplatin 투여 전후 각각 0.58, 0.51이다. 그러므로 cisplatin은 동조곡선의 동조 정도(sharpness)를 감소시킨다.
   기저막의 운동은 Hensen 세포에 비해 매우 낮다. 일차 첨부(CF) 주변에서는 기저막의 진동은 Hensen 세포에 비해 약 300분의 1에 해당된다. 기저막의 운동은 동조가 거의 안된 편평한 반응이 보인다. Cisplatin의 투여는 진폭을 20배 이상의 상승시키고 동조양상도 점차 강화되어 Hensen 세포와 비슷한 동조곡선을 보인다. 한편 주파수 100 Hz이하와 700 Hz이상에서는 기저막운동이 약간 감소한다. Hensen세포와 기저막의 진폭비의 cisplatin 투여 전후의 변화는 300에서 6.5로 변화한다(Fig. 1A).
   Fig. 1B는 Hensen세포와 기저막의 phase 곡선이다. 이 논문에서의 phase angle은 고막에 대한 음압의 phase를 말한다. Phase 곡선은 주파수 650 Hz이하에서는 급경사각을 가지고 그 이상에서는 완경사각을 갖는다. Hensen세포에서 급경사부의 phase angle은 각각 1.33/Hz, 1.11/Hz, 1.96/Hz이다. 완경사부는 각기 0.168/Hz. 0.074/Hz이다. Cisplatin의 투여는 Hensen 세포의 급경사부와 완경사부 phase angle이 다같이 약간 감소하며 이런 변화는 기저막에서도 같다.
   약물투여 이전의 Hensen 세포의 6개의 주파수에서의 속도시간곡선(velocity-time waveform)의 FFT's가 Fig. 2a이다. 반응의 nonlinearity는 CF(280 Hz) 상하의 주파수에서 많이 나타나는 harmonics의 출현으로 특징된다. 주파수 158 Hz에서는 약 26개의 스팩트럼이 관찰된다(Fig. 2a).
   Fig. 2b는 같은 Hensen세포에서 cisplatin 투여이후의 결과이다. 약물의 투입에도 불구하고 harmonics 스팩트럼의 변화는 없으며 속도진폭(velocity amplitude)의 약한 감소는 반응의 기본 진폭의 감소로 인한 결과이다.
   Fig. 3a는 약물투여 이전의 Hensen 세포의 Lissajous pattern을 보여준다. Y축은 측정된 속도(mm/sec)이며 X축은 측정된 속도의 fundamental component를 나타낸다. 주파수 98과 158 Hz이외에서는 Lissajous pattern은 기본적으로 대칭적인 직선으로 나타나며 고주파수 영역에서 oscillations을 보인다. 이런 oscillations은 CF 주변인 256 Hz에서 가장 높다(Fig. 3a).
   Cisplatin 투여후 Lissajous pattern의 변화는 기본 형태의 변화는 미미하고 단지 속도진폭의 크기는 2배로 감소한다(Fig. 3b). 고주파수대의 oscillations도 거의 없어진다.
   약물투여 이전의 기저막의 6개의 주파수에서의 속도시간곡선(velocity-time waveform)의 FFT's가 Fig. 4a이다. CF와 harmonics의 많은 스팩트럼이 관찰된다. 기저막에서는 CF에서의 속도진폭이 harmonics에 비해 상대적으로 낮다(98 Hz는 예외이다). 이는 기저막에 상응하는 Hensen세포의 반응과는 다르다. Hensen세포에서는 CF에서의 속도진폭은 harmonics에 비해 훨씬 높다(Fig. 4a).
   Cisplatin 투여후 기저막의 변화는 Fig. 4b에서와 같다. CF영역에서의 속도진폭의 증가는 거의 10배가 될 정도로 강하게 증가한 반면 harmonics에서는 거의 변화가 없다(Fig. 4b).

고     찰

   Khanna와 Hao는 Q1_{0 dB}와(A₁/A₂) 비율이 내이의 건강도를 말하는 지표라고 발표했다.¹⁶⁾ Q_{10 db}이 0.5 이하이거나(A1/A2) 비율이 1이하가 되면 건강하지 못한 와우라고 할 수 있다. Cisplatin은 Q_{10 db}을 0.58에서 0.51로 변화시키고(A₁/A₂) 비율을 1.59에서 1.22로 변화시켜서 내이 진동운동의 관점에서 이독성을 나타낸다.
   Cisplatin은 외유모세포를 선택적으로 파괴하여 그 결과 compound action potential, cochlear microphonics, summating potential 등을 감소시킨다.⁷⁾ 대개 cisplatin 이독성은 즉각적이고 영구적이며 용량에 따라 비례한다.¹⁷⁾ 형태적으로는 외유모세포의 세포내 공포(vacuoles)의 형성과 stereocilia의 소실 등이 보인다.⁴⁾ 최근 cisplatin 주사후 1시간 이내에 전자현미경적으로 모세혈관 기저막과 혈관조의 변성이 보고된다.⁶⁾ 본 연구에서는 cisplatin 정맥 투여후 40분후에 기저막의 진폭변화를 시작으로 비가역적인 진동운동의 변화를 관찰하였다. Hensen 세포의 진폭변화는 내이미세망(reticular lamina)의 운동을 반영하는 것으로 이 운동의 감소는 청력의 감퇴를 의미한다. Cisplatin의 이독성은 즉각적이고 독성용량의 개체차이가 크므로,³⁾⁴⁾ 임상적으로 약제의 이용시에 동시적인 청력의 모니터링의 의의를 강조할 수 있다.
   이 논문에 발표한 대표적인 실험결과에서 cisplatin은 CF 주파수에서 Hensen 세포의 진폭을 2.25배 감소시키나 기저막에 대해서는 오히려 진폭을 20배이상 증가시키고 동조곡선을 더욱더 예민하게 동조하게 한다(Fig. 1A). 이러한 결과는 기니픽을 죽이고 Hensen 세포와 기저막의 진폭을 측정하여 살아있을 때와 비교한 경우와 비슷하다.²⁾
   약물투여후 Hensen세포의 기계적 운동의 변화는 진폭이 감소하고 CF주변의 동조가 둔해진다. 반면 기저막의 진폭은 증가하고 동조도 예민해 진다. 이 때의 기저막의 시간곡선의 FFT's는 많은 스팩트럼을 가지며 특히 CF에서의 속도진폭이 harmonics에 비해 크게 상승한다(Fig. 4b). 약물투여 이전의 기저막의 운동은 CF에서의 기본진폭이 harmonics보다 낮아서 거의 편평하게 보인다(Fig. 4a). 그러므로 cisplatin의 투여는 기저막의 CF에서의 기본진폭을 크게 상승시킨다(Fig. 4b).
   Hensen 세포에서의 진폭의 감소는 기저막의 증가에 비해 아주 적다. Cisplatin의 투여는 외유모세포의 능동적인 반응의 저하를 의미한다. 기니픽을 죽인 후의 실험결과도 본 실험과 같이 시간의 경과에 따라 내이망상판의 운동 진폭이 감소하며 반면 기저막의 진폭은 크게 상승한다.²⁾ 이 들 두 다른 실험의 공통점은 외유모세포의 능동적인 amplification의 시간에 따른 감소라고 할 수 있다. 그러므로 두 개의 실험 결과는 다같이 기니픽 와우의 첨부에서는 외유모세포의 amplification이 존재하며 기저막에 대하여서는 negative feedback이 존재하는 강한 증거라 할 수 있다.
   Phase slope의 분석으로 급경사부의 감소, 완경사부의 증가 그리고 경사부의 분절(segments)의 증가 등은 와우기능의 감소와 연관되어 있다.¹⁶⁾ Cisplatin의 phase slope에 대한 변화는 와우 기능을 전반적으로 감소시킨다는 점에 일치한다. 그러므로 진폭과 phase의 변화가 모두 외유모세포의 손상이 amplification을 감소시킨다는 개념을 입증한다.
   본 연구의 새로운 발견은 harmonics의 진폭은 cisplatin에 영향을 받지 않는다는 점이다(Figs. 2 and 4). Harmonics의 진폭의 소폭 감소는 CF에서의 기본진폭의 감소에 의한 영향의 반영이다. 이 소견은 Lissajous pattern의 분석에서도 동일하다(Fig. 3). 그러므로 cisplatin을 투여한 후 단기간의 관찰에서는 nonlinearity를 유지하는 기전은 파괴되지 않음을 시사한다. 외유모세포의 손상은 기저막 진폭의 대폭 상승으로 분명하므로 nonlinearity를 유지하는 기전은 내이망상판이후의 어느 부분에서 일어날 것을 시사한다. 이런 nonlinearity는 stereocilia bundles에서 일으날 것으로 시사된다.¹⁸⁾ Stereocilia bundles은 비대칭적이며 내이망상판에 밀착 접속되어 있어서 내이망상판의 진동을 측정시에 stereocilia bundles에 의한 nonlinearity가 반영되어 함께 측정되는 것으로 해석할 수 있다.
   Hensen 세포 속도의 Lissajous pattern에서 속도의 양 첨점에서 oscillations을 관찰할 수 있다(Fig. 3a. 256 Hz). 이런 oscillations은 CF에서의 기본진폭이나 harmonics에 동조되어 나타나지 않으며 자극에 따라 고정되어 나타나지도 않는다. 이러한 oscillations은 cisplatin에 의해 영향을 받아 거의 없어진다(Fig. 3b).

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