Dose-response Relationship of Morphologic Changes by Cisplatin and Radiation in Guinea Pig Cochleas.

Byun, Sung Wan; Kim, Chun Dong; Chung, Jong Woo; Kim, Chong Sun

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 41(6); 1998 > Article

Original Article

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1998;41(6): 712-718.

Dose-response Relationship of Morphologic Changes by Cisplatin and Radiation in Guinea Pig Cochleas.

Sung Wan Byun, Chun Dong Kim, Jong Woo Chung, Chong Sun Kim

¹Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Seoul National University College of Medicine, Seoul, Korea. chongkim@plaza.snu.ac.kr
²Department of Otolaryngology, College of Medicine, Ewha Womans University, Seoul, Korea.
³Department of Otolaryngology, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, Seoul, Korea.

기니픽 와우에서의 Cisplatin과 방사선에 의한 형태학적 변화의 용량-반응 관계

변성완² · 김춘동² · 정종우³ · 김종선¹

서울대학교 의과대학 이비인후과학교실1;이화여자대학교 의과대학 이비인후과학교실2;울산대학교 의과대학 서울중앙병원 이비인후과학교실3;

주제어: Cisplatinㆍ방사선ㆍ이독성ㆍ주사전자현미경ㆍ기니픽.

ABSTRACT

BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Cisplatin or radiation have been widely used in the treatment of patients with head and neck cancers. However, their adverse effects such as ototoxicity and nephrotoxicity are serious considerations. This study was aimed to establish a dose-dependent response in an animal model, with the hope of contributing to research for prevention of ototoxicity in cancer patients treated with radiation or chemotherapy. MATERIAL AND METHODS: Three different doses (4, 8, 12 mg/kg) of intraperitoneal cisplatin and radiation (17, 23, 33 Gy) were administered to guinea pigs.
RESULTS:
After 8 days, the temporal bones were prepared for scanning electron microscopic examination. The cochlear hair cells, especially outer hair cells in the third row, were severely damaged in the cisplatin groups and irradiation groups and these damages were related to the dose administered. The main abnormalities were the deletion or distortion of stereocilia of the hair cells and the loss of stiffness.
CONCLUSION:
A dose-dependent response relationship established in this study will provide as a useful reference for other researches for the prevention of ototoxicity by cisplatin and radiation.

Keywords: CisplatinㆍRadiationㆍOtotoxicityㆍScanning electron microscopeㆍGuinea pig

서론 두경부암은 타장기에 발생한 종양에 비하여 국소성 경향이 높고 원격전이율이 적어 수술과 방사선 치료가 주 치료 방법으로 시행되어 왔으나, 최근에는 암환자의 삶의 질(quality of life) 측면이 강조되면서 치료로 인한 기능 및 미용 장애를 극소화하면서 근치율을 향상시키는 항암화학요법 및 방사선 치료의 역할이 더욱 높아지고 있다. 이렇게 두경부에 발생하는 악성종양의 치료에 방사선 치료 및 항암화학요법의 도입으로 두경부 악성종양 환자들의 생존율은 현저한 증가를 가져온 반면 치료후 그 부작용의 하나로서 난청이 심각한 문제로 대두되고 있다. 이독성 약물이나 방사선 조사에 대해 인체를 이용한 형태학적인 연구는 불가능하여 실험동물에 의한 실험으로 이를 대신할 수밖에 없는데 이러한 실험동물은 인체와 해부생리학적 유사성이 있어야 하며, 특히 전자현미경을 이용한 미세구조적 연구를 진행할 때 골미로가 얇아 내이조직에 쉽게 접근할 수 있어야 한다. 이러한 연구의 실험동물로는 백서, 기니픽(guinea pig), 친칠라(chinchilla), 고양이등이 많이 이용되고 있는데, 특히 기니픽의 와우는 중이강내로 돌출되어있고 골미로가 비교적 얇아서 내이의 미세구조의 연구에 많이 이용되고 있다. 또한 전자현미경 검사를 통하여 많은 정보를 얻을 수 있는데, 주사전자현미경 검사는 와우 유모세포(hair cell)의 손상 유무를 쉽게 관찰할 수 있을 뿐 아니라 내외유모세포간 또는 외유모세포의 각 열간 그리고 와우 각 회전간의 손상정도를 비교할 수 있는 장점이 있다. 기니픽 와우에 대한 조직병리학적인 변화에 대해서는 많은 보고가 있었지만 정량화 및 통계적인 검증에 대한 것은 거의 없다. 본 연구에서는 동물 실험을 통해 이독성을 일으키는 적절한 cisplatin 및 방사선의 투여량을 결정하여, cisplatin 및 방사선에 의한 이독성을 가지는 동물 모델에서의 용량-반웅 관계의 확립을 목표로 하였다. 재료 및 방법 재료 고막 소견이 정상이고, 이개 반사가 양성인 흰색 기니픽 84마리(체중 350∼600 g)를 이용하였다. 기니픽 36마리는 cisplatin 투여군으로, 다른 36마리는 방사선 조사군으로, 나머지 12마리는 대조군으로 설정하였다. Cisplatin의 투여 36마리의 기니픽(cisplatin 투여군)에 sodium pentobarbital(50 mg/kg)로 복강내 주사 마취후 각각 12마리씩 3군으로 나누어서 cisplatin(1 mg/ml, 보령제약)을 각각 4 mg/kg, 8 mg/kg, 12 mg/kg의 용량으로 천천히 복강내에 1회 주입하였다. 마취는 방사선 조사군 및 대조군과 같은 조건을 유지하기 위해 적용하였다. 방사선 조사 조건(Fig. 1) 기니픽에 대한 방사선 조사를 위하여 투명한 플라스틱으로 만든 동물고정기를 제작하였다. 동물고정기는 25×5×6 cm의 크기였고, 각 면마다 구멍을 뚫어서 밀폐되지 않도록 하였다. 방사선 조사는 동물 실험용 세시움-137 방사선 조사장치(Mark type Ⅰ, Shepherd, USA)를 이용하였으며, 기니픽의 두부이외의 부분에 방사선이 조사되는 것을 막기 위하여 Lipowitz 합금(Cerrobend, 상신 Co., Korea)으로 이중 차폐물을 제작하여, 기니픽의 두부에만 방사선을 조사하였다. 차폐물의 두께는 13 cm로서 방사선 투과율은 0.1% 미만이었다. 방사선 조사야의 폭은 2 cm으로 하였고, 선원으로부터 기니픽의 두부까지의 거리는 17 cm으로 하였다. 방사선의 조사 36마리의 기니픽(방사선 조사군)에 sodium pentobarbital(50 mg/kg)로 복강내 주사 마취후 동물고정기 안에 넣어 움직이지 못하게 하고, 측두골 부위를 방사선 조사야에 노출시켜 각각 12마리씩 17, 23, 33 Gy의 방사선을 단일 조사하였다. 대조군의 설정 기니픽 12마리(대조군)를 같은 방법으로 마취하였다가 깨운 후 아무런 처치도 하지 않은 채 사육하여 대조군으로 삼았다. 동물들은 마취후 약 2, 3시간후부터 움직일 수 있었으며, 주위에 물을 풍부하게 공급하여 탈수되지 않도록 하였다. 조직 처리 및 주사전자현미경 검사 실험 8일째에 형태학적인 검사를 위한 조직 처리를 하였다. 동물들은 매일 체중을 측정하였고, 체중의 상실이 심하여 더 이상 생존을 유지하기 힘들다고 판단된 cisplatin 12 mg/kg 투여군의 3마리, cisplatin 8 mg/kg투여군의 2마리, 방사선 33 Gy 조사군의 4마리, 방사선 23 Gy 조사군 2마리는 실험 8일째가 되기 전에 조직 처리를 하였다. 기니픽을 2% xylazine hydrochloride(0.5 ml/kg) 및 sodium pentobarbital(50 mg/kg) 복강내 주사 마취하에 흉부를 절개하여 심장을 노출시켰다. 좌심실을 천자하고 카테터를 상행 대동맥내로 삽입한 후, 이를 통해 생리식염수로 두경부의 혈액을 세척하였다. 이어 고정액(2.5% glutaraldehyde)을 서서히 주입시켜서 측두골을 생체 상태에서 고정하였다. 양측 측두골을 추출한 후 중이강을 노출시켜 정원창, 난원창 및 와우첨단을 개방하고 이 부위들을 통하여 고정액(2.5% glutaraldehyde)을 와우내로 유입시켜서 4℃에서 24시간동안 고정하였다. 해부현미경하에서 미세수술기구(sharp pick)와 드릴을 이용하여 고정된 측두골 와우의 전면골부를 제거하고 혈관조(stria vascularis)를 박리하여 Corti 기관을 노출시켰다. 이를 pH 4.0인 2% tannic acid로 24시간 처리한 후 2% osmium tetroxide로 2시간 후고정하였다. 고정된 표본을 70% 알콜에서부터 시작하여 100% 까지 점차 농도를 높여 가면서 탈수시키고, 임계점건조(critical point dry)시킨 후 이온도금기(ion sputter)로 금도금하고 주사전자현미경(Hitachi S-500)으로 관찰하였다. 결과의 평가 기준과 통계 처리 기니픽 와우 hook부에서 150∼180° 떨어진 turn의 부위에서 주사전자현미경으로 유모세포의 모든 열이 포함되도록 각 turn별로 사진을 촬영하고, 사진의 좌측에서부터 각 열(row)별로 10개씩의 유모세포(hair cell)를 관찰하였다. 이를 유모세포의 형태학적 손상을 측정한 여러 실험 1)2)에서와 마찬가지로 다음과 같은 4단계의 grade로 개개의 유모세포의 손상 정도를 평가하였다. grade 0：정상 grade 1：섬모의 stiffness 소실, 비정상 섬모가 50%이하 grade 2： 섬모의 융합, 거대섬모의 출현, 비정상 섬모가 50%이상 grade 3：섬모의 부재 결과의 정량적인 평가와 통계적인 검증은 Chi square for trend by Mantel extension method 법을 적용하였으며, 통계 소프트웨어는 개인용 컴퓨터 IBM-PC 호환 기종에서 동작하는 Epi Info(Version 5.00, Centers for Disease Control, Epidemiology Program Office, Atlanta, Georgia, U.S.A.)를 사용하였다. 결과 Cisplatin 투여군의 주사전자현미경검사 Cisplatin의 투여 용량이 4, 8, 12 mg/kg으로 증가함에 따라 손상을 받은 세포의 분율이 증가하였고(Table 1), Chi square for trend by Mantel extension method법에 의한 통계적 검정에서도 투여 용량과 손상 정도에 있어서 유의한 경향이 있었다(Table 3). 또한 Chi square for trend by Mantel extension method 법에 의해 부수적으로 산출되는 위험도(odds ratio)를 보면, 투여 용량이 4, 8, 12 mg/kg으로 증가함에 따라 대조군에 대해 약 5배, 26배, 68배로 손상에 대한 위험도가 증가함을 알 수 있었다(Table 3). 주된 이상 소견은 부동섬모(stereocilia)의 왜곡변형(distortion), 경직성(stiffness) 상실, 탈락(deletion) 등이었다(Fig. 2). 방사선 조사군의 주사전자현미경검사 방사선의 조사 용량이 17, 23, 33 Gy로 증가함에 따라 손상을 받는 세포의 분율이 cisplatin 투여군에서와 마찬가지로 증가하였다(Table 2). Chi square for trend by Mantel extension method법에 의한 통계적 검정에서도 투여 용량과 손상 정도에 있어서 유의한 경향이 있었고(Table 3), 부수적으로 산출되는 위험도가 방사선 조사량이 17, 23, 33 Gy로 증가함에 따라 대조군에 대해 약 17배, 26배, 30배로 손상에 대한 위험도가 증가함을 알 수 있었다(Table 3). 주된 소견은 부동섬모의 왜곡 변형, 탈락 등이었다(Fig. 3). cisplatin 투여군과 다른 형태적인 차이는 없었다. 유모세포의 열(row)에 따른 손상의 차이 Cisplatin 투여 군에서는 내유모세포(IHC, inner hair cell)에 대해 외유모세포의 제3열(OHC3, outer hair cell third row), 제2열(OHC2), 제1열(OHCI)에서 각각 7.3배, 4.3배, 2.7배의 위험도가 산출되었다. 이 역시 Chi square for trend by Mantel extension method 법에 의해 산출되었으며 유모세포의 열에 대한 감수성에 통계적으로 유의한 차이가 있었다(Table 3). 방사선 조사군에서는 내유모세포에 대해 외유모세포의 제 3 열, 제 2 열, 제 1 열에서 각각 12.1배, 7.9배, 5.2배의 위험도가 산출되었으며 유모세포의 열에 대한 감수성에 통계적으로 유의한 차이가 있었다(Table 3). 유모세포의 회전부위(turn)에 따른 손상의 차이 각군에서 회전부위별로 통계학적으로 유의한 차이가 없어, 회전부위별로 세분된 자료를 요약하여 제시하였다(Table 1, 2). 고찰 두경부암의 항암화학요법에 널리 이용되는 cisplatin은 DNA의 구아닌 염기(guanine residue) 사이에 비가역적인 intrastrand crosslink를 형성하는 것으로 알려져 있는 강력한 항암제이지만 이독성(ototoxicity), 신독성(nephrotoxicity)등의 부작용을 가지고 있다. Cisplatin의 투여에 따른 이독성은 보고자마다 정도의 차이가 있어, 투여환자의 13%, 48%에서 난청이 생겼다는 보고가 있다. 또한 Laurell등은 cisplatin 투여환자의 81%에서 일시적인 난청이, 13%에서는 회복되지 않는 영구적인 난청이 발생하고, 나이가 들수록 점점 심해지는 경향이 있음을 보고하였다.3) Cisplatin에 의한 내이의 병리조직학적인 변화에 대해서도 여러 보고가 있다. Canton과 Doniel은 기니픽에 대한 실험에서 cisplatin은 전정기관에 대한 독성은 거의 없으며 와우에 변화가 국한된다고 보고하였다.4) Kohn등은 역시 기니픽을 이용한 연구에서 cisplatin의 이독성은 Corti기관과 혈관조(stria vascularis)에 같이 나타나며, 유모세포(hair cell)의 손상은 와우의 기저부(basal turn)가 첨부(apical turn)보다 심하고, 외유모세포(outer hair cell)가 내유모세포(inner hair cell)보다 심하였음을 보고하였다.5) 드물지만 인간에 대한 cisplatin의 이독성에 대한 병리조직학적 보고가 있다. Wright등의 9세 남자 환자를 부검한 보고6)에 의하면 외유모세포의 소실이 주요한 변화였으며 이 변화는 와우 첨부보다 와우 기저부에서 심하였다. 이외의 소견으로 와우 나선신경절세포(spiral ganglion cell)숫자의 감소, 청신경 축삭(axon)의 퇴행성 손상(degeneration), 전정신경절세포(vestibular ganglion cell)의 보존을 보고하였으며, 동물실험의 보고5)와 달리 혈관조(stria vascularis)의 보존을 보고하고 있다. Strauss등의 부검 5례 7)에서도 외유모세포와 신경 손상 등 비슷한 소견 및 외유모세포에서 세포질 돌출(cytoplasmic extrusion), 부동섬모(stereocilia)의 융합, 거대 부동섬모의 형성, cuticular plate의 파괴 등의 초미세구조(ultra-structure)의 변화를 보고하였다. 방사선의 조사에 의한 내이 손상에 관하여 이미 많은 연구자들에 의해 실험 및 임상적인 보고가 있고, 방사선 치료를 받은 두경부 종양 환자들에게서 난청 및 중이염 등의 합병증은 흔히 관찰되고 있다. Borsanyi등은 비인강암으로 방사선 치료를 받은 모든 환자에서 난청이 발생함을 보고하였고, 중이염에 의한 전음성 난청 이외에도 일부에서는 감각신경성 난청이 있어 혈관조의 일시적인 혈관염에 의할 것이라고 추측하였다.8) 그후 Leach,9) Moretti10) 등이 방사선 치료후 감각신경성 난청이 일어남을 보고하여 정기적인 청력 검사를 통한 청력의 추적이 필요함을 강조하였다. Grau등은 비인강암환자 22명에서 cohort연구를 하여 4,000 Hz에서 골도 청력의 저하를 보고하였다.11) 그들은 이 연구에서 방사선 조사량과 청력 소실의 정도가 유의한 상관 관계가 있다고 하였고 특히 50 Gy이상의 방사선을 받은 환자들에게 난청의 발생 확률이 유의하게 높았다고 보고하였다. 방사선 조사에 의한 내이의 병리조직학적인 영향은 Ewald등의 비둘기에 대한 실험에서 청력소실을 보고한 이후로12) 여러 연구에서 발표되었다. Nylen등은 방사선 조사후 8주 되는 쥐의 측두골에서 와우 신경의 퇴행성 손상을, 12주 되는 측두골에서는 골괴사와 중이의 연조직 손상을 보고하였다.13) Berg등은 토끼에 대한 방사선 조사 실험에서 단일 조사(single dose)와 다분할 조사(fractionated dose) 사이에는 병리조직학적인 변화에 차이가 없음을 보였다.14) Gamble등은 기니픽에서 방사선을 조사한 후 cochlear microphonics로 청력을 측정하고 조직학적인 검사를 시행하여 주요병변이 유모세포와 혈관조에서 관찰됨을 보고하였다.15) 전자현미경을 이용한 연구가 시작된 후 Winther16)와 Tokimoto등17)은 기니픽에 23 Gy 까지의 방사선을 조사한 후 투과전자현미경을 이용하여 기저회전과 일부 중간회전에서 외유모세포의 세포핵과 세포질내의 다양한 변성을 관찰하였고, 내유모세포에는 변화가 없음을 보고하였다. Bohne등은 친칠라에 40∼90 Gy의 방사선을 다분할(fractionated) 조사하고 2년간 추적한 실험에서 가장 두드러진 병리조직학적 변화로 Corti기의 감각세포 및 지지세포 그리고 와우신경섬유의 손상을 보고하였고, 외유모세포의 손상이 내유모세포보다 심하나 각 회전간의 감수성의 차이는 없으며 또한 손상의 정도는 방사선 조사량과 비례한다고 하였다.18) 본 연구에서는 cisplatin의 투여 용량이 4, 8, 12 mg/kg으로 증가함에 따라 대조군에 대해 약 5배, 26배, 68배로 손상에 대한 위험도가 증가하였고, 방사선의 조사 용량이 17, 23, 33 Gy로 증가함에 따라 대조군에 대해 약 17배, 26배, 30배로 손상에 대한 위험도가 증가하였다. 이 결과에서 cisplatin의 위험도 증가가 방사선 조사의 위험도 증가보다 더욱 증강된 반응을 보이는 것은 cisplatin에 신독성이라는 다른 요소가 있어 용량이 증가함에 따라 축적 효과(cumulative effect)가 더욱 강하게 나타남을 시사한다고 해석할 수 있겠다. 용량에 따른 형태학적인 변화는 cisplatin이나 방사선이나 그 경향이 뚜렷하여 p<0.0001의 통계적인 유의성이 있었다. 또한 문헌 조사를 통해 실험 전에 적절한 용량을 선정하였는데, 실험 결과 그 중간값인 cisplatin 8 mg/kg와 23 Gy에서 비슷한 25배 내외의 상대위험도가 산출되었다는 것은 용량 선정이 잘 되었음을 시사하며, 차후로 관련된 실험을 계획할 때 참고할 수 있는 용량의 좋은 참조값을 제시하였다는 의의가 있다. 외유모세포의 열(row)의 번호는 문헌마다 차이가 있어 내유모세포에서 가장 가까운 것을 제3열로 부르는 문헌도 있지만 본 연구에서는 Schuknecht19)에 따라 제1열로 불렀으므로, 외유모세포 제3열은 가장 바깥쪽의 열을 지칭한다. 다른 여러 연구18)에서 외유모세포의 제3열이 cisplatin과 방사선에 대해 가장 감수성이 높다는 경향은 여러번 소개되었지만 정량적으로, 통계적으로 검증된 결과를 찾을 수는 없었다. 본 연구에서도 외유모세포의 제3열이 cisplatin과 방사선에 대해 가장 감수성이 높다는 결과가 나왔으며 유모세포의 열에 따라 감수성이 차이가 있음을 통계적으로 검증하였다. 외유모세포의 손상이 혈관염에 이차적인 것이라는 주장이 있지만, 전신적인 치료양식(systemic modality)인 cisplatin과 국소적인 치료양식(local modality)인 방사선 모두에 외유모세포의 제3열이 가장 감수성이 강하다는 결과는 유모세포의 손상이 혈관염에 이차적으로 생긴다는 가설보다는 외유모세포 제 3 열 자체가 감수성이 있다는 가설을 더 지지하는 결과이며, 아마도 그러한 감수성은 유모세포간에 대사율의 경사(metabolic gradient)가 있음을 시사하는 다른 연구 20)들을 볼때 외유모세포 제 3 열의 대사율이 높거나 혈류량이 많은 것이 원인이라고 사료된다. 결론 기니픽을 실험 동물로 하여 4 mg/kg, 8 mg/kg, 12 mg/kg의 용량의 cisplatin을 복강내 주사 또는 17 Gy, 23 Gy, 33 Gy의 방사선을 내이에 조사하였다. 투여 8일째 시행한 전자현미경검사에서 이상 소견을 보였으며 그 주된 소견은 외유모세포 섬모의 왜곡, 탈락이었다. 손상의 정도는 cisplatin과 방사선의 용량이 많을수록 심하였으며, 외유모세포의 제3열이 가장 심하였다. 기니픽을 이용한 이 실험에서 산출된 형태학적인 변화의 용량-반응 관계는 cisplatin 및 방사선에 대한 이독성을 보이는 정량적인 동물 모델로 향후 이독성 난청을 예방하는 약제의 효과를 검증하는 데 도움이 될 것이다.
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