| Expression of MAGE 3 Gene Product in Squamous Cell Carcinomas of the Head and Neck. |
| Kang Dae Lee, Young Ki Jo, Sun Gon Kim, Kil Soo Lee, Chang Young Choi, Ju Hong Lee |
| Department of Otolaryngology, Kosin University College of Medicine, Pusan, Korea. ent95@chollian.net |
| 두경부 편평세포암종에서 MAGE 3 유전자 산물의 발현 |
| 이강대 · 조영기 · 김순곤 · 이길수 · 최창용 · 이주홍 |
| 고신대학교 의과대학 이비인후과학교실 |
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| 주제어:
두경부편평세포암종ㆍMAGE3 유전자 산물ㆍ면역조직화학적 염색ㆍ암면역 치료. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
MAGE 3 gene may constitute a potential target for cancer immunotherapy since it is expressed in a variety of cancers but not in normal tissues except the testis. In this study, expression and intracellular location of MAGE 3 gene products were investigated using squamous cell carcinomas of the head and neck.
MATERIALS AND METHODS:
MAGE 3 protein expression was screened in 40 squamous cell carcinomas, 2 tumor lines, 20 benign diseases, and 20 normal tissues of the head and neck.
Immunohistochemical staining with anti-MAGE 3 mAb 57B was conducted from fresh frozen specimens. A correlation between MAGE 3 expression and clinicopathological parameters was also evaluated.
RESULTS:
MAGE 3 gene product was detected in squamous cell carcinomas (18/40, 45%) and in tumor lines (2/2, 100%), but not in benign diseases and normal tissues. MAGE 3 gene product was identified as a cytoplasmic protein of cancer cells without staining in normal epithelia and stromal tissues coexisting adjacent to cancer cells. No significant correlation between MAGE 3 expression and clinicopathological parameters including tumor cell differentiation, age, gender, primary site, tumor stage, and metastasis was drawn.
CONCLUSIONS: MAGE 3 antigen could represent a potential target for immunotherapy in head and neck squamous cell carcinomas. |
| Keywords:
MAGE 3 gene productㆍImmunohistochemical stainingㆍSquamous cell carcinomasㆍHead and neckㆍImmunotherapy |
서론
암연구의 목표중의 하나는 정상세포와 암세포와의 차이점을 찾아서 암세포만 선택적으로 제거하는 치료 방법을 개발하는데 있다. 면역계는 비자기(non-self)를 제거하려는 특성을 가지므로 암면역치료는 이론적으로 암세포의 제거에 이상적인 수단으로 사용될 수 있다. 그러나 성공적인 암면역치료를 위해서는 암세포에만 특이적으로 발현되는 암항원이 필요하다.
van der Bruggen 등1)은 흑색종 세포주로부터 세포독성 림프구(Cytotoxic T lymphocyte, CTL)에 의해 인식되는 암항원을 지령(code)하는 유전자를 찾아내는데 성공하였으며 이 유전자를 MAGE 유전자(melanoma antigen gene, MAGE gene)이라고 명명하였다. MAGE 유전자는 적어도 12개 이상의 유전자로 구성되어 있으며, 염색체 Xq에 위치한다.2) MAGE 유전자는 흑색종뿐만 아니라 여러 종류의 암에서 발현되지만 정상조직에는 정소이외는 발현이 없는 것으로 알려져 있다.2)3) 또 MAGE 유전자를 발현하는 정소조직에는 HLA class I 분자가 없기 때문에4) MAGE 유전자의 정상조직에서의 발현범위는 매우 국한되어 있어 MAGE 유전자는 암특이면역치료의 잠재적 목표물로서 주목을 받고 있다.
MAGE gene family중 항원 펩타이드와 HLA class I 분자와의 관계가 가장 잘 알려진 것은 MAGE 15)6)과37-10) 유전자로 특히 MAGE 3 유전자는 백인뿐만 아니라 한국인의 암면역 치료에도 의미가 있다. 왜냐하면 MAGE 3 항원 펩타이드가 한국인에서 가장 많은 HLA A2(59%),8) HLA A24(38%),9) HLA B44(20%)10)에 의해 CTL로 제시되기 때문이다.11) 이와 같은 MAGE 3 유전자의 발현에 대해서는 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcriptionpolymerase chain reaction, RT-PCR), Southern blot analysis 등의 방법에 의한 mRNA발현의 관찰이 대부분이다.2)12-16)
본 연구에서는 두경부 편평세포암종과 편평세포암종 세포주 그리고 양성질환과 정상조직을 대상으로 MAGE 3 유전자 산물이 mRNA에서 표현되는 것과 마찬가지로 면역조직화학염색에서도 암세포에만 특이하게 단백이 발현되는지 여부와 발현빈도, 세포내에서의 발현부위 그리고 임상적, 병리학적 소견과의 상관관계에 대해 알아보고 나아가서는 한국인에서의 MAGE 3 유전자 산물을 이용한 암면역치료의 가능성을 검토하고자 한다.
대상 및 방법
세포주
두경부의 편평세포암종으로부터 수립된 세포주 PNUH-NC-12(부산대학교 암연구소 제공)과 PCI 50(서울대학교 암연구소제공)이 사용되었다.
조직 채취
고신의대 이비인후과교실에서 1996년 10월부터 1997년 8월까지 수술 혹은 생검으로부터 두경부 편평세포암종 40례의 검체를 채취하였고, 이중 원발암이 30례, 경부전이암이 10례이었다. 신선 조직을 얻은 후 즉시 검사실로 보내었고 모든 예에서 헤마톡실린-에오신 염색(hematoxylin-eosin stain)과 면역조직화학적 염색을 동시에 시행하였다. 그리고 대조군으로 다형성 선종을 비롯한 양성종양과 비종양성 질환을 포함한 두경부의 양성질환의 신선 조직 20례와 암조직과 충분한 거리로 떨어져 있는 후두, 인두, 구강, 부비동의 정상조직 20례를 사용하였으며 같은 방법으로 처리하였다(Table 1).
항 MAGE 3 단클론항체
면역조직화학적 염색의 일차항체는 스위스 Basel 대학의 Dr. Spagnoli의 협조에 의해 제공된 항 MAGE 3 단클론항체 57B(anti-MAGE 3 monoclonal antibody)17)를 사용하였다.
면역조직화학적 염색
신선한 검체를 동결조직 포매제로 포매하여 Histo STAT microtome(AO, Buffalo, USA)으로 5~6 μm 두께로 박절하여 probe on plus slide(Fischer scientific, Pittsburg, USA)에 부착, 30분 정도 건조시키고 냉각된 아세톤에 10분간 고정시킨다. 완충액(10×Immunoassay buffer)(Biomeda Co., Foster, USA)으로 세척하고 3% 과산화수소로 내인성 과산화효소를 억제한 후 일차항체인 항 MA-GE 3 단클론항체 57B를 점적하여 실온에서 30분간 반응시킨다. 다시 완충액으로 세척하고 biotin이 부착된 이차항체(DAKO Co., Carpitenia, USA)를 이용하여 12분간 반응과 세척을 거쳐, Streptavidin horseradish peroxidase(DAKO Co., Carpitenia, USA)로 14분간 반응시켰다. 발색제는 3-amino-9-ethylcarbazole(AEC)(DAKO Co., Carpitenia, USA)을 사용하였으며, Mayer's hematoxy-lin으로 대조염색 후 양성반응을 관찰하였다. 결과의 판정은 광학현미경소견상 MAGE 3 유전자 산물이 암세포에서 발현되는 세포의 백분율에 따라 5%이하의 발현을 (-), 6~25%를 (＋), 26~50%를 (＋＋), 51~75%를 (＋＋＋), 76% 이상의 발현을 (＋＋＋＋)로 판정하였다.
역전사 중합효소 연쇄반응
MAGE 3 유전자의 발현을 단백질의 수준에서 알아보는 항 MAGE 3 단클론항체 57B에 의한 MAGE 3 유전자 산물의 발현과 MAGE 3 유전자의 mRNA에서의 발현을 알아보는 역전사 중합효소 연쇄반응의 결과를 비교하여 보고자 면역조직화학염색상 양성으로 발현되었던 두경부 편평세포암종 4례와 음성이었던 4례에 대해 역전사중합효소 연쇄반응(primer：sense, tggaggaccagaggccccc, antisense, ggacgattatcaggaggcctgc, PCR profile：94℃ 1분, 71℃ 2분, 72℃ 2분, 30 cycle, final extension 72℃ 10분, PCR product：725 bp)을 시행하였다.
임상적, 병리학적 자료
대상 환자의 암세포의 분화도, 나이, 성별, 원발부위 병기, 림프절전이 등을 MAGE 3 유전자의 발현과 상관 지어 비교하였다. 통계는 Chi-square test로 처리하였다.
결과
두경부 편평세포암종, 세포주 및 대조군에서의 MAGE 3 유전자 산물의 발현
면역조직화학적 염색 소견상 MAGE 3 유전자 산물은 특히 암세포에서만 선택적으로 염색되었다. 암조직내에 암세포와 공존하고 있는 비암조직인 정상 편평상피세포와 간질조직에서는 발현을 볼 수 없었다(Figs. 1A and B). MA-GE 3 유전자 산물이 양성으로 발현된 경우는 18례(45%)로서 이중 암세포의 51%이상(＋＋＋, ＋＋＋＋)에서 발현된 예는 13례(32.5%) 이었다. 그리고 두경부 편평세포암종 세포주인 PNUHNC-12과 PCI 50에서도 MAGE 3 유전자 산물은 양성으로 발현되었다. 반면에 대조군인 정상조직과 양성종양을 포함한 양성질환 각각 20례에서는 발현이 없어(Figs. 2A and B) MAGE 3 유전자 산물은 편평세포암종에서 대조군에 비해 유의하게 발현이 많았다(p< 0.001)(Table 2).
두경부 편평세포암에서 MAGE 3 유전자 산물의 발현부위
MAGE 3 유전자 산물은 암세포내에서의 세포단백으로 발현되었고 이러한 소견은 편평세포암종 세포주에서도 같은 결과를 얻었다(Figs. 3A and B).
MAGE 3 유전자 산물의 발현에 대한 면역조직화학적 염색과 역전사 중합효소 연쇄반응과의 비교
항 MAGE 3 단클론항체 57B에 의해 양성으로 발현되었던 두경부 편평세포암종 4례와 음성이었던 4례에 대해 역전사 중합효소 연쇄반응을 시행하여 면역조직화학적 염색의 결과와 역전사 중합효소 연쇄반응의 결과가 일치하는 소견을 얻었다(Fig. 4).
임상적, 병리학적 소견과 MAGE 3 유전자 산물의 발현과의 관계
암세포 분화도에 따른 MAGE 3 유전자 산물의 발현을 보면 고분화암이 39.1%, 중등도 분화암이 53.8%, 저분화암에서 50%로 암세포의 분화도와 MAGE 3 유전자 산물의 발현과는 상관관계가 없었다. 연령, 성별, 원발부위 병기, 림프절 전이, 경부전이의 진행정도 등 임상적 자료와 MAGE 3 유전자 산물의 발현과의 상관관계를 조사하였으나 통계적 유의성은 없었다(Table 3).
고찰
MAGE 유전자의 발현에 대한 연구는 대부분 역전사 중합효소 연쇄반응에 의한 mRNA 수준에서 많이 이루어졌다.2)12-16) 그러나 이 방법은 조직의 어느 부분에서 발현되는지를 알기 어려운 단점이 있다. 저자들은 MAGE 3 유전자 산물에 대한 단클론항체로 면역조직화학적 염색을 시행하여 조직학적으로 MAGE 3 유전자 산물의 발현을 살펴보았다. 본 연구에서 MAGE 3 유전자 산물은 두경부 편평세포암종 40례중 18례(45%)에서 양성으로 발현되었고, 이중 암세포의 50% 이상에서 발현되는 경우가 32.5%이었다. 암조직에 공존하는 정상 상피세포와 점막하조직, 간질조직에서는 MAGE 3 유전자 산물이 발현되지 않아 암세포와는 확연히 구분되었다. 대조군인 다형성 선종, 유두종, 염증성 질환 등을 비롯한 양성질환 20례 그리고 인두, 후두, 구강의 정상조직 등 20례의 비암조직에서 MAGE 3 유전자 산물이 염색되지 않는 소견을 얻어 MAGE 3 유전자 산물은 암세포에서만 선택적으로 발현됨을 알 수 있었다. 본 연구에 사용된 항 MAGE 3 단클론항체 57B에 의한 면역조직화학적 염색의 결과와 비교하기 위해 면역조직화학적 염색상 양성으로 발현되었던 두경부 편평세포암종 4례와 음성이었던 4례에 대해 역전사 중합효소 연쇄반응을 시행하여 같은 결과를 얻음으로서 본 실험에 사용된 항 MAGE 3 단클론항체 57B를 이용한 면역조직화학적 염색과 역전사 중합효소 연쇄반응의 결과에 차이가 없음을 확인하였다.
두경부암에서 MAGE 3 유전자의 발현에 대해 Eura 등12)은 역전사 중합효소 연쇄반응 및 Southern blot analysis를 이용하여 88례의 두경부 편평세포암종에서 MAGE 3 유전자가 43%에서 발현됨을 보고하여 방법은 달랐지만 저자의 결과와 유사하였다. Lee 등13)은 두경부 비편평세포암종의 33.3%에서 MAGE 3 유전자 산물이 발현됨을 보고하였고, 두경부 이외의 장기에서도 MAGE 3 유전자는 흑색종, 18) 식도암,19) 위암,14) 대장암,20) 유방암,15) 신경아세포종16) 등 여러 종류의 암조직에서 발현되는 것으로 알려져 있다.
MAGE 유전자의 생물학적 특성에 대해 자세히 알려진 것은 없으나 아마도 악성종양으로의 형질전환에 관계할 것으로 추측된다.1) 본 연구에서는 항 MAGE 3 단클론항체 57B를 사용함으로써 MAGE 3 유전자 산물의 암세포내에서의 발현 부위를 알 수 있었다. Figs. 3A and B에 제시된 것처럼 MAGE 3 유전자 산물은 세포질내에서 발현되는 세포질내의 단백이었고 이러한 결과는 MAGE 3 유전자 산물이 세포질 단백이라는 Kocher 등17)의 보고와 일치하였다. MAGE 3 유전자 산물이 세포질내 단백이라는 의미는 MA-GE 유전자 산물이 항원 처리 과정을 거쳐 HLA class I 분자와 결합하여 항원 펩타이드로서 CTL로 제시될 수 있음을 암시한다고 할 수 있다.
MAGE 유전자가 양성으로 발현된 신경아세포종에서는 MAGE 유전자가 면역계에 의해 인식된 결과 병기가 낮고, 전이도 적어 예후가 좋았다고 하는 보고16)가 있으며 반면 유방암에서 원발암에서는 MAGE 유전자가 양성으로 발현되었으나 전이암에서는 음성이었던 경우와 반대의 경우도 관찰되어 MAGE 유전자의 발현과 전이와의 관계가 불분명하다는 보고15)도 있다. 그리고 대장암에서 간 전이가 있었던 경우에서 MAGE 유전자의 발현이 높았다고 하는 보고20)
가 있는 반면, 위암에서 병리학적, 임상적 소견을 MAGE 유전자의 발현과 연관지어 관찰하였으나 유의성을 얻을 수 없다고 하는 주장14)도 있다. 저자들은 MAGE 3 유전자 산물의 발현과 두경부 편평세포암종 환자의 성, 연령, 원발부위의 병기, 전이, 그리고 경부전이암과 원발암에서의 MAGE 3 유전자 산물의 발현을 알아보았으나 의미 있는 결과를 얻지 못하였다.
MAGE 3 항원은 300개 이상의 아미노산으로 되어 있고 이중의 일부의 항원 펩타이드는 HLA A1,7) HLA A2,8) HLA A24,9) HLA B4410)에 의해 제시되고 CTL에 의해 인식이 된다(Table 4). 한국인에서 HLA A2의 빈도는 59%, HLA A24는 38%, HLA B44는 20%이다.11) 저자들의 결과를 토대로 보면 MAGE 3 유전자가 두경부 편평세포암종의 45%에서 발현되므로 한국인의 두경부 편평세포암 환자의 경우 이론적으로는 MAGE 3 유전자를 이용한 암면역치료는 HLA A2로부터 26.5 %(MAGE 3/HLA A2：45%×59%), HLA A24로 부터 17.1% 그리고 HLA B44로부터 9% 등 적어도 한국인의 26.5%가 MAGE 3 유전자를 이용한 암면역치료의 대상이 된다고 생각할 수 있다. 이처럼 MAGE 항원에 대한 단클론항체의 사용은 MAGE 항원을 이용한 암면역치료의 대상자를 찾아내는 방법으로 역전사 중합효소 연쇄반응과 HLA typing을 이용한 방법에 면역조직화학적 염색이 또 하나의 방법으로 추가될 수 있다는데 의의가 있다.
결론
MAGE 3 유전자는 여러 종류의 암에서 발현되지만 정상 조직에는 정소이외는 발현이 없는 것으로 알려져 있다. 또 정소 조직에는 HLA class I 분자가 없기 때문에 MAGE 3 유전자는 CTL을 이용한 암특이 면역치료의 잠재적 목표물로서 주목을 받고 있다.
본 연구에서는 두경부 편평세포암종에서 MAGE 3 유전자 산물이 세포질내 단백질로서 암세포에 특이적으로 발현됨을 관찰하여 MAGE 3 유전자 산물이 암면역치료의 목표물이 될 수 있음을 확인하였다. 앞으로 MAGE 3 항원을 이용한 암면역치료의 임상 응용을 실현하기 위해서는 더 많은 연구가 진행되어야 할 것이다.
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