Expression of RANTES mRNA in Early Recurrent Nasal Polyps.

Jung, Hak Hyun; Kim, Young Ho; Lee, Sang Duk; Park, Jae Hoon

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 42(1); 1999 > Article

Original Article

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1999;42(1): 47-53.

Expression of RANTES mRNA in Early Recurrent Nasal Polyps.

Hak Hyun Jung, Young Ho Kim, Sang Duk Lee, Jae Hoon Park

¹Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Korea University College of Medicine, Seoul, Korea. hakjung@netsgo.com
²Hana Nose Institute, Seoul, Korea.

재발성 비용에서 RANTES mRNA의 발현

정학현¹ · 김영호¹ · 이상덕² · 박재훈²

고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실1;하나 이비인후과2;

주제어: 비용ㆍRANTESㆍRT-PCRㆍ호산구

ABSTRACT

BACKGROUND AND OBJECTIVES:
RANTES is a powerful chemotactic and activating factor to some inflammatory cells including eosinophils, which represent the most abundant cell type among the numerous cellular infiltrates of nasal polyps. RANTES may have an important role in the recruitment of inflammatory cells during the development of nasal polyps. The purpose of this study is to investigate RANTES mRNA expression in nasal polyps, ethmoiditis mucosa and in the early recurrent nasal polyps in order to identify its role as a chemoattractant in recurrent nasal polyps. MATERIALS: Tissue samples of nasal polyps, ethmoiditis mucosa, and early recurrent nasal polyps were obtained from an endoscopic sinus surgery. For these samples, light microscopic examination for histopathology and RT-PCRs for RANTES mRNA expression were performed. Three normal ethmoidal mucosa and four hypertrophied inferior turbinates were also evaluated.
RESULTS:
Tissue infiltration of eosinophils observed under the light microscope was in the following order: early recurrent nasal polyps (91%), nasal polyps (60%), and ethmoiditis mucosa (40%). About 97% of early recurrent nasal polyps showed RANTES mRNA expression, but nasal polyps and ethmoiditis mucosa showed 60% and 56% of expression rates.
CONCLUSION:
The results suggest that RANTES may play an important role in the development of early recurrent nasal polyps undergoing active inflammatory reactions and the recruitment of some inflammatory cells including eosinophils. Further investigations for other chemokines related to eosinophils will provide better understanding of the mechanism in the formation of nasal polyps.

Keywords: Nasal polypㆍRANTESㆍRT-PCRㆍEthmoiditis

서론 비용은 비과학 영역의 흔한 질환으로 그 원인과 병인은 아직 밝혀져 있지 않으나 두 가지 가설 즉, 염증이나 알레르기에 의하여 발생하는 것으로 생각되고 있으며, 그 외에 자율신경의 조절 장애, 탄수화물 대사 장애, 혈관 운동의 불균형, 기류 변화 등의 가설이 제시되고 있다.1) 그러나 알레르기에 의한 비용 발생에 대하여 다소 부정적 의견이 많으며, 염증 반응이 현재까지 비용의 형성에 가장 중요한 요인으로 생각되고 있다. 비용의 형성에서 염증 반응은 여러 염증 매개체와 cytokine이 관여하며, 비용에 침착된 염증세포, 비용의 구성 성분인 상피세포, 섬유아세포, 혈관내피세포 등에서 분비되는 cytokine은 세포분화를 촉진하며 조혈세포의 기능을 조절한다.2) 최근 면역학적 염증기전의 이해와 분자생물학적 기법의 발달과 더불어 염증세포들에 대하여 화학주성을 가지는 chemokine에 관심이 집중되고 있다. Chemokine은 특정세포에 대하여 화학주성을 가지는 cytokine으로 정의되며, 분자의 아미노산 구조에 따라 CXC, CC, C chemokine으로 분류된다. CXC chemokine은 두개의 cystein기 사이에 다른 아미노산 구조를 포함한 것으로 주로 다형핵 백혈구의 화학 주성에 관여하고, CC chemokine은 두개의 cystein기를 가진 것으로 림파구, 단핵구, 호산구(eosinophil) 및 호염기구(basophils)에 화학 주성을 가지고 있으며, C chemokine의 기능은 아직까지 잘 알려져 있지 않다.3) 비용은 국소적인 면역학적 반응과 염증 반응에 의하여 다수의 호산구가 관찰되는 것이 특징으로 이러한 호산구의 화학주성에 관여하는 chemokine을 밝히는 것은 비용의 병인을 이해하는데 중요하다.1)4) CC chemokine 중 유전자 염기서열이 알려져 있는 것은 현재까지 8가지이며, 그 중에서 호산구에 주로 화학주성을 가지는 것은 RANTES(regulated on activation, normal T expressed and secreted), eotaxin, MCP(monocyte chemoattractant protein) 등이다.3) RANTES는 T-림파구, 혈소판, 단핵구(monocyte), 섬유아세포에서 주로 분비되고, 기억세포(memory T lymphocyte), 단핵구 및 호산구에 화학주성을 가진다.3)5) RA NTES는 호산구를 활성화시키고, 히스타민(histamine)과 eosinophil cationic protein의 분비에 의하여 염증을 일으키며, 천식 환자에서 항원에 의한 감작 후 호산구의 침착이 RANTES의 발현과 관련이 있다고 하여 호산구 침윤에 RANTES가 관여하는 것으로 생각되었으나,6) 호산구의 침윤이 많은 비용과 호산구의 침윤이 적은 만성 부비동염의 점막에서 RANTES의 발현율은 차이가 없으며,7) 항원감작 24시간 후에 발생한 호산구 축적이 RANTES가 아닌 IL-5와 관련이 있다고 하여8) 아직 비용의 형성에서 호산구의 침착과 RANTES의 관계는 아직 명확하지 않다. 실험동물의 상악동에 균주를 주입하거나 이관을 폐쇄시켜 중이점막에 염증을 일으키면 상피세포층의 손상이 초래되어 재생과정을 거치면서 미세비용이 형성되지만,9) 이러한 실험적 비용은 인체의 비용과 형태학적으로 다른점이 많고, 인체에서와 같은 비용의 발생과정을 설명하기에는 미흡하다. 또한 인체에서 비용은 술후 재발이 잦으며 초기에 재발된 비용을 처치하지 않고 그대로 두면 점차 커진다. 술후 재발된 초기 비용의 형성과정을 이해하고 또한 초기 비용에서 호산구의 침착과 RANTES mRNA의 발현을 관찰하는 것은 호산구와 RANTES의 관계를 이해하고 RANTES의 역할을 이해하는 데 도움이 될 것으로 생각된다. 따라서 본 연구의 목적은 수술 후 재발한 초기 재발성 비용의 조직, 비용 조직, 후사골동염 점막 조직에서 RANTES의 발현율을 reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT- PCR)을 이용하여 관찰하는 데 있다. 대상 및 방법 연구재료 고려대학병원 이비인후과 및 하나 이비인후과에서 부비동염 및 비용으로 진단받고 내시경하 부비동 수술 또는 비용 절제수술을 시행받은 16명의 환자에서 15측의 비용 조직과 16측의 후사골동염 점막 조직을 채취하였고, 내시경하 부비동 수술후 10일에서 60일이내(평균 23일)에 비용이 재발된 32명의 환자에서 재발성 비용 조직 32측을 채취하였다. 재발된 비용 환자 중에서 4명(번호 1, 8, 25, 29)은 피부검사나 혈액검사를 통하여 비알레르기가 확인되었다. 환자의 연령은 15세부터 58세이었으며, 평균연령은 38세이었다. 대조군으로는 비용과 전사골동염으로 기능적내시경 수술시 후사골동 점막이 비교적 정상적으로 보이는 3명의 환자에서 3측의 후사골동의 전방 점막조직의 일부(0.5×0.5 cm)를 겸자로 채취하였고, 비중격교정술시 약간 비후된 하비갑개 조직 4측을 하비갑개절개술을 통하여 채취하였다. 조직은 광학현미경검사를 위하여 일부를 10% buffered neutral formalin액에 고정하였고, 일부는 분자생물학적 연구를 위하여 즉시 -70℃에 보관하였다. 연구방법 광학 현미경의 조직표본 제작 비용 10측, 후사골동염 점막 10측, 초기 재발성 비용 11측, 정상 후사골동 점막 3측 및 비후된 하비갑개 4측에서 광학 현미경 조직 표본을 제작하였다. 조직은 10% buffered neutral formalin액에 24시간 동안 고정시킨 다음 흐르는 물에 세척 후 80% 이상의 알콜로 3∼4시간에 걸쳐 단계별로 농도를 높여가며 탈수한 뒤 파라핀 절편을 작성하였다. Hematoxylin-Eosin염색을 시행하여 광학 현미경하에서 관찰하였고, 상피하 부위 3곳에서 400배의 배율하에서 호산구수를 측정하였다. 전체 RNA의 추출 전체 RNA(total RNA)를 추출하기 위하여 각각의 조직에 TRI ZOL Reagent(Life Technologies, Gaithersberg, MD USA)를 첨가하여 glass homogenizer로 균질화시키고 chloroform(Sigma Chem. Co., St. Louis, MO USA)으로 혼합하고 14,000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리한 후 상층액에 isopropanol을 첨가하여 14,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하여 상층액은 제거하고 남은 침전물에 DEPC-treated water 50 μl로 녹인 후 농도 및 순수도를 측정하여 이용하였다. Reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR) 전체 RNA(total RNA) 0.5 μg에 oligo dT primer와 MMLV 역전사효소(molohey murine leukemia virus reverse transcriptase, Life Technologies, Gaithers-berg, MD USA)를 첨가하여 전령 RNA(mRNA)를 cDNA로 역전사시키고, 그중 일부를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 시행하였다. RANTES primer와 대조군(internal control)으로 사용한 β-actin primer의 염기서열은 Table 1과 같으며, 예상되는 중합효소 연쇄반응 산물의 크기는 196 bp와 334 bp 이었다. PCR에는 Gene Amp PCR system 2400(Perkin Elmer)을 사용하였으며, 95 ℃로 30초간 변성시킨 후 반응조건은 95℃ 30초, 58℃에서 30초, 72℃ 1분 30초로 총 35 cycle을 시행하였다. 양성 대조군으로는 RANTES와 β-actin 각각이 pGEM-T Easy vector(Promega, Medison, WI USA)에 함유된 plasmid DNA 1ng을 사용하였고, 음성 대조군으로 cDNA대신 dH2O를 사용하였다. PCR로 증폭된 산물은 2% agarose gel에 ethidium bromide로 염색한 후 자외선 투사기로 관찰하고 폴라로이드 카메라로 촬영하였다. PCR로 증폭된 산물의 일부에서 pGEM-T Easy vector에 연결한 후 automated sequencer로 염기서열을 관찰하였다. PCR로 증폭된 산물을 확인하기 위하여 nested PCR을 이용하였으며, 각각의 염기서열은 Table 1과 같으며, 그 크기는 RANTES 147bp, β-actin 253 bp 이었다(Fig. 1, Table 1). 연구자료 분석 통계학적 분석은 student t-test를 이용하였으며 p값이 0.05 이하인 경우를 통계학적으로 유의성이 있는 것으로 하였다. 결과 광학 현미경 소견 비용의 상피하에서 400배 현미경으로 관찰한 호산구수의 평균은 9.3±8.6이었고, 호산구수가 10개 이상 관찰된 조직이 10측 중 5측, 3∼9개 사이가 1측, 3개 미만이 4측이었다. 후사골동염 점막에서는 10측 중 4측에서 10개 이상의 호산구 침윤을 나타냈으며, 나머지 6측에서는 호산구의 침윤이 관찰되지 않았고, 호산구의 침윤이 있는 조직은 부종이 관찰되었으나 호산구의 침윤이 없는 조직은 부종이 관찰되지 않았다(Fig. 2). 초기 재발성 비용 11측에서 호산구수는 평균 7.6±7.5이었고, 10개 이상 관찰된 것이 4측, 3∼9개 사이가 6측, 호산구가 침윤되지 않은 것이 1측이었다. 정상 후사골동 점막 3측에서는 호산구의 침윤이 관찰되지 않았으며, 비후된 하비갑개 조직에서는 4측 중 1측에서 10개 이상의 호산구 침윤이 관찰되었고, 3측에서는 호산구의 침윤이 3개 미만이었다. 초기 재발성 비용은 광학현미경 소견에서 상피세포는 위중층 원주섬모세포(psuedostratified ciliated columnar epithelium), 편평 상피화(squamous metaplasia) 및 배세포 증식(goblet cell hyperplasia)의 소견을 보였고, 일부 조직에서는 상피하 부종이 관찰되었으나 일부 조직에서는 상피하 부종이 적었다. 세포 침윤도 비용에서와 같이 호산구, 림파구, 형질세포(plasma cell) 등이 주로 관찰되었다(Fig. 3). RANTES의 중합효소 연쇄반응 결과 15측 비용 조직중 9측(60%)에서 RANTES mRNA가 발현되었고, 후사골동염 점막조직은 16측 중 9측(56%)에서 발현되었으나, 초기 재발성 비용조직은 32측 중 31측(97%)에서 관찰되어 발현율이 높았다(p<0.05, Fig. 4)(Table 2). 대조군으로 정상 사골동 점막조직은 3측 모두 RANT ES mRNA가 발현되지 않았으나 비후된 하비갑개 조직은 4측 중 2측(50%)에서 발현되었다(Fig. 4). Nested PCR에서 모두 RANTES와 β-actin이 확인되었으며, β-actin의 발현은 실험군 및 대조군 모두에서 관찰되었고, 중합효소 연쇄반응시 함께 시행한 RANTES와 β-actin은 양성 대조군 모두에서 관찰되었으나 음성 대조군에서는 나타나지 않았다. RANTES와 β-actin의 PCR산물, nested PCR산물의 염기서열은 보고된 염기서열(RA NTES gene accession number M21121, β-actin gene accession number M10277)과 동일하였다. 고찰 본 연구 결과에서 초기 재발성 비용의 약 97%에서 RA NTES mRNA가 발현되었으나 비용에서는 60%, 후사골동염 점막에서는 56%가 발현되어 초기 재발성 비용에서 RANTES 발현률이 현저히 높았다(p<0.05). 이는 재발성 비용의 초기 병인에 RANTES가 직접적으로 관여하여 염증세포들을 불러들이며, 이러한 염증세포들에 의한 염증반응이 이루어지고 있음을 예측할 수 있다. RANTES는 T-림파구, 거대세포, 섬유아세포, 혈소판 뿐 아니라 호흡기 점막 즉, 기관지 점막 상피세포, 비점막 상피세포(nasal epithelial cells) 및 분비선 상피세포에서 생성되며,10)11) 생체외 실험(in vitro)에서 tumor necrosis factor(TNF)-α와 interferon(IFN)-γ, IL-1β, 내독소(lipopolysaccharide) 등이 RANTES 의 발현을 상향조절(up-regulation)하고, IL-4와 IL-13등이 하향조절(down-regulation)한다.10-13) 따라서 RANTES는 염증반응에 의하여 발현되고 조절되므로 초기 재발성 비용의 형성에서 RANTES가 어떠한 세포의 침윤에 관여하는지는 중요하다. 본 연구 결과로 RANTES의 발현률이 호산구의 침윤순서, 즉 초기 재발성 비용 조직(11측 중 10측, 91%), 비용 조직(10측 중 6측, 60%), 후사골동염 점막조직(10측 중 4측, 40%) 순으로 관찰되는 것과 유사함으로써 RANT ES의 발현은 점막의 호산구 침윤과 밀접한 관련이 있을 것으로 생각할 수 있다. 호산구에 강력한 화학주성을 가지는 chemokine으로는 RANTES, eotaxin, MCP(monocyte chemoattractant protein)-3, MCP-4 등이 있으나, 최근 저자들은 재발성 비용에서 eotaxin과 MCP(monocyte chemotactic protein)-3의 발현을 관찰한 결과 재발성 비용에서 현저히 발현양 및 발현률이 적었으며, 이러한 소견은 RANTES가 재발성 비용의 호산구 침윤에 일차적으로 관여하는 것으로 추정할 수 있고, RANTES가 호산구의 침윤에 밀접한 관계가 있다는 보고와 일치한다.3)6)11) 그러나 초기 재발성 비용의 조직은 림파구와 형질세포(plasma cell)의 침윤도 많으므로 RANTES가 다른 세포의 화학주성에 관여할 수도 있다. 본 연구에서는 림파구의 형태를 구분하지 않았고, 단핵구의 침윤도 관찰하지 않았기 때문에 RANTES가 다른 세포의 화학주성에 관여하는 지에 대하여는 결론지을 수 없으며, 이에 대하여는 추후 면역조직화학적 방법으로 규명하고자 한다. 최근의 보고에 의하면 RANTES의 호산구에 대한 화학주성에 의문이 제기되고 있다. 즉, 재조합 인체 RANTES 유전자(human recombinant RANTES)를 개의 피부에 주사하면 호산구와 거대세포의 침윤이 관찰된다는 보고도 있으나,14) 재조합 인체 또는 기니픽 RANTES 유전자(recombinant guinea pig and human RANTES)를 기니픽에 주사하면 호산구는 침윤되지 않고 거대세포만 침윤된다고 하였고,15) 재조합 RANTES 유전자는 거대세포와 memory T cell의 침윤을 초래한다는 보고도 있다.16) 그러나 이러한 재조합 유전자는 구성 성분에 있어서 RAN TES의 형태를 전부 포함하지 않고 있기 때문에 인체에서의 작용과 차이가 있을 수 있으며, 또한 종(species)간에도 차이가 있을 수 있다. RANTES는 호산구의 화학주성 외에 단핵구(monocytes), CD4＋memory T cell에 대하여도 화학주성이 있으며,5) CD45RO＋CD4＋T cell은 항원에 노출시 그 발현이 증가하여 알레르기성 염증(allergic inflammation)에서 증가하고, 알레르기성 비염의 점막에서도 증가하는 것으로 알려져 있다.17) 따라서 초기 비용에서 무수히 많고 다양한 박테리아 항원에 대한 면역반응으로 RANTES에 의한 CD45RO＋CD4＋T cell의 화학주성이 일어나서 Th 세포로의 분화를 초래할 수 있을 것으로도 가정할 수 있으며, 이것이 Th1이나 Th2에 의한 cell mediated immunity나 humoral immunity에 관여하는가는 향후 중요한 연구과제 중 하나이다. 최근 이에 대한 연구로 비용에서의 IFN-γ가 알레르기 비점막보다 증가하고, IL-4와 IL-5는 큰 차이가 없다는 연구가 있어서18) 비용에서 Th1세포의 증가 가능성을 시사하고 있으나, 좀 더 명확한 정량적 연구방법이 필요할 것으로 생각된다. 초기 재발성 비용은 향후 비용의 병인을 연구하는 데 좋은 재료로 쓰일 수 있다. 초기 재발성 비용은 광학현미경 소견에서 형태학적으로 비용과 유사하며, 부비동 내시경수술 후 재생과정에서 일어나는 육아종성 폴립은 단층의 세포로 구성되어 있고, 재생과정에 발생하는 점막은 섬유층이 단단한 결합을 이루고 있고, 다형핵백혈구의 침윤이 많으며, 호산구의 침윤이 관찰되지 않는다.19) 그러나 술 후 일시적으로 발생하는 점막 부종과의 구분은 어려우며, 본 연구조직은 내시경하에서 돌출된 비용의 형태를 이룬 조직을 대상으로 하였고, 외적 소견에서 점막 부종의 형태를 보인 조직은 제외하였다. 최근 생체외 실험에서 호산구의 침윤으로 비점막 상피세포의 RANTES발현을 하향조절한다고 보고되었는데,20) 이는 비용의 형성에서 RANTES의 발현으로 호산구가 침착되고 이는 다시 negative feedback으로 RANTES발현을 억제할 수 있다고 가정할 수 있으나 비용에서의 지속적인 호산구의 침윤을 설명하기에는 어렵다. 본 연구는 RT-PCR을 이용하여 RANTES mRNA의 발현과 호산구의 침윤과의 관계를 확인하여 그 역할을 규명하려 하였으며, 현재 각 조직에서 발현되는 RANTES mRNA의 양을 정량화하는 competitive PCR을 시행하고 있고, 이는 비용의 형성에서 RANTES의 역할과 RANTES mRNA의 발현을 억제할 수 있는 인자나 조절기능의 연구가 향후 가능할 것으로 생각된다. 결론 초기 재발성 비용 조직의 RANTES mRNA의 발현율은 97%, 비용은 60%, 후사골동염 점막은 54%이었다. 이는 초기 재발성 비용의 형성에 RANTES가 세포의 화학주성에 관여하며, 초기 재발성 비용의 조직에서는 호산구와 림파구의 침윤이 주로 관찰됨으로써 RANTES 발현은 호산구의 침윤에 관여할 것으로 생각되었다.
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