| Effect of Interleukin-4 and Histamine on the Fibroblast in the Nasal Mucosa of Allergic Rhinitis and Non-Allergic Rhinitis. |
| Sung Wan Kim, Joong Saeng Cho, Jai Kyung Park, Chang Il Cha, Kwang Il Kim |
1Department of Otolaryngology, Kangnam General Hospital, Public Corporation, Seoul, Korea.
2Department of Otolaryngology, College of Medicine, Kyunghee University, Seoul, Korea.
3Laboratory of Immunology, College of Medicine, Kyunghee University, Seoul, Korea. |
| Interleukin-4와 히스타민이 알레르기성 비염과 비알레르기성 비염에서 비점막 섬유아세포에 미치는 영향 |
| 김성완1 · 조중생2 · 박재경3 · 차창일2 · 김광일1 |
| 지방공사 강남병원 이비인후과1;경희대학교 의과대학 이비인후과학교실2;면역학 연구실3; |
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| 주제어:
섬유아세포ㆍ알레르기성 비염ㆍInterleukin-4ㆍ히스타민. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Fibrosis of the subepithelial layer is a characteristic finding in chronic allergic rhinitis. Heterogeneity of the fibroblasts in the nasal mucosa was already clarified and a different response of the fibroblasts can be expected from various stimulations occurring within the mucous membrane of the nose. The aim of this study was to investigate the characteristics of fibroblasts in differentiation and function of fibroblasts in allergic mucosa of the nose.
MATERIALS AND METHODS:
Using the 3rd passage of fibroblasts taken from the inferior turbinates of allergic and non-allergic patients, we measured the proliferative potential by comparing cell growth in the culture system of fibroblasts, and calculated the doubling time and the percent change. We also compared the production of stem cell factor (SCF) and granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) after stimulation with interleukin (IL)-4 and/or histamine. Morphologic differences were examined by transmission electron microscopy.
RESULTS:
In the case of non-stimulated fibroblasts, proliferation was prominent in the non-allergic group (NAG).
However, the proliferation was remarkably increased in the allergic group (AG) on day 6 when the fibroblasts were stimulated with IL-4 and/or histamine. On the production of GM-CSF, both non-stimulated and histamine stimulated fibroblasts were more prominent in the AG than in the NAG, and the production of SCF in the AG was similar to that in the NAG in the non-stimulated fibroblasts. Also, the production of GM-CSF and SCF were remarkably increased in the AG on day 4 after histamine stimulation. Morphologic differences were demonstrated between the AG and the NAG.
CONCLUSION:
These results suggest that IL-4 could be involved mainly in promoting the proliferation of allergic fibroblasts in the exponential period, and the production of GM-CSF and SCF could be remarkable in the early stage of the culture period by histamine stimulation. |
| Keywords:
FibroblastㆍAllergic rhinitisㆍInterleukin-4ㆍHistamine |
서론
비점막 상피는 섬모 원주세포, 배세포, 무섬모 원주세포, 기저세포 등으로 구성되어 이들 세포들은 고르게 분포되어 있고, 각 세포들은 고유기능을 유지하고 있다. 그러나 알레르기성 비점막에서는 이런 균형이 붕괴되면서 배세포의 증가, 섬모세포의 손실, 선세포의 비후, 비만세포 및 호산구의 증가, 혈관의 투과성 증가 등의 각종 변화가 초래된다. 이런 변화는 알레르기성 비염이 만성화 되면서 점막하 부위 즉 고유층이 섬유화되어 점막 자체의 비가역적 비후가 일어나게 된다.1) 섬유아세포는 인체내에서 몇가지 기능을 가진 것으로 알려져 왔다. 조직의 구조를 유지하고, granulocyte macrophage-colony sti-mulating factor(GM-CSF),2) stem cell factor(SCF)3) 등의 여러 가지 물질을 생산하고, IL-1,2) IL-4,2) transforming growth factor(TGF)-β,2) tumor necrosis factor(TNF)-α,2) 히스타민5) 등의 물질에 반응하며, 세포간극(intercellular space)에서 콜라겐을 충만케하는 것 등이다.
실제로 알레르기성 비염은 계속적인 항원의 자극으로 인하여 비만세포와 호산구가 연속적으로 침윤하게 되고 이에 따라 IL-4와 히스타민은 비점막에 연속적으로 공급된다. 그러나 이들 물질에 대한 비점막 섬유아세포의 반응에 대해서는 연구되어 있지 않다. 이에 저자는 알레르기 반응에서 비점막 섬유아세포의 상태와 IL-4 및 히스타민으로 자극한 섬유아세포의 기능을 조사해 보고자 본 연구를 고안하였다.
재료 및 방법
재료
알레르기 피부단자 검사를 통하여 진단된 알레르기성 비염 환자와 비알레르기성 비염환자 각 각 5명의 비점막을 하비갑개 수술시 채취하여 penicillin과 streptomycin 용액에서 5분간 소독한 뒤 1 mm3 크기로 절단하여 배양용 접시에 1 cm 간격으로 놓고 5분간 실온에서 유착시킨 후 배양액 Dulbeco's Modified Eagle's medium (DMEM)(Gibco, Grand Island, N.Y.)과 10% FBS(fetal bovine serum)을 첨가하여 배양하였다. 단층을 형성하면 배양액을 제거한 후 phosphate buffered saline(PBS)로 세척하고, 0.05% trypsin-0.02% ethylene diamine tetraacetic acid(EDTA)로 37℃에서 5분간 처리하여 세포들을 분해하였다. 그 후 분해된 세포를 얻어 다시 2% FBS와 DMEM액을 넣은 상태에서 배양하였다. 이들 알레르기성 비염군(AG)과 비알레르기성 비염군(NAG)에서 얻어진 섬유아세포를 계대 배양하여 3세대 배양 섬유아세포를 이용하여 다음과 같이 실험하였다.
방법
세포수와 증식양상의 측정
배양된 세포를 6×10 4개/mL로 분주하여 24시간 동안 세포를 유착시킨 후 배양액을 교체하고 각종 자극을 가한 후 배양 2, 4, 6일째에 세포수를 Trypan blue 염색으로 살아있는 세포만을 측정하여 세포의 성장 양상을 비교 관찰하였다. 자극은 양 군에서 히스타민(10 -7mol/L, Immunotech, 1608 Larrabee Road, Westbrook-Maine 04092), IL-4 (10 ng/mL, R & D, Minneapolis, MN 55413, U.S.A), 그리고 히스타민과 IL-4로 같이 자극하였고 아무 자극을 가하지 않은 경우도 있었다. 증식양상은 산술적으로 배수기(doubling time)를 측정하였고 자극물질에 따른 세포수의 변화를 무자극시와 비교하여 percent change로 계산하였는데, 배수기는 배양상의 exponential phase에서 세포농도가 Log함수로 2배가 되는데 걸리는 시간이고 percent change는 배양 6일째 각 각의 자극에 의한 세포수의 증가분을 자극을 하지 않은 경우의 세포수로 나눈 백분율이다.
SCF와 GM-CSF의 측정
3차 계대배양된 세포를 배양하면서 부유액에서 배양 4일째와 6일째에 SCF와 GM-CSF의 생산양을 ELISA 방법(R & D, Minneapolis, MN 55413, U.S.A)을 사용하여 양 군에서 측정하였고, 산술적으로 섬유아세포 10 5개 당 SCF와 GM-CSF의 분비량을 계산하였다.
투과 전자현미경을 통한 형태학적 비교
대조군과 IL-4로 자극한 군에서 얻어진 세포를 2.5% glutalaldehyde에 고정하고 증류수로 세척한 다음 OsO4로 부고정하고 다시 세척해낸 후, alcohol을 50%에서 100%까지 사용하여 점진탈수 시킨 다음 propylene oxide로 처리하여 포매하였다. 얻어진 검체를 microbrade로 절개한 후 uranyl acetate와 lead citrate로 이중염색(double staining)하여 투과 전자현미경(HS-9, Hitachi)으로 관찰하였다.
이상의 결과들은 student t-test로 통계처리하여 알레르기 군과 비알레르기 군 상호간의 비교에 사용하였다.
결과
세포수와 증식 양상
자극을 하지 않은 섬유아세포수(10 5개)는 NAG에서는 배양 2일째 2.24±0.33, 배양 4일째 8.34±0.12, 배양 6일째 11.30±0.03 이었으며, AG에서는 배양 2일째 1.74±0.13, 배양 4일째는 7.02±0.95, 6일째는 9.30±0.28로 배양 4일째부터 NAG에서 더 많았다. 히스타민이나 IL-4로 자극한 경우 대부분 AG보다 NAG에서 세포수가 더 많았으며 IL-4로 자극한 경우 배양 6일째의 세포수에는 차이가 없었다. IL-4와 히스타민으로 같이 자극한 경우에는 배양 6일째 NAG보다 AG에서 살아있는 세포수가 더 많았다(Table 1). 따라서 IL-4는 AG와 NAG에서 세포성장과정 중 exponential phase에서 섬유아세포의 증식을 촉진하나 AG에서 그 역할이 더 저명한 것으로 나타났다.
세포의 6일째까지의 배수기를 산술적으로 구해보면 아무런 자극을 가하지 않은 경우와 히스타민으로 자극한 경우에서는 AG보다 NAG에서 빠르게 나타나고 있으며, IL-4로 자극한 경우에서는 양 군이 비슷하였다. 한편 IL-4와 히스타민으로을 같이 자극한 경우에서는 NAG보다 AG에서 더 빠르게 나타났다(Fig. 1).
자극 물질에 따른 세포증식의 변화를 세포수의 percent change로 살펴보면 AG는 히스타민을 자극시 8.0%, IL-4를 자극시 41.8%, 히스타민과 IL-4를 자극시 36.6%의 증가를 보여 히스타민보다는 IL-4가 알레르기성 비염의 섬유아세포 증식에 더 영향을 미치는 것을 보여주고 있으며, NAG에서는 각 각에서 2.7%, 15.0%, 4.0%의 증가율을 보여 알레르기성 비염군에 비해 미미한 반응을 보였다(Fig. 2).
배양 기간 중의 세포수의 변화와 배수기를 비교하였을 때 알레르기성 비염의 섬유아세포와 비알레르기성 비염의 섬유아세포간에 서로 다른 성질을 가지고 있음을 알 수 있었다.
Cytokine 생산량
GM-CSF는 아무런 자극을 가하지 않은 경우 NAG보다 AG에서 배양 4일째와 6일째에서 모두 유의하게 생산량이 증가하였고, 히스타민으로 자극한 경우 AG에서는 무자극시에 비해 배양 4일째의 분비량이 현저하게 증가하였으며 NAG에서는 오히려 분비량이 약간 감소하였다. 한편 IL-4로 자극한 경우와 히스타민과 IL-4로 같이 자극한 경우에는 양 군 모두에서 분비량이 무자극시에 비해 감소하였으나 AG에서 더 많이 분비되는 양상을 보였다(Table 2).
SCF는 아무런 자극을 가하지 않은 경우 배양 4일째, 6일째에 NAG에서 분비량이 약간 많았으나 통계적 의의는 없었다. 히스타민으로 자극한 경우에는 GM-CSF와 마찬가지로 배양 4일째 AG에서 SCF의 분비량이 현저히 증가했으며, NAG에서는 오히려 약간 감소하였다. 한편 IL-4로 자극한 경우 양 군 모두에서 생산량이 감소하였고, IL-4와 히스타민으로 같이 자극한 경우는 무자극시 보다 NAG에서는 약간 더 많이 분비되었고, AG에서는 감소하였다(Table 3).
이 결과로 히스타민이 AG에서 GM-CSF와 SCF의 분비량을 조기에 증가시키고, IL-4는 양 군 모두의 섬유아세포에서 GM-CSF와 SCF의 분비를 억제하여 AG와 NAG의 섬유아세포간에 기능상의 차이가 있음을 알 수 있었다.
투과 전자 현미경 소견
NAG에서 무자극 섬유아세포는 핵의 압흔이 뚜렷하게 나타나고 세포질내에 미토콘드리아와 골기체 등으로 추정되는 electron dense material들이 많이 보였고, 내부에 분비물질을 함유한 공포(vacuole) 들도 많이 볼 수 있었다. IL-4로 자극한 경우에서는 electron dense material과 공포들이 감소하였으며, 핵의 압흔도 명확하지 않았다(Fig. 3).
한편, AG에서는 무자극 섬유아세포에 비해 IL-4로 자극한 경우 세포질내에 과립이 차있는 공포들이 증가하고 electron dense material들도 증가하는 소견을 보였다(Fig. 4).
이 결과로 자극이 없을 때는 NAG가, IL-4로 자극하였을 때는 AG가 더 활동적인 세포의 양상을 보여 증식속도의 변화에 걸맞는 소견이었으며 형태학적으로도 두 군의 세포가 서로 다른 성질을 가짐을 알 수 있었다.
고찰
히스타민과 IL-4는 알레르기성 비염의 초기염증반응을 매개하는 주된 매개물질로서 작용한다.6)7) 대부분의 히스타민은 비만세포와 호염기구의 세포질내의 과립에 이미 형성된 상태로 저장되어 있다가 여러 가지 자극에 의한 탈과립 현상시 분비되어 알레르기성 비염의 초기 반응에 작용하게된다. 히스타민의 주된 역할은 여러 가지 수용체를 통해 일어나게 되는데 혈관의 투과성을 증진시키고, 소양증과 프로스타글란딘 생성을 증가시키며, 기도에서는 평활근의 수축을 일으키는 작용을 하며, 혈관확장에 의한 빈맥, catecholamine의 분비를 촉진하는 역할을 하게된다.7) 히스타민의 비점막 섬유아세포에 대한 작용은 아직 잘 알려져 있지 않지만, 성인 폐조직의 섬유아세포에서는 H2 수용체를 통하여 섬유아세포의 증식을 유도하며5) 다른 cytokine과 같이 자극되었을 때 IL-11 생산을 촉진하는 것으로 되어있다.8) 본 실험에서 보면 히스타민은 알레르기성 비염의 섬유아세포에서 조기에 GM-CSF와 SCF의 분비를 촉진 시키고, 알레르기성 비염의 섬유아세포와 비알레르기성 비염의 섬유아세포 모두에서 섬유아세포의 증식에 관여하는 것으로 생각되었다.
IL-4는 비만세포와 T 림프구, 호산구와 호염기구에서 주로 생산되어 B 림프구와 T 림프구, 비만세포와 흉선세포의 증식과 분화를 자극하는 물질이다.6) 통년성 알레르기성 비염환자의 비점막 조직소견에서 IL-4 함유세포의 99∼100%가 비만세포이며 비만세포의 40∼100%가 IL-4 면역염색에 양성반응을 보이며 IL-4 양성 림프구는 관찰되지 않아 알레르기 반응의 초기에는 이미 형성되어 비만세포내에 저장되어 있던 IL-4가 바로 분비되지만9) 림프구에서는 알레르겐 자극 후 비로소 mRNA가 표현되어 IL-4가 생산되기 시작하므로10) 초기 알레르기 반응의 IL-4의 기능은 주로 비만세포의 작용이라는 것을 유추할 수 있다. 그러므로 본 실험에서 IL-4로 자극한 것은 초기 알레르기 반응에서 비만세포의 섬유아세포에 대한 반응을 보기에는 합당하다고 할 수 있겠다. 최근 IL-4의 섬유아세포에 대한 영향에 대해 연구된 바로는 피부경화증(scleroderma) 환자의 피부섬유아세포에서 콜라겐 생산을 증가시키고, 정상 피부 섬유아세포의 증식과 IL-6 생산을 증가시키며,11) ICAM-1의 발현을 조절하는 기능을 가진 것으로 보고되고 있으나12) 비점막의 섬유아세포에 대한 영향에 대한 보고는 없었다. 본 실험에서 IL-4는 비점막의 섬유아세포에서 알레르기성 비염의 섬유아세포의 성장을 증진시키는 양상을 보였으나 비알레르기성 비염의 경우 영향이 미약했으며, GM-CSF와 SCF의 분비는 두 물질 모두에서 오히려 약간 감소시키는 경향을 보였다.
본 실험에서 측정된 cytokine은 GM-CSF와 SCF로 이 두가지 물질은 모두 염증세포와 비만세포 등의 세포증식과 세포의 수명을 길게하므로 염증반응에서 만성화를 초래하는데 중요한 기능을 하는 것으로 되어있다.3)13)
먼저 GM-CSF의 경우 주로 단핵구, 내피세포, 섬유아세포 등에서 생성되며, 호산구의 수명을 연장하고, 단핵구와 호산구, 중성구의 분화를 촉진하며, 중성구와 단핵구에서 분비 생성되는 cytokine의 폭포(cascade)를 시작하는 물질이다.14) 본 실험에서 알레르기성 비염의 섬유아세포가 비알레르기성 비염의 섬유아세포보다 많은 양의 GM-CSF를 생산하고, 특히 초기 알레르기 반응의 매개물질인 히스타민에 반응하여 조기에 많은 양의 GM-CSF를 분비하는 소견을 보였다. 이는 알레르기성 비염의 섬유아세포가 비알레르기성 비염의 경우보다 염증반응에서 주작용을 하는 세포들을 조기에 분화시켜 염증반응을 만성화 시킬 수 있는 가능성을 시사하는 소견으로 생각할 수 있다.
한편, SCF는 c-kit ligand라고도 불리우며 여러 조직으로부터 나오는 전구세포를 비만세포로 분화하고 성장시키는 주된 물질로서4) 예정된 세포사(cell death)를 억제하여 비만세포의 수명을 연장시키며, 미분화된 비만세포의 화학주성(chemotaxis)을 증진하고, 비만세포의 표현형(pheno-type)과 매개물질을 변화시켜 비만세포의 성숙에 영향을 준다.15)16) 본 실험에서는 알레르기성 비염과 비알레르기성 비염의 섬유아세포에서 비슷한 양의 SCF가 측정되었으나 히스타민 자극시 알레르기성 비염의 섬유아세포가 조기에 많은 양을 분비하였다.
형태학적 검사상 아무런 자극이 없는 상태에서 활동성이 떨어지는 듯이 보이던 알레르기성 비염의 섬유아세포가 IL-4를 자극 시 세포소기관들과 과립이 증가한 양상을 보이는 것은 알레르기성 비염의 섬유아세포가 비알레르기성 비염의 섬유아세포보다 IL-4의 자극에 더 잘 반응하는 것을 보여주는 소견이라 할 수 있겠다.
1960년대 초 피부, 관절 조직, 골막 등의 섬유아세포의 배양에서 서로 다른점들이 보고된 이후로17) 많은 저자들이 서로 다른 해부학적 부위에서의 섬유아세포의 이형질이 있음을 보고하고 있다.17)18) 후안부와 경골전부의 섬유아세포에서 Interferon-gamma로 자극한 경우 배부 섬유아세포보다 HLA-DR의 발현이 현저하다는 것이 증명되었다.18) 또한 같은 해부학적 부위에서의 상태에 따른 섬유아세포의 이형질도 여러 저자들에 의해 보고되었는데 그 예로 중력 침전(gravity sedimentation)에 의해 사람의 폐 섬유아세포에 다른 두 군이 있음이 증명되었다.19) 형태학적 아군(subset)에 대한 보고도 있어 태아 폐조직의 섬유아세포인 WI-38 세포에서 세포모양, 핵의 형태, 세포체들의 위치를 이용하여 아종(substrain)이 있음이 증명되었다.20) 그러나 비점막 섬유아세포의 이형질에 대한 연구는 미미한 실정이다. 본 연구에서 배양일에 따른 세포수와 증식양상의 차이, cytokine 분비량의 차이와 형태학적 차이를 통해 비점막 섬유아세포에서 질환에 따른 차이가 있음을 알 수 있었다. 알레르기성 비염에서 IL-4는 섬유아세포 증식에 주된 역할을 하고, 알레르기 비점막에서 분비되는 히스타민은 섬유아세포를 자극하여 GM-CSF와 SCF의 분비를 유발하면서 만성화를 촉진할 것으로 사료된다.
결론
저자들은 알레르기성 비염과 비알레르기성 비염환자의 비점막으로부터 배양된 섬유아세포에서 아무런 자극이 없는 경우와 히스타민과 IL-4를 자극한 경우의 증식양상과 GM-CSF와 SCF의 분비량을 측정하였는데, 증식양상은 아무 자극이 없는 상태에서는 비알레르기성 비염의 섬유아세포가 알레르기성 비염의 섬유아세포에 비해 더 잘 자라는 양상을 보였으나, IL-4 자극시는 알레르기성 비염의 섬유아세포가 더 빨리 증가하였고, 히스타민 자극에는 두 군 모두 증식속도가 비슷하게 증가하였다. 또한 GM-CSF는 알레르기성 비염의 섬유아세포에서 훨씬 많이 생산되었으며, 히스타민을 자극한 경우 그 생산량이 조기에 증가하는 것을 볼수 있었고, SCF는 무자극시는 양 군간에 별 차이가 없었고, 히스타민으로 자극시 알레르기성 비염군에서 조기에 생산량이 증가하는 것을 볼 수 있었다. 한편 IL-4는 두 군 모두에서 GM-CSF와 SCF의 분비를 억제하는 양상을 보였다. 형태학적 조사는 IL-4로 자극한 경우 알레르기성 비염군의 섬유아세포가 electron dense material과 과립을 가진 공포의 증가를 보였다. 따라서 알레르기성 비염에서 IL-4는 섬유아세포 증식에 주된 역할을 하고, 알레르기 비점막에서 분비되는 히스타민은 섬유아세포를 자극하여 GM-CSF와 SCF의 분비를 유발하면서 만성화를 촉진할 것으로 사료된다.
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