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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1997;40(6): 861-868. |
| Expression of TGF-alpha, p53 and PCNA in Laryngeal Dysplasia. |
| Jong Ouck Choi, Kyung Hyun Kim, Keun Chung, Keon Choi, Bom Woo Yeom, Heon Ki Min |
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, Korea University, Seoul, Korea.
2Department of Pathology, College of Medicine, Korea University, Seoul, Korea.
3Department of Otolaryngology, College of Medicine, Hallym University, Seoul, Korea. |
| 후두 이형성증에서 TGF-α, p53과 PCNA의 발현양상 |
| 최종욱1 · 김경현1 · 정 근1최 건1 · 염범우2 · 민헌기3 |
| 고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실1;병리학교실2;한림대학교 의과대학 이비인후과학교실3; |
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| ABSTRACT |
BACKGROUND:
Transforming growth factor(TGF-alpha) is a polypeptide which is structurally related to epidermal growth factor(EGF) and binds to the epidermal growth factor receptor(EGFR). TGF-alpha utilizes EGFR to increase the activation of tyrosine kinase to involve in signal transduction of cellular growth. TGF-alpha synthesis occurs in a variety of neoplastic cells. p53 is a tumor-suppressor gene. There is a strong corrleation between immunohistochemical p53 positivity and p53 mutations in lung and laryngeal carcinoma. PCNA is expressed by cycling cells in late G1, S and G2 phase, and may be used to indicate the degree of cellular proliferation.
OBJECTIVES:
To evaluate whether TGF-alpha, p53 and PCNA can be used as an indicator to malignant transformation of dysplasia in larynx or not.
MATERIALS AND METHODS:
The authors investigated the TGF-alpha score, p53 immunoreactivity and PCNA proliferating index by immunohistochemical staining in 30 laryngeal dysplasia from 1992 to 1995.
RESULTS:
Dysplasia with malignant transformation showed values of 5.46 for TGF-alpha, 29.2 for PCNA proliferating index and 37.5 for p53 immunoreactivity. Dysplasia without malignant transformation showed values of 1.88 for TGF-alpha, 8.6 for PCNA proliferating index and 4.5 for p53 immunoreactivity.
Conclusion
s: The results suggest that TGF-alpha, p53 and PCNA could be an useful indicator to predict the progression of laryngeal dysplasia. |
| Keywords:
TGF-alphaㆍp53ㆍProliferating cell nuclear antigenㆍLaryngeal dysplasia |
서론
후두의 상피세포에서 발생하는 질환 중 전암성 병변으로는 상피이형성증 및 상피내암 등이 있으며, 이들은 진행하게 되면 침윤성암으로 전환하는 것으로 알려져 있다.1)
병리조직학적으로 경도의 이형성이 있는 경우에는 4%에서 침윤성 암종으로 전환되는 반면 고도 이형성의 경우 약 40%에서 침윤성암으로 전환되는 것으로 보고되고 있으나2), 종래의 병리 조직학적 방법만으로는 진단 및 임상경과 예측에 어려움이 따른다.
Transforming growth factor(TGF-α)는 세포의 종양성 전환에 관여하며 상피성장인자 수용체(Epidermal growth factor receptor, EGFR)를 매개로 하여 tyrosine kinase 활성도를 증가시켜 세포 증식에 관한 신호전달을 하는 성장인자이다. 이는 간세포암종, 난소암종, 폐선암종, 위암종, 갑상선암종 및 후두암종 등의 다양한 종양에서 인지되는 것으로 알려져 있다.3).
p53 유전자는 염색체 17번 단완에 위치하는 암억제 유전자로서 후두 편평상피암에서 이형성 세포가 양성으로 염색되었다는 점에서 p53의 발현이 침윤성 암종의 초기 변화라고 알려져있다. PCNA는 36kD의 nonhiston 핵단백으로 세포증식의 필수적인 물질로서 세포주기중 후기 G1부터 S기에 걸쳐 합성되며 PCNA 발현율이 높다는 것은 S기의 세포분핵이 많다는 것을 의미함과 동시에 향후 침윤성 암종으로 진행할 가능성이 높아진다는 것을 의미한다.4)
저자들은 임상적으로 후두 이형성증으로 진단받고 수술을 시행하였던 예들에서 이형성정도를 병리 조직학적으로 다시 분석하였으며, 이형성정도에 따른 TGF-α, p53 및 PCNA의 발현양상과 후두 이형성증에서 후두암종으로 전환시 TGF-α, p53 및 PCNA의 발현양상을 관찰함으로써 TGF-α, p53 및 PCNA가 후두 이형성증에서 후두암종으로 이행하는 예측인자로 이용할 수 있는가를 알아보고자 하였다.
연구재료 및 방법
1. 연구대상 및 재료
1992년부터 1995년까지 고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실에서 후두 각화증으로 후두미세수술을 시행 후 조직병리검사상 후두 이형성증으로 진단된 30례를 대상으로 하였다. TGF-α에 대한 양성대조군으로는 간암 조직을, p53 및 PCNA에 대한 양성대조군으로는 유방암 조직을 사용하였고, 음성대조군으로는 각기 정상 성대점막을 사용하였다.
2. 연구 방법
1) 조직학적 분류
생검조직 소견을 이형성 정도에 따라 분류하였다. 이형성의 정도는 세포학적 비정형 세포가 상피증을 차지하는 비율에 따라 3단계로 분류하였는데, 비정형 세포가 상피층의 하 1/3에 국한되어 있는 경우는 경도(mild) 이형성증, 상피층의 하 2/3을 차지하는 경우는 중등도(moderate) 이형성증으로, 상피층의 거의 대부분에서 이형성이 관찰되는 경우는 고도(severe) 이형성증으로 분류 하였다(Fig. 1).
2) TGF-α, p53 및 PCNA에 대한 면역조직화학염색
파라핀 포매 조직을 4-5μm 두께로 박절하고, 탈파라핀과 함수과정을 거친 후 이들을 메탄올-과산화수소용액(100% methanol 160ml＋30% H2O2 4cc)에 10분간 처치하여 세포내의 내인성 과산화효소의 활성화를 저지시킨 다음, PH 7.6의 Tris 완충액을 3분간 수세 후 정상 산양혈청을 가하고 실온에서 10분간 방치하였다. p53 염색을 시행할 스라이드는 PH 6.0 citric acid 용액에 잠기게 한 후 microwave oven에서 121℃로 15분간 가열하고 30분간 saponin 처리 후 면역조직화학적 염색을 하였다. 일차항체를 도포하여 4℃에서 하루밤동안 보관한후 Tris 완충액으로 수세하였다. 수세된 시료에 biotin과 결합된 항생쥐염소혈청을 가한 후 10분간 반응시키고, 재차 수세하여 avidin과 결합한 과산화효소 복합제를 가하고 10분간 반응시킨 후, diaminobenzidine으로 발색시킨 다음 hematoxyline으로 대조염색하고 봉입한 후 광학현미경으로 관찰하였다. 각 유전자 산물에 대한 일차 항체로는 단클론성 항체를 사용하였는데 TGF-α는 monoclonal antibody Ab-2 TGF-α(Ab-2, clone 213-4.4)(Oncogene Science, Massachusetts, USA), p53은 mouse antihuman p53 specific monoclonal antibody PAb 1801(Oncogene Science, Massachusetts, USA), PCNA는 mouse monoclonal antibody PC 10(DAKO, Glostrup, Denmark)을 사용하였다.
3) 면역 조직화학적 염색의 결과 판정
(1) TGF-α에 대한 염색에서 구성세포의 세포질에 갈색의 과립성 반응을 양성으로 판독하였으며, 염색상이 전혀 없거나 주변의 비특이적 반응과 차이가 나지 않으면 음성으로 판독하였다. 즉 주변의 비특이적 반응에 비해 미세한 과립성 염색상을 보이는 경우를(＋1), 분명한 굵은 과립성 염색상을 보이는 경우를(＋3), 그 중간을(＋2)으로 하였다. 반응 범위에 따라 검경시야의 25% 이하의 세포에서 염색상을 보일 경우를(＋1), 25%에서 50% 양성 반응을 보일 경우(＋2), 50%에서 75% 양성 반응의 경우를(＋3), 75% 이상의 경우를(＋4)로 하여 염색정도와 염색범위를 곱한 값으로 TGF-α에 대한 종양세포의 양성 반응을 준정량적으로 측정하였다.
(2) p53은 검경시야에서 세포의 핵에 분명한 갈색의 과립성 반응을 보일 때 양성으로 판독하였다.
(3) PCNA 양성 표현율은 image analyzer(CAS 200 SYSTEM)(Becton Dickinson, Franklin Lake, USA)를 이용하였는데 400배 현미경 시야에서 염색이 잘된 5부위를 선정하여 CCD camera(Becton Dickinson, Franklin Lake, USA)를 통하여 들어온 광도를 분석한 후, 양성 핵수와 음성 핵수를 계산하여 백분율로 표시하였다.
4) 통계학적 검증
SAS 프로그램으로 ANOVA, Student’s t-test, Fisher’s exact test를 하였으며 p값이 0.05 이하일 때 의미있는 것으로 정하였다.
결과
1. 후두 이형성의 정도와 악성화율
총 30례를 Thomas 등의5) 분류에 따라 재검색한 결과, 경도의 이형성증이 11례, 중등도의 이형성증이 13례, 고도의 이형성증이 6례였으며(Fig. 1), 추적 생검상 암종으로의 변이는 중등도 이형성증에서 1례, 고도 이형성증에서 3례가 있었다(Table 1).
2. 면역조직화학적 검색
1) TGF-α score
과립성 갈색반응은 세포질에 국한되어 나타났다(Fig. 2). 이형성증의 TGF-α score의 평균은 3.43 이었고, TGF-α의 발현양상과 이형성 정도사이의 연관성은 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(P＝0.0005)(Table 2).
2) p53 발현율
핵에 진한 갈색으로 염색되는 양성 반응이 나타났다(Fig. 3). 총 30례중 8례(26.7%)에서 양성반응을 보였으며, 통계학적으로 유의한 차이가 있었다(P＝0.0001)(Table 2).
3) PCNA 증식지수
양성반응은 핵에 국한되어 발현되었다(Fig. 4). 분화도에 따른 증식지수는 통계학적으로 의의가 있었다(P＝0.005)(Table 2).
4) 악성으로의 변화에 따른 TGF- , p53, PCNA 발현양상
총 30례중 4례에서 암종으로 변이하였는데 암종으로 변한 예의 TGF-α score는 5.46으로, 그렇지 않은 예 1.88보다 통계학적으로 유의성이 있었다(p＝0.0015)(Table 3). p53 양성인 군 8례중 3례가 암종으로 변한 반면, p53 음성인 경우 22례중 1례가 암종으로 변하였다. p53과 악성전이도와는 통계학적으로 유의하였다(p＝0.045)(Table 3). PCNA 증식지수는 침윤성암종으로 변한 경우 29.2%로, 그렇지 않은 경우 8.6%보다 높았으며 통계학적으로 유의하였다(p＝0.0001)(Table 3).
고찰
상피 이형성증은 상피 각 층의 증식과 더불어 이형성 세포가 출현하는 겅우를 말하며 Thomas 등은 상피 두께의 하단 1/3에만 세포의 비정상 발육이 국한되어 있는 경우를 경도의 이형성증, 하단 2/3에 국한된 경우를 중등도, 전층에 이형성이 있는 경우를 고도로 분류하였다.5) 또한, 임상적으로 침윤성 암종으로 진행할 수 있다는 점에서 전암성 병변으로 분류되는데 악성전이의 빈도는 저자에 따라 차이가 있어 대개 4∼40%로 보고되나2) Kleinsser는 90%로 보고하였다.6)
전암성 병변에 대한 치료 방법은 다양하며 생물학적 성상에 대한 연구도 치료방침 및 임상경과 예측에 있어 중요하다. Henry와 Hojslet 등은 세포핵의 이형성정도와 관련이 있다고 보고하였으나1)2) Gilles 등은 흡연력, 음성과용, 음주력, Vit-A 결핍 등의 여러 요인이 관련된다고 하였다.7) 그러나 기존의 병리 조직학적 방법에 의한 이형성정도의 판정은 주관적인 경향이 있고, 전암성 병변과 세포의 비특이적인 변형과의 구별이 힘들어 세포의 형태이상만으로는 진행 경과 예측에 어려움이 따른다. 따라서 보다 용이하며 객관적인 방법이 요구되고 있다.
TGF-α는 육종 바이러스에 의하여 변형된 세포에서 처음으로 분리된 저분자량(5500 Mw)의 50개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드로서 간, 난소, 폐 및 위의 악성 종양에서 관찰되는 것으로 보고되고 있다.8)9) TGF-α는 정상세포가 악성으로 전환될 때 분비되며, 종양세포 자체에서도 생성·분비되어 주위 종양세포의 종양성 전환에 영향을 미치고 주위 종양세포들에는 성장을 자극하는 효과가 있을 것으로 추측되고 있다.3) 이러한 성장인자의 분비는 전환과정중의 세포변화에 의하여 잠재성 TGF-α의 활성화 결과로 생각되며, 이 발암 유전자와 다른 성장인자들과의 연관성에 대해서는 이미 보고되어 있다.10)
Marco 등은 후두암에서 TGF-α의 내인성 활성화가 EGFR(epidermal growth factor receptor)의 과발현과 관련되며 생존율, 치료효과, 재발율 등과 관계있다고 보고하였으며11), 후두암의 세포주에서 TGF-α mRNA가 발현됨을 증명하였는데, 이는 정상 조직에서는 관찰되지 않는다고 하였다.3)6)9) 여러 연구결과에서 TGF-α와 세포의 종양성 전환사이에 연관성이 있음을 보여주고 있다.
본 연구에서 이형성 정도와 TGF-α의 발현간에 상관성이 있었으며 침윤성암종으로 변한 경우 그렇지 않는 경우보다 TGF-α의 발현 빈도가 통계학적으로 검정한 결과 매우 유의한 것으로 판정되었다(p＝0.0015, Fisher’s exact).
p53 유전자는 염색체 17번 단완에 위치하는 암억제 유전자로서, 11개의 exon들로 구성되어 있으며, 대부분의 유전자 변이는 exon 5번부터 8번 지역에서 일어나는 것으로 알려져 있다.12) 정상적인 p53 단백질(Wildtype p53)은 53 KD의 핵내 DNA-결합 인단백질로서, DNA손상후 회복가능한 정도의 시간내에 지놈의 복제를 차단함으로써, 변형된 세포의 증식을 억제하는 효과를 가진다. 기능적으로 p53 단백질은 모든 정상 세포에서는 아주 낮은 농도로 존재하는데 상대적으로 반감기가 6분에서 20분 정도로 짧아 면역 조직화학적 방법으로는 검출이 되지 않으나, 변이를 일으킨 p53 단백질은 되먹임억제가 상실되거나 또는 반감기가 긴 유전자 산물을 생성해서 유전자 산물의 과발현으로 인해 면역 조직화학적 검출이 가능하여 유방, 폐, 위, 대장, 난소 등에서 발생한 암종에서 보고되고 있다.13)14)
Dolcetti 등에 의하면 후두 편평 상피암에서 p53의 발현은 임상 병기나 조직학적 분화도 및 생물학적 성상과는 관련이 없으며, 상피암 뿐만 아니라 상피암과 인접해 있는 이형성 세포 및 상피암과 상당히 멀리 떨어져 있는 정상으로 보이는 세포에서도 항 p53 항체에 양성으로 염색되는 세포가 있었다는 점에서 p53의 발현이 침윤성 암종의 초기 변화라고 보고하였다.15)
Field 등은 말기 두경부 편평 상피암 환자중 p53 발현시 예후가 더 나빴고, p53 유전자는 암 말기에 종양의 생물학적 성상에 중요한 역활을 한다고 하였으며, 이형성 조직과 상피내 암종에서 p53의 발현이 있는 점으로 보아 p53 유전자가 종양의 초기 변화에도 관여한다고 보고하였다.16)
Shin 등은 물리·화학적 인자에 의한 지놈의 손상으로 인한 방어기전으로 p53이 유전자 발현 조절, 세포 주기 억제, 세포괴사에 관여하며, 다른 방어기전으로 손상된 세포를 대치하기 위하여 성장인자에 의해 유발된 증식반응이 필요하고 TGF-α 유전자가 p53 매개 전사반응의 직접적 목표라고 보고하였다.17)
저자들은 이형성 정도를 경도형, 중등도형, 고도형으로 나누었고, 또한 침윤성 암종의 유무에 따른 발현양상을 비교 분석하였다. 경도 이형성시 0%, 중등도형은 23.1%, 고도형은 83.3%의 p53 발현율을 보임으로서 이형성 정도와 p53 발현과의 상관성이 확인되었다(p＝0.0001, ANOVA). 또한 침윤성암으로 변이한 예에서 p53 발현율이 통계학적으로 유의성이 있었다(p＝0.041, Fisher’s exact).
종양의 악성도 및 예후 판정에 있어서 중요한 요소가 될 수 있는 증식능력의 표지자중 하나인 PCNA는 36kD의 nonhiston 핵단핵으로 cyclin 이라고도 불리우는 DNA polymerase-delta의 보조단백이다. 이는 세포증식의 필수적인 물질로서 세포주기중 후기 G1부터 S기에 걸쳐 합성되는 것으로서 DNA 합성에 중요한 역활을 한다고 알려져 있다. PCNA 발현율이 높다는 것은 S기의 세포분핵이 많다는 것을 의미함과 동시에 향후 침윤성 암종으로 진행할 가능성이 높아진다는 것을 의미한다.18)19)
Shin 등은 두경부 편평상피암 및 인접해 있는 전구암소에서 정상 상피에서 과형성, 이형성 및 상피암으로 진행할수록 PCNA의 발현이 통계학적으로 유의하였고 다단계 발암 현상에 대한 생물학적 표지자로서 유용성을 제시하였다.19)
저자들의 이전 연구에서 PCNA에 대한 항체를 이용해 상피 이형성 정도와 세포증식능간의 관련성을 조사한 결과, 경도 이형성시 15.11%, 중등도형은 3.51%, 고도형은 4.22%로 상피 이형성의 정도와 PCNA 양성 표현율이 상관관계가 없다고 보고하였는데20), 그러한 결과는 통상적인 Hematoxyline-Eosin 염색으로 광학 현미경하에서 상피이형성의 정도를 객관적으로 정확히 평가하기에는 어렵다는 사실을 보여주고 있다.
그러나, 본 연구에서는 경도형은 11.1%, 중등도형은 14.3%, 고도형은 35.4%로 이형성 정도가 심할수록 PCNA 양성 표현율이 높았으며, 통계학적으로 유의한 상관 관계를 보였다(p＝0.005, ANOVA). 또한 침윤성암으로 변이한 예에서 그렇지 않는 예보다 통계학적으로 매우 유의한 상관 관계를 보였다(p＝0.0001, Fisher’s exact).
이번 연구는 이형성증으로 나타난 후두 전암성 병변에 있어서, 조직의 이형성 정도 및 TGF-α, p53과 PCNA의 면역 조직화학적염색이 조직의 생물학적 성상의 예측 및 추적 조사상 침윤성 암종으로 진행가능성에 대한 판단에 도움이 되리라는 가정하에 실시하였다. 침윤성 암종으로 진행된 조직에서 TGF-α, p53, PCNA에 대한 발현양상이 높았고 통계학적으로 유의성이 있는 것으로 보아 TGF-α, P53, PCNA의 발현 양상이 후두 이형성증의 임상 경과 예측 및 치료 방침의 결정에 도움을 줄 수 있을 것으로 생각된다.
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