| Expression of Vascular Endothelial Growth Factor mRNA in Endotoxin Induced Otitis Media with Effusion of the Rat. |
| Myung Won Kim, Hak Hyun Jung, Baik Ahm Chang, Sang Cheol Lee, Eun Seok Kim, Hyun Ho Lim |
1Department of Otolaryngology, Seoul Adventist Hospital, Seoul, Korea. hakjung@netsgo.com
2Department of Neck Surgery, College of Medicine, Korea University, Seoul, Korea. |
| 실험적 삼출성 중이염에서 Vascular Endothelial Growth Factor mRNA의 발현 |
| 김명원1 · 정학현2 · 장백암1 · 이상철1 · 김은석1 · 임현호2 |
| 서울 위생병원 이비인후과1;고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실2; |
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| 주제어:
삼출성 중이염ㆍVascular endothelial growth factor(VEGF) ㆍ혈관 투과성ㆍPCRㆍ흰쥐. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
The vascular endothelial growth factor (VEGF), a heparin binding growth factor specific for endothelial cells, is both a potent enhancer of vascular permeability and an angiogenic growth factor. The purpose of this study was to investigate the semi-quantitative expression levels of multiple VEGF mRNA splicing variants in endotoxin-induced otitis media with effusion (OME) of rat.
MATERIALS AND METHODS:
We instilled endotoxin and saline as a control into the middle ear cavity of the rat, and middle ear mucosa were taken at 0 h, 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, 1 d, 3 d, 7 d, and 14 d. The levels of splicing variants of VEGF transcripts were evaluated by semi-quantitative RT-PCR.
RESULTS:
Expression of VEGF164 mRNA and VEGF120 mRNA was first identified at 1 h after endotoxin instillation and was dramatically increased between 6 h and day 1 and then progressively decreased by day 7. Expression level of VEGF120 mRNA was 1.34+/-0.27 fold higher than that of VEGF164, and the expression level of VEGF164 was 3.89+/-0.97 fold higher than that of VEGF188.
CONCLUSION:
These results suggest that VEGF may be primarily responsible for the increased vascular permeability in OME and that it seems to play a significant role in the pathogenesis of OME. |
| Keywords:
Vascular endothelial growth factorㆍOtitis mediaㆍVascular permeabilityㆍPCRㆍRat |
서론
장액성 중이염(serous otitis media)은 혈청과 비슷한 성분의 장액성 저류액이 중이강 내에 고이는 삼출성 중이염의 초기 형태로, 그 형태학적 특성은 모세 혈관의 투과성 증가, 상피하 부종, 중이강 내에 장액성 저류액 생성 등으로 알려져 있다.1)2) 혈관 투과성을 증가시키는 염증 매개물인 platelet activating factor(PAF), arachidonic acid 대사산물, histamine 등이 삼출성 중이염에서 혈관 투과성에 관여하여 장액성 저류액의 생성에 중요한 물질로 알려져 왔으나3-5) 아직 삼출성 중이염의 혈관 투과성을 증가시키는 일차적 원인과 그 기전에 대하여는 명확히 밝혀져 있지 않다.
혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor, 이하 VEGF)는 heparin 결합성 성장요소로 혈관내피세포(endothelial cells)에 특이적으로 작용하여 혈관 투과성을 증가시키고, 맥관 형성(angiogenesis)에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.6)7) VEGF는 histamine보다 50,000배 강력한 혈관 투과성을 가지며7) 현재 밝혀진 혈관 투과성 증가 요소 중 가장 강력하므로 삼출성 중이염에서도 VEGF가 혈관 투과성 증가에 관여할 수 있을 것으로 추측되나 아직 이에 대한 연구는 보고된 바 없다.
VEGF는 34∼42 kD의 유사분열물질(mitogen)로서 인체 에서는 현재까지 VEGF206, VEGF189, VEGF165, VE-G F121 등 4가지 이상의 교대성 접합절단유사체들(alternative splicing variants)이 보고되고 있으며,8)9) 흰쥐에서는 VEGF188, VEGF164, VEGF120 등이 유사체로 알려져 있고, 이는 인체의 VEGF189, VEGF165, VEGF121과 동일하다.10) VEGF206과 VEGF189/188은 주로 세포에 결합되어 있고, VEGF165/164와 VEGF121/120은 세포에서 분비되어 혈관내피세포에 존재하는 kinase insert domain-containing receptor(KDR)와 flm-like tyrosine kinase-1(flt-1)의 수용체와 결합하여 혈관 투과성과 맥관 형성에 관여하는 것으로 알려져 있으며,11)12) VEGF165, VEGF121, VEGF189의 발현량은 장기에 따라 각각 다르다.13) 이러한 다양한 발현양상은 단백질 단위에서 VEGF 형태에 따라 생리학적 역할이 다양함을 의미한다.
이에 저자들은 혈관 투과성이 가장 강력한 것으로 알려진 VEGF가 장 액성 삼출성 중이염에서 저류액을 생성하는 주된 물질일 수 있다는 가정하에 흰쥐에서 내독소로 삼출성 중이 염을 유발하여 VEGF mRNA의 발현량을 반정량적 rev erse transcriptase-polymerase chain reaction(semi-quantitative RT-PCR)으로 관찰하고자 하였다.
재료 및 방법
실험 동물 및 실험적 중이염의 유발
수술 현미경하에서 고막 및 중이강이 정상인 36마리의 Sprague-Dawley형 흰쥐(150∼200 gm)를 실험동물로 사용하였다. 흰쥐를 Ketamine hydrochloride(50 mg/kg)와 xylazine hydrochloride(5 mg/kg)로 근주하여 마취하였고, 외이도를 70% ethanol로 청결히 한 후 우측 귀에는 인산 완충액(sterile phosphate buffered saline, 이하 PBS)에 녹인 E. coli 내독소(E. coli lipopolysaccharide, serotype 0111-B 4, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 용액을 50 μg/ml의 농도로 0.3 cc 고막을 통하여 주입하였으며, 좌측 귀에는 동일한 방법으로 PBS 만을 주입하였다.
조직 표본의 제작
내독소 주입 직전(0시간, 정상 대조군), 내독소 주입 후 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 1일, 3일, 7일 및 14일에 각각 흰쥐 4마리를 희생시켰으며, 수술 현미경하에서 중이강내 저류액이 충분한 양 존재할 경우 저류액을 흡인하여 균주 배양검사를 시행하였다. 조직학적 검사를 위하여 각각 2마리에서 채취한 중이 점막을 10% formalin에 수시간 고정하고, 10% nitric acid에 24∼48시간 탈석회화시킨 후 흐르는 물에 세정하고 탈수 과정을 거쳐서 paraffin에 봉매한 뒤 절편을 만들어 hematoxylin-eosin으로 염색하여 광학현미경으로 검경하였다. VEGF mRNA 발현을 검사하기 위하여 각각의 나머지 2마리에서 중이 점막을 분리한 후 즉시 -70℃에 결빙하고 추후 cDNA 합성에 사용하였다.
Reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR)
총 RNA(total RNA)는 TRIzol Reagent(Life Technolo-gies, Gaithersberg, MD, USA)를 사용하여 표본으로부터 분리한 후 총 RNA 0.5 μg을 ologo-(dT) 12-18 primers와 mol-ohey murine leukemia virus 역전사효소(Life Technolog-ies, Gaithersberg, MD, USA)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. VEGF의 전령 RNA(mRNA)의 구조는 8개의 ex-on이 존재하며, 교대성 접합절단은 exon 6, exon 7에 존재하기 때문에 이들 모두를 증폭하여 구분하기 위하여 exon 3부터 3' untransulated ends까지 증폭시키기 위한 한 쌍의 primer(rVEGF1 primer)를 제작하였고, primer의 염기서열은 sense 5'GACCCTGGTGGACATCTTCCAGGA 3', antisense 5'GGTGAGAGGTTCTAGTTCCCGA 3'이었으며, 이는 VEGF 188, VEGF 164, VEGF 120의 세가지 교대성 접합절단을 증폭하여 그 PCR 산물의 길이가 각각 514 bp, 462 bp, 330 bp이었다(Fig. 1). 다른 한 쌍의 primer(rVEGF2 primer)는 exon 3부터 exon 7까지 증폭시킴으로써 VEGF188과 VEGF164을 관찰할 수 있었으며, 그 염기서열 은 sense 5'GACCCTGGTGGACATCTTCCAGGA3', antisense 5'GTTTAACTCAAGCTGCCTCGC3'이었고, VEGF188과 VEGF164에 해당하는 PCR 산물의 길이는 444 bp와 372 bp이였다. PCR 비교 대조물로는 β2-mi-croglobulin을 이용하였으며, primer의 염기서열은 sense 5' CAGATCTGTCCTTCAGCAAG 3', antisense 5' GGAGTAAACTGGTCCAGATG 3' 이었으며, PCR 산물의 길이는 188 bp이었다.
반정량적 RT-PCR을 위한 PCR cycle은 (1) 94℃에서 30초, (2) 58℃에서 30초, (3) 72℃에서 1분 30초이며 횟수는 kinetic analysis에 의하여 VEGF는 35회, β 2-micro-globulin은 30회 시행하였다. PCR 산물 중 일부를 pGEM-T Easy vector(Promega, Medison, WI, USA)로 결합하여 ABI 373A automated DNA sequencing system(ABI) 을 사용하여 염기서열을 관찰하였다. VEGF와 β 2-microglobulin cDNA의 positive clones을 양성 대조군으로 증폭시켰으며, taq 중합효소와 primer의 조합을 가지지만 template는 없는 대조 PCR 반응을 음성 대조군으로 사용하였다. 내독소로 유발된 중이염에서 채취한 중이 점막의 cDNA 중 1.25%만을 증폭시켰고 예상 길이의 PCR 산물은 ethidium bromide가 섞인 2% agarose gel에서 관찰하였고 300 dpi에서 scan한 후 PCR산물의 단위 면적을 get macro가 포함된 NIH image analysis software(v. 1.61)로 분석하였다. VEGF와 β 2-microglobulin 각각을 1 fmol부터 3배씩 희석하여 3 10배까지 희석시킨 최종 농도 0.051 a mol에서 PCR을 시행하여 titration curve로 확인한 후 반 정량적 분석은 densitometry에 의한 VEGF/β 2-microglobulin의 비로 비교하였다. VEGF의 교대성 접합절단도 동일 한 방법으로 VEGF120/VEGF164, VEGF164/VEGF188의 비를 비교하였다.
결과
삼출성 중이염의 관찰
육안 검사상 내독소를 주입한 중이강에서는 1∼3시간까지는 중이강내 주입한 E. coli 용액과 동일한 색의 저류액이 있었으며, 6∼12시간에는 저류액이 일부 소실되고 약간 불투명한 색의 저류액이 중이강 하부에 일부 관찰되었고, 1일과 3일에는 밀짚색의 저류액이 관찰되었으나 이때의 배양검사에서 균주는 배양되지 않았다. 7일에는 저류액이 소실되었으며 중이 점막의 국소적 출혈소견 이외에는 정상적이었고, 14일에는 저류액이 관찰되지 않았으며 중이점막도 정상적이었다. PBS를 주입한 중이강에서는 3시간 후부터 저류액이 관찰되지 않았다.
중이점막의 광학현미경소견에서는 내독소를 주입하고 3시간 후에 처음 세포 침윤과 경도의 상피하 부종이 관찰되었고, 6시간부터 중이강 내로 세포 침윤, 상피하 부종, 및 혈관의 팽창이 심하였으며, 12시간부터 다량의 세포 침윤과 저류액의 형성이 관찰되었으며 상피하 부종도 심하였다. 1일에는 12시간보다 염증의 정도가 더 심하였고, 3일에는 염증세포의 침윤이 심하였으나 상피하 부종은 경감되었으며, 7일에는 염증세포의 침윤과 상피하부종이 거의 소실되었고, 14일에는 염증 반응이 관찰되지 않았다(Figs. 2 and 3).
VEGF mRNA의 반정량적 RT-PCR
VEGF1 primer을 이용한 3가지 VEGF 교대성 접합절단의 RT-PCR 산물 크기는 514 bp(VEGF188), 462bp(VEGF164), 330bp(VEGF120)이었으나, 정상 중이 점막(0시간, 정상 대조군)과 PBS를 처리한 중이 점막(실험 대조군)의 RT-PCR에서 VEGF의 PCR 산물은 관찰되지 않았고, 내독소를 투여한 후 1시간부터 VEGF164와 VEGF120이 발현되었으며, 6시간, 12시간, 1일에 발현이 증가하였고, 3일과 7일에는 발현이 감소되었으며, 14일에는 발현이 관찰되지 않았다(Fig. 4). rVEGF2 primer를 이용한 RT-PCR에서도 VEGF188과 VEGF164의 발현 양상은 위와 동일하였다. VEGF의 β2-microglobulin에 대한 발현 비율(VEGF/β 2-microglobulin)은 내독소 투여 후 0시간, 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 1일, 3일, 7일, 14일에 각각 0, 0.39, 0.36, 0.76, 0.40, 0.65, 0.33, 0.11, 0으로 내독소 투여 1시간 후부터 3일까지 증가하였으며, titration cur-ve에 의한 최고 발현은 6시간에 약 3 5배 증가하는 것으로 관찰되다. VEGF120이 VEGF164보다 1.34±0.27배 발현이 높았으며, VEGF164는 VEGF188보다 3.89±0.97배 발현이 많았다(Table 1).
Plasmid vector로 cloned된 일부 PCR 산물의 염기서열은 보고된 것과 동일하였다(Gene accession number；AF0624 for VEGF188, M32167, L20913 for VEGF164 and VEGF120, Y08532 for β 2-microglobulin).
고찰
이 연구의 결과에 의하면 흰쥐의 중이강 내에 내독소를 투여하면 VEGF164와 VEGF120과 같은 분비 형태의 V EGF mRNAs가 내독소 투여 1시간 후부터 발현되고, 중이 점막의 염증 반응이 증가함에 따라 발현량이 증가하며, 염증 반응의 소실과 더불어 발현이 감소함을 알 수 있었다. VEGF의 발현 증가로 유발되는 혈관 투과성의 증가는 삼출성 중이염에서 장액성 저류액이 유발되는 기전을 이해할 수 있다. 즉, PAF는 histamine보다 약1,000배 정도의 강한 혈관 투과성이 있으나14), VEGF는 histamine보다 50,000 배 강력한 혈관 투과성을 가지므로7) VEGF의 발현은 어떤 염증매개체보다도 강력하다고 할 수 있다. 내독소에 의하여 분비형 VEGF가 중이 점막에서 발현되는 것은 VEGF가 혈관내피세포에 일차적으로 작용하여 혈관 투과성을 증가시키고 혈장을 유출시킴으로써 상피하 부종 및 중이강내 장액성 저류액의 발생에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.
이 연구 결과에서 정상 또는 PBS로 처치한 중이 점막은 VEGF mRNA가 발현되지 않았으나 내독소 주입 후에는 중이 점막의 VEGF mRNA 발현이 매우 빠르게 진행되어 1시간 후부터 나타나기 시작하여 6시간에서 1일 사이에 증가하여 7일에는 감소하였고, 14일에는 관찰되지 않았다. 따라서 내독소에 의한 VEGF mRNA 발현은 매우 빠르게 나타나며, 이는 염증 반응을 일으키는 물질을 중이강 내에 투여하면 VEGF mRNA 발현이 매우 빠르게 일어날 것으로도 추정할 수 있다. 내독소에 대한 VEGF의 반응을 조절하는 기전은 아직 밝혀져 있지 않으나, 이미 다른 조직에서 밝혀 진 바와 같이 VEGF의 주요 생산지인 상피세포와 혈관 평활근세포에15)16) 내독소가 직접 작용하여 VEGF의 발현을 상향조절(upregulation)시킬 수 있을 것으로 추측된다. 이 VEGF는 혈관 기능의 외분비(paracrine) 조절자로 작용 함으로써 혈관 투과성에 일차적으로 작용한다. 섬유아세포(fibroblast)도 VEGF를 분비할 가능성은 있으나 본 연구의 삼출성 중이염 모형에서 basic fibroblast growth factor(FGF) mRNA는 1시간부터 7일까지 일정하게 발현되었고, acidic FGF mRNA는 3∼6시간 동안만 발현되었으며(unpublished data), 면역적 실험적 삼출성 중이염에서 in situ hybridization으로 FGF의 발현을 관찰한 결과,17) basic FGF는 섬유아세포, acidic FGF는 백혈구에 발현되는 것으로 보고된 바가 있으므로 VEGF의 발현 시기와 ba-sic FGF의 발현 시기가 서로 다른 것은 섬유아세포에서 VEGF의 발현은 이루어지지 않는다고 추정할 수 있다. 저자들이 현재 진행하고 있는 VEGF mRNA의 in situ hybr-idization의 결과가 이러한 의문점을 향후 해결할 수 있을 것으로 생각된다.
내독소는 이차적으로 염증 매개체를 통해 중이 점막에서 VEGF 발현을 증가시킬 수도 있다. 내독소는 염증세포들 중 특히 대식세포와 혈소판을 활성화시키는 것으로 알려져 있는데, 대식세포는 VEGF를 생산하는 주요 세포로 실험적 삼출성 중이염의 중이 점막에서 대식세포의 출현은 비교적 초기에 관찰되기 때문에 VEGF의 발현과 관련이 있을 수 있다.18) 최근 VEGF의 발현은 생체외(in vitro)에서 혈소판에 의해서 생산되는 것으로 보고되었으며,19) 이에 대한 연구는 아직 초보적이기 때문에 삼출성 중이염에서의 역할을 추정하기에는 이르다. 그러나 혈소판에서 발현되는 transforming growth factor(TGF)-β는 삼출성 중이염 형성의 중요한 조절인자 중의 하나이며, TGF-β에 의하여 VEGF 발현이 상향조절 되는 것으로 보고19) 되고 있기 때문에 이에 대한 연구는 VEGF 발현의 조절기능을 이해하는 데 도움이 될 것으로 생각된다.
이 연구 결과에서 내독소 투여 후 분비형의 VEG164와 VEGF120은 비교적 비슷하나 VEGF120의 발현이 1.34±0.27배 많았으며, 인체의 삼출성 중이염에서도 VEGF121의 발현이 더 많다(unpublished data). 이 결과는 중이 점막내의 VEGF 교대성 접합절단의 발현 양성은 심장, 폐, 뇌, 신장 같이 VEGF188 또는 VEGF164가 우세하게 발현되는 기관과는 다른 양상이기 때문에 VEGF mRNAs의 생성 과정이 병변의 특성에 따라 다르다고 추정할 수 있으며, 이의 생리학적 기능도 다름을 예측할 수 있다.13) 또한 장액성 중이염에서 점액성 중이염으로 변함에 따라서 VEGF splicing variants 발현 양상은 점액성 중이염 같은 만성 염증에서는 변화할 수도 있을 것이다. 인체에서 VEGF는 혈관 투과성을 증가시키고, 혈관내피세포에 의하여 collagenase의 생산을 자극하며, 맥관 형성에 의하여 내피 기초막의 단백질 분해 파괴를 통한 단백질 일혈(extravasation)이 일어남으로써 혈장 단백이 혈관 주변으로 유출되게 된다.20) 이는 중이강의 삼출액에서 혈장 단백질이 관찰되는 이유를 설명할 수 있는 중요한 기전으로 해석될 수 있으며, 만성 중이염의 염증에서 이러한 작용은 더욱 증진될 수 있고, 이러한 조절능력의 변화는 VEGF164와 VEGF120의 형태와 관련이 있을 수도 있다고 생각된다.
결론
저자들은 혈관 투과성이 가장 강력한 것으로 알려진 VE-GF가 장액성 삼출성 중이염에서 저류액을 생성하는 주된 물질일 수 있다는 가정하에 흰쥐에서 내독소로 삼출성 중이염을 유발하여 VEGF mRNA의 발현량을 반정량적 RT-PCR로 관찰한 결과로, 흰쥐의 중이강 내에 내독소를 투여하면 VEGF164와 VEGF120과 같은 분비 형태의 VEGF mRNAs가 내독소 투여 1시간 후부터 발현되고, 중이 점막의 염증 반응이 증가함에 따라 발현량이 증가하며, 염증 반응의 소실과 더불어 발현이 감소함을 알 수 있었다. 이는 삼출성 중이염에서 장액성 저류액의 생성기전을 밝히는 중요한 자료로 생각되며, 향후 인체 삼출성 중이염에서 VEGF mRNA의 발현, VEGF 단백농도, 중이점막에서의 VEGF 발현 부위, 중이점막의 VEGF 발현의 조절을 연구함으로써 삼출성 중이염에서 장액성 저류액의 발생기전을 밝히고 향후 치료방침을 정하는데 중요한 지침이 될 것으로 생각된다.
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