서     론

   PAF는 감작된 호중구의 탈과립시 분비되는 혈소판의 응집을 유발하는 물질로 처음 밝혀졌으며, 화학적으로는 세포벽으로부터 합성된 인지질로 밝혀졌다.¹⁾ PAF는 강력한 평활근 수축물질이며, 모세혈관의 투과성을 증가시켜 혈장의 삼출을 유발한다.²⁾³⁾ 실험적으로 혈관내피를 제거하면 PAF에 의한 혈관 평활근의 수축이 일어나지 않는 것이 관찰되어 혈관에 대한 PAF의 작용기전은 혈관내피의 존재 유무와 밀접한 상관관계가 있음이 밝혀졌다.⁴⁾

   Endothelium-derived relaxing factor (EDRF)는 Acetyl-choline (ACh)에 의한 혈관이완이 혈관내피를 제거하면소실되는 것이 관찰됨에 따라 그 존재가 처음 알려졌다.⁵⁾ 그 후 이 EDRF가 혈관내피세포에서 생성된 nitric oxide(NO)임이 밝혀졌다.⁶⁾⁷⁾ Nitric oxide synthase (NOS)에 의해 생성되는 NO는 혈관운동성을 조절하고, 중추 및 말초신경계의 주요 신경전달물질로 작용한다. 또한 대식세포내에서 생성되어 병원체나 종양세포에 대한 생체 방어기전에 관여하는 다양한 생리적 조절기능을 가진 활성물질로 밝혀졌다.

   PAF에 의한 국소 혈관운동성은 혈관내피의 존재에 의존하며, 혈관내피세포에서 생성되는 NO는 국소 혈관운동성과 모세혈관 투과성은 조절한다고 밝혀졌다. 따라서 PAF에 의한 국소 모세혈관 투과성의 증가도 혈관내피세포에서 생성되는 NO에 의해 조절된다고 추정되어, NOS 길항제의 전 처치는 PAF에 의한 국소 모세혈관 투과성의 증가를 억제시킬 수 있다는 가설을 설정하였다.
   문헌고찰에 의하면 햄스터의 협낭(cheek pouch)에서 PAF에 의한 모세혈관 투과성의 증가는 NOS 길항제인 L-NAME (N^w-nitro-L-arginine methyl ester)에 의해서 억제된다고 보고하였다.⁸⁾ 그러나 흰쥐의 비점막과 기관지점막에서 PAF에 의한 모세혈관 투과성의 증가가 L-NAME에 의해서 억제되는 것에 대한 보고는 없었다.
   본 연구의 목적은 호흡기도점막에 있어 PAF에 의한 모세혈관 투과성의 증가는 혈관내피세포에서 생성된 NO에 의해 조절됨을 밝히고자 함이다. 이를 위하여 NOS의 길항제인 L-NAME투여 전 후, PAF에 의해 유발된 호흡기도 점막 모세혈관 투과성의 변화를 Evans blue assay로 정량하여 비교 검토하고, 형광현미경하에서 그 형태학적 단서를 찾고자 한다.

재료 및 방법

모세혈관 투과성의 정량적 연구- Evans blue assay

   실험동물로는 체중 250~350 g의 외견상 건강해 보이는 Sprague-Dawley계 암컷 흰쥐 9마리를 사용하였다. Ketamine hydrochloride(유한양행, 서울, 75 mg/kg)와 xylazine(한국바이엘, 서울, 10 mg/kg)의 혼합용액을 복강내 주사하여 전신마취하고 기관절개를 시행하여 기도를 확보하였다.
   꼬리정맥을 통하여 실험군 (n=5)에서는 L-NAME 용액(N^w-nitro-L-arginine methyl ester；Sigma, USA, 10 mg/ml in 0.9% saline) 1 ml/kg을 주사하였고 대조군(n=4)에서는 생리식염수 1 ml/kg을 주사하고, 60분후 Evans blue 용액(Sigma, USA, 30 mg/ml in 0.9% saline) 1 ml/kg을 주사하고, 다시 10분후 PAF 용액(L-α-phosphatidylcholine, β-acetyl-γ-O-alkyl；Sigma, USA, 1ug/ml, 0.25% bovine serum albumin in 0.9% saline) 1 ml/kg을 주사하였다.
   PAF 용액 주사후 5분이 지나서 전흉벽을 절개하여 심장을 노출시키고 우심방을 절개하여 실혈시키면서 좌심실을 통해 대동맥에 18게이지 침을 고정시킨 후 2% paraformaldehyde(PFA)용액 100 ml로 관류 고정시켰다. 경부를 절개하여 기관지를 절취하고, 비배부의 중앙에서 피부로부터 골막까지 약 2 cm 정도 수직 절개하여 비강을 노출시킨 후 비중격을 포함한 비강 점막을 절취하였다.
   절취한 기관지와 비강 점막을 formamide(2 ml, 100%)와 60°C에서 24시간동안 반응시켜 조직내로 유출된 Evans blue를 추출하였다. 추출액의 농도를 분광광도계(Beckman DU^® series 650, USA)로 파장 620 nm에서 측정하여 그 양(ug/mg wet tissue)을 정량하였다.

모세혈관 투과성의 형태학적 연구

   위와 같은방법으로 절취한 기관지와 비중격을 3×4 mm의 크기로 세절하고 곧 2% PFA 용액에 4시간 침습고정 후, 25% sucrose 첨가 인산 완충용액 (0.1M phosphate buffered saline : PBS)으로 24 시간 세정한다. 조직을 OCT compound에 포매, 동결시킨 후 -21°C 동결박절기에서 20 μm 두께로 연속 냉동절편을 제작하였다. 형광현미경 (Olympus BX 50, Japan)으로 파장 435 nm에서 Evans blue의 유출 양상을 관찰하였다.

결     과

모세혈관 투과성의 정량적 연구- Evans blue assay

   흰쥐의 꼬리정맥에 생리식염수를 주사한 대조군 (n=4)과 L-NAME용액을 주사한 실험군 (n=5)에서 기관지와 비중격을 절취하여 유출된 Evans blue의 양을 분광광도계로 측정하였다.
   실험군(L-NAME)에서 유출된 Evans blue의 평균양이 각각 비점막은 6.643, 기관지는 6.987 ug/mg wet tissue 이었고, 대조군에서 각각 비점막은 24.789, 기관지는 28.238 ug/mg wet tissue 이었다. 이 결과는 유출된 Evans blue의 양이 대조군에 비하여 실험군에서 현저하게 감소되었고, 통계학적으로 의미있는 차이를 보였다 (t-test, P<0.01)(Table 1, Fig. 1).

모세혈관 투과성의 형태학적 연구
   Evans blue는 형광하에서 밝은 적색 내지 주황색으로 발색된다. 기관지의 200배 형광현미경사진에서 대조군의 상피층과 상피하층에서는 유출된 Evans blue가 오렌지색으로 강하게 발색되었다. 실험군(L-NAME)에서는 유출된 Evans blue의 발색이 거의 관찰되지 않았다(Fig. 2). 형광현미경사진에서 실험군에 비해 대조군에서 배경이 검게 나타난다. 이것은 대조군에서 Evnas blue가 형광하에서 오렌지색으로 강하게 발색되어서 나타나는 것으로 생각된다.

고     찰

   본 연구에서는 흰쥐의 비점막과 기관지점막에서 PAF에 의한 모세혈관 투과성의 증가는 NOS 길항제인 L-NAME에 의해서 현저히 억제되는 것을 Evnas blue assay로 정량하였고, 조직내 유출된 Evans blue를 형광현미경하에서 형태학적으로 확인하였다.
   혈관투과성을 측정하는 방법으로 분자 무게가 60 kD인 Evans blue를 이용할 수 있다. Evans blue는 혈장 알부민과 결합하여 혈관의 투과성이 증가되면 혈관으로부터 조직내로 알부민과 함께 유출된다. 혈관내 존재하는 Evans blue를 제거하고 조직내 존재하는 Evans blue를 추출하여 분광광도계로 정량하면 혈장의 혈관외유출 정도를 측정할 수 있다. 또한 Evans blue가 형광하에서 적색으로 발색되는 것을 이용하여 형광현미경하에서 유출양상을 관찰할 수 있다.^9)10)11)
   PAF는 알레르기반응의 지연형 반응을 일으키는 주된 화학매개체로서 기도 평활근을 수축시키며, 모세혈관의 투과성을 증가시켜 혈장의 삼출을 유발한다.³⁾⁵⁾ PAF에 의한 모세혈관투과성의 증가는 혈소판, cyclooxygenase and lipoxygenase products와는 상관관계가 없고, 혈관내피의 존재 유무와 밀접한 상관관계가 있음이 밝혀졌다.⁶⁾¹¹⁾
   Ramirez등⁸⁾은 모세혈관 투과성에 있어 PAF의 생화학적 신호경로(biochemical signaling pathway)에는 특이수용체의 활성화(activation of specific receptors), G-proteins, tyrosine kinase, phospolipase A₂, C, and D, protein kinase C and calcium entry와 연관된 cascade등이 관여한다고 하였다. NO 합성이 아마도 이 생화학적 신호경로의 한 구성요소일 것으로 보고하였다. Noel등²⁾은 PAF와 NO가 허혈-재관류 손상 (ischemia-reperfusion injury)에 있어 모세혈관 투과성을 매개하는 것으로 보고하였고, PAF에 의한 모세혈관 투과성의 증가는 NOS 길항제 투여후 억제된다고 하였다. 본 연구의 결과는 PAF에 의한 모세혈관 투과성의 증가는 NO에 의해 조절된다는 단서를 제공한다고 생각된다.
   NO는 체내에 존재하는 무기 기체유리기 (inorganic, gaseous free radical)로써 매우 불안정하고 반응성이 강한 화학물질이다. NO는 혈관 내피세포에서 L-arginine을 기질로하여 NOS에 의해 L-citrulline과 함께 생성된다. NO를 합성하는 효소는 크게 constitutive NOS(cNOS)와 inducible NOS (iNOS)로 구분할 수 있다. cNOS는 이미 세포내에 존재하여 외부로 부터의 자극에 의하여 활성을 갖는 것이고, iNOS는 자극에 의하여 세포내에서 새로이 합성되어 발현되는 것이다.¹²⁾¹³⁾ cNOS는 뇌의 신경에 존재하는 bNOS (brain NOS)와 혈관내피세포에 존재하는 eNOS(endothelial NOS)의 두가지가 있으며, 이들은 Ca²⁺과 calmodulin(CaM)의 존재하에서 활성을 보인다. iNOS는 대식세포내에서 처음으로 동정되었으며 Ca²⁺과 CaM에는 영향을 받지 않는 것으로 알려져 있다. 최근에는 대식세포뿐만 아니라 간세포, 암종세포, 성상세포, 염증성 호중구와 호흡상피세포 등에서도 동정되었다.^12-15)

   본 실험에서 흰쥐의 비점막과 기관지점막에서 PAF에 의한 모세혈관 투과성의 증가는 5분이내 일어났다. Ramirez등⁸⁾에 의하면 햄스터의 협낭에 PAF를 국소투여굯하였을 때 모세혈관 투과성의 증가는 30분이내 일어난다고 보고하였다. 이들간의 시간적인 차이는 아마도 실험동물, 실험부위, 그리고 투여방법이 달랐기 때문이라고 생각된다. PAF에 의한 모세혈관 투과성의 증가는 비교적 짧은 시간이내 유발되었고, 이것은 아마도 PAF가 모세혈관에서 NOS isoform들중 eNOS를 활성화시키는 것으로 생각된다.
   본 실험에서 사용한 L-NAME은 전술한 3가지 NOS isoform들과 상관없이 모든 NOS에 대해 비특이적으로 작용한다. L-NAME은 무스카린성 수용체(muscarinic receptor)를 차단하고, cyclooxygenase의 대사과정을 차단한다.⁸⁾¹⁶⁾ ACh과 bradykinin은 NOS의 활성화를 통하여톻혈관확장을 유발한다. NO에 의한 혈관확장을 증명하기 위해서는 각각 ACh과 bradykinin을 사용하는 경우도 있다.^8)17)18) 본 실험에서 관찰된 PAF에 의한 모세혈관투과성의 변화는 L-NAME의 NOS 길항효과 외에도 무스카린성 수용체 및 cyclooxygenase의 대사과정의 차단작용에 의한 효과도 배제할 수는 없다. 이러한 이유 때문에 향후 NOS 활성화의 간접적인 지표로서 ACh이나 bradykinin을 사용한 연구와 eNOS에 선택적으로 작용하는 길항제를 이용한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
   알레르기반응에서 화학매개체의 작용을 차단함은 알레르기 질환의 치료에 중요한 원칙중 하나이다. 따라서 항히스타민제는 알레르기 질환의 가장 주된 치료제로 선택되고 있다. 그러나 항히스타민제는 지연형 반응을 효과적으로 차단하지 못하므로 증상의 재 발현이 흔히 초래된다. 임상적으로 알레르기성 비염의 환자에서 항히스타민제를 투여하여도 지연형 반응에 의해 재 발현되는 비폐쇄와 같은 증상은 효과적으로 치료되지 못하고 있다. 따라서 알레르기 질환의 치료제 선택에 있어 새로운 접근이 다양하게 모색되고 있다. 이들 중 특히 지연형 반응에 관여하는 PAF의 작용기전이 NO를 매개로 한 간접적 기전임을 밝힌 본 연구는 향후 알레르기 질환의 치료제 개발에 새로운 단서를 제공할 수 있다고 생각된다.

결     론

   NOS 길항제인 L-NAME 투여전 후, PAF에 의해 유발된 호흡기도 점막 모세혈관 투과성의 변화를 Evans blue assay로 정량하였고, 형광현미경하에서 형태학적으로 확인하였다.
   L-NAME로 전처치한 경우 흰쥐의 비점막과 기관지점막에서 PAF에 의한 모세혈관 투과성은 현저히 억제되었다. 이 결과로 미루어 볼 때 흰쥐의 호흡기도점막에서 PAF에 의한 모세혈관 투과성의 증가는 아마도 NO에 의해서 조절된다고 생각된다.

1. Benveniste J, Henson PM, Cochrane CG. Leukocyte-dependent histamine release from rabbit platelets. J Exp Med. 1972;136:1356-77.

2. Noel AA, Hobson II RW, Duran WN. Platelet-activating factor and nitric oxide mediate microvascular permeability in ischemia-reperfusion injury. Microvisc Res 1996;52:210-20.

3. Yamada T, Yukioka H, Hayashi M, Asada A, Inoue M. Effects of inhaled nitric oxide on platelet-activating factor-induced pulmonary hypertension in dogs. Acta Anaesthesiol Scand 1998;42:358-68.

4. McMurtry IF, Morris KG. Platelet-activating factor causes pulmonary vasodilation in the rat. Am Rev Respir Dis 1986;134:757-62.

5. Furchgott RF, Zawadzki JV. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature 1980;288:373-6.

6. Furchgott RF. Studies on endothelium-dependent vasodilation and the endothelium-derived relaxing factor. Acta Physiol Scand 1990;139:257-70.

7. Folkert G, vander Linde H, Verheyen AK, Nijkamp FP. Endogenous nitric oxide modulation of potassium-induced changes in guinea-pig airway tone. Br J pharmacol 1995;115:1194-8.

8. Ramirez MM, Quardt SM, Kim D, Oshiro H, Minnicozzi M, Duran WN. Platelet activating factor modulates microvascular permeability through nitric oxide synthesis. Microvasc Res 1995;50:223-34.

9. Udake K, Takeuchi Y, Movat HZ. Simple method for quantification of enhanced vascular permeability. Proc Soc Exp Biol Med 1970;133:1384-7.

10. Saria A, Lundberg JM. Evans blue fluorescence: Quantitative and morphological evaluation of vascular permeability in animal tissue. J Neurosci Methods. 1983;8:41-9.

11. Evans TW, Chung KF, Rogers DF, Barnes PJ. Effects of platelet- activating factor on airway vascular permeability: possible mechanism. J Appl Physiol 1987;94:479-84.

12. Snyder SH, Bredt DS. Biological roles of nitric oxide. Sci Am 1992;266:68-71.

13. Nathan C. Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells. FASEB 1992;6:3051-64.

14. Bredt DS, Snyder SH. Isolation of nitric oxide synthase, a calmoduline-requiring enzyme. Proc Natl Acad Sci USA 1990;87:682-5.

15. Forstermann U, Schmidt HH, Pollock JS, Sheng H, Mitchell JA, Warner TD, Nakene M, Murad F. Isoforms of nitric oxide synthase. Characterization and purification from different cell types. Biochem Pharmacol 1991;42:1849-57.

16. Salvemini D, Misko TP, Masferrer JL, Seibert K, Currie MG, Needleman P. Nitric oxide activates cyclooxygenase enzymes. Proc Natl Acad Sci USA 1993;90:7240-4.

17. Moncada S, Palmer RMJ, Higgs EA. Nitric oxide: Physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharm Rev 1991;43:109-42.

18. Gawlowski DM, Duran WN. Dose-related effects of adenosine and bradykinin on microvascular permselectivity to macromolecules in the hamster pouch. Cir Res 1986;58:348-55.