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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1998;41(9): 1118-1121. |
| Bone Resorption of Cultured Middle Ear Cholesteatomatous Epithelium-In Vitro Study. |
| Hee Jong Chang, Jong Woo Chung, Sang Hoon Lee, Young Chang, Hyung Jong Kim, Tae Hyun Yoon |
1Department of Otolaryngology, University of Ulsan College of Medicine, Ulsan University Hospital, Ulsan, Korea. thyoon@www.amc.seoul.kr
2Asan Medical Center, Seoul, Korea.
3Department of Otorhinolaryngology, Kangdong Sacred Heart Hospital, Hallym University College of Medicine, Seoul, Korea. |
| 배양된 중이진주종 상피세포의 골흡수효과 - <i>In Vitro </i> 연구 |
| 장희종1 · 정종우2 · 이상훈2 · 장 영2 · 김형종3 · 윤태현2 |
| 울산대학교 의과대학 울산대학교병원1;서울중앙병원 이비인후과학교실2;한림대학교 의과대학 강동성심병원 이비인후과학교실3; |
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| 주제어:
골흡수ㆍ태아 쥐 두개골 조직배양ㆍ중이진주종ㆍ칼슘유리. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Bone resorption is an important cause of complications of chronic cholesteatomatous otitis media. Authors cultured the calvarial bone of fetal rat and measured the calcium release by keratinocytes and fibroblasts from cholesteatoma and postauricular skin (PAS).
MATERIALS AND METHODS:
Keratinocytes and subepithelial fibroblasts were cultured from cholesteatoma and PAS. The pregnant rats were sacrificed 24 hours after subcutaneous injection of Ca45 and the fetal calvarial bones were cultured with or without the supernatants of keratinocytes and fibroblast culture. The amount of released radioactive calcium was analyzed using beta-ray counter.
RESULTS:
The percentage (%) of calcium release was 28.95+/-4.0% in the control and 31.86+/-3.0% in the supernatant of PAS keratinocytes. In the cholesteatomatous keratinocytes, the released calcium was 34.99+/-6.1% and significantly greater than the values of control and PAS.
Using the supernatants from the fibroblast culture, cholesteatoma and PAS showed higher calcium release than the control, but there was no significant difference between the two tissues.
CONCLUSIONS: Through this study, authors showed the in-vitro bone resorption by cholesteatoma and concluded that cholesteatomatous epithelial cells can be involved in the bone resorption. |
| Keywords:
Bone resorptionㆍFetal rat calvarial cultureㆍCholesteatomaㆍCalcium release |
서론
진주종의 발생 및 병리기전에 대해서는 여러 학설들이 있으나 아직까지 정확히 밝혀져 있지 않으며, 또한 만성 진주종성 중이염에서 합병증을 유발하는 가장 큰 요인인 골파괴에 대한 원인으로도 여러 학설들이 제시되어 왔는데, 그중 파골세포에 의한 골흡수에 의한 것임이 가장 널리 알려져 있다.1-4) Chole3)은 수술시 얻은 진주종의 24례중 11례, 만성 중이염의 3례중 2례, 이경화증의 10례중 3례에 있어 파골세포에 의한 골흡수를 관찰할 수 있었다고 보고하였다. 또한 진주종의 상피층이 정상 피부의 상피층과는 특성이 다르고, 또한 상피층이 골흡수에 있어서 중요한 역할을 할 것이라는 많은 보고들이 있었으며,5)6) 골조직의 비정상적인 흡수를 일으키는 진주종은 청력소실, 전정기능저하, 만성염증, 뇌합병증 등을 유발하게 된다.3) 중이진주종의 골흡수효과는 IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α 등과 같은 여러 cytokine 등에 의해 매개가 되며,7-10) 이들이 collagenase의 활성을 증가시키거나 혹은 파골세포를 자극하여 골흡수가 촉진되는 것으로 알려져 있다. 그리고 이러한 cytokine들은 정도의 차이는 있으나 진주종상피의 각질세포와 상피하 육아조직에서 모두 분비되는 것으로 알려져 있으므로 골파괴현상에 진주종 상피의 각질세포와 섬유아 세포가 모두 관여할 것이라는 보고가 있었다.8) Yoon 등11)은 조직배양법을 통해 진주종 상피의 각질세포에서 IL-1α, IL-1β, IL-8 등이 섬유아세포에 비해 많이 분비되는 것을 밝혔고 이를 통해 각질세포가 골흡수현상에 더 많은 영향을 미칠 것으로 추론하였다.
본 연구에서는 진주종 조직의 각질세포와 섬유아세포의 분리조직배양법을 통해 각 조직의 태아쥐 두개골 흡수능력을 측정하여 진주종의 골흡수현상에 미치는 이들 조직의 영향을 평가하고자 하였다.
재료 및 방법
방법
정상 이개후부 피부와 진주종조직에서 각질세포와 상피하 섬유아세포의 분리배양12) 수술시 얻은 중이 진주종 15례와 정상 이개후부의 상피조직 15례를 0.4% dispase를 이용하여 상피층과 진피층으로 분리시킨 후 피부상피층의 각질세포는 M154 배양액(Cascade, USA)에 넣어 CO 2 배양기에서 배양하였고, 상피하 섬유아세포는 10% fetal bovine serum(FBS, Sigma, USA)이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM, GibcoBRL, USA)으로 배양하였으며, 각각의 배양상층액을 채취하여 냉동보관하였다.
태아 쥐 두개골 조직배양
임신한 쥐(Spraque-Dawley, Charles River Japan Inc., Japan)에게 임신 17일째 Ca 45(Dupont, USA)를 피하주사하고 24시간후 태아 쥐를 적출하여 두개골을 얻었다. 두개골을 반으로 분리하여 10% DMEM에 넣고 37℃, 5% CO 2 배양기에서 배양하였다.
Ca 45의 방사능과 칼슘 유리율의 측정
배양후 각각 1, 2, 3일째에 배양상층액을 얻어서 cocktail solution(Packard, The Netherlands) 5 ml를 넣은 후 베타선 섬광계수관(Packard)에서 방사능을 측정하였다. 배양액의 칼슘유리양을 측정하고 마지막으로 남아있는 두개골을 2N HCl에 넣어 24시간동안 탈석회화한 후 같은 방법으로 측정하여 잔존 칼슘양을 측정하였다. 칼슘유리율은 전체 칼슘 양중 각 시기 동안에 유리된 칼슘양의 비율로 구하였다. 실험결과는 student’s t-test를 이용하여 통계처리하였다.
사용한 용액
각질세포의 골흡수 효과를 알아보기 위해 정상 이개후부 피부와 진주종조직의 각질세포배양 상층액과 DMEM을 4：1로 섞은 배양액을 이용하여 두개골 조직을 배양하였다. 섬유아세포의 효과를 알아보기 위하여 정상 이개후부 피부와 진주종 조직의 섬유아세포 배양상층액과 DMEM을 4：1로 섞은 배양액을 이용하여 두개골조직을 배양하였고, 배양 3일동안 매일 배양상층액을 모으고, 새로운 배양액으로 바꾸어 주었다. 3일후 배양상층액에서 유리된 칼슘양을 측정하였다. 대조군으로는 DMEM만을 사용한 배양액을 사용하였다. 실험에 사용한 골조직은 상피세포배양액의 경우 대조군 30례, 진주종 29례, 이후부 피부29례였고, 상피하 섬유아세포배양액의 경우는 대조군 15례, 진주종 17례, 이후부 피부 19례였다.
결과
배양된 중이진주종 상피세포 및 정상 이후부 상피세포는 다각형 모양의 비슷한 형태를 가지고 있어 각질세포의 특징적인 소견을 보였으며, 섬유아세포는 spindle shape의 전형적인 모습을 보였다.
각질세포 배양상층액이 첨가된 배양액에서 두개골 조직배양을 하였을 때 칼슘유리율은 대조군 28.95±4.0%, 이개후부 상피조직 31.86±3.0%, 진주종조직 34.99±6.1%로 정상 상피조직에서 대조군에 비하여 유의한 차이를 보이며 증가되었고, 진주종 조직에서는 대조군 뿐만 아니라 이개후부 상피조직에 비하여 유의하게 증가되었다(Fig. 1). 섬유아세포의 배양상층액이 첨가된 배양액에서의 칼슘유리율은 대조군 26.78±3.8%, 이후부 상피조직 32.53±3.6%, 진주종조직 33.45±5.5%로 정상 조직과 진주종조직 모두 대조군에 비하여 칼슘유리율이 유의하게 증가되었으나 두 군 사이의 유의한 차이는 없었다(Fig. 2).
고찰
본 연구의 방법으로 사용하였던 태아 쥐의 두개골 조직 배양방법은 골흡수에 대한 in vitro 연구방법으로 가장 많이 쓰이고 있으며, 미리 방사성 칼슘을 투여하고 유리되는 방사성 칼슘양이 흔히 골흡수의 지표로 이용된다.13)14) 본 연구의 결과로 이개후부의 피부보다 진주종 조직의 각질세포 배양액에 의해 유리되는 칼슘양이 많았는데, 이로 보아 진주종 상피세포에서 골흡수를 일으키는 물질을 많이 분비하여 골흡수를 촉진시키는 것으로 생각할 수 있다. 또한 상피하 섬유아세포 배양액을 이용한 경우에도 골조직배양액에 유리되는 칼슘양이 진주종 조직과 정상 피부조직 모두 대조군에 비하여 많았으며, 이들 두 군 사이에는 유의한 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과로 미루어 보면 진주종은 정상 이후부 피부에 비해 상피층에서의 골흡수가 월등히 증가되어 있으므로 이 상피조직에 의하여 골흡수가 주로 일어날 것으로 추측할 수 있다.
Kuhihara 등1)은 진주종 조직과 중이의 염증성 육아조직을 배양하여 얻은 배양상층액을 이용한 생쥐의 두개골조직 배양연구로부터 진주종 조직에서만 골흡수가 유의하게 증가함을 보고하였으며, 비진주종성 만성중이염 환자에게서 얻어진 염증성 육아조직에서는 골흡수가 낮았다고 보고하여 골흡수 현상에서 상피하 육아조직의 역할을 배제하였다. 본 연구에서는 이들의 연구와 달리 상피하 섬유아 세포배양액에서도 골흡수가 진주종과 정상 피부조직에서 모두 증가되었다. 그러나 정상 이후부 피부가 골조직의 파괴를 일으키지는 않으므로 이러한 결과를 통해 첫째, 정상 피부에 골흡수를 억제하는 차단기전을 생각할 수 있고, 둘째, 조직배양액을 이용한 실험이므로 in vivo 상태의 특성이 변화되어 생겼을 가능성을 생각할 수 있다. Cochran 등14)은 상피층의 각질세포와 구강내의 섬유아세포배양에서 칼슘유리율이 증가하였으며, 특히 구강내의 섬유아세포 배양에서 대조군에 비해 20~43%까지 뚜렷하게 증가했다고 보고하고 있으므로 섬유아세포 배양액에 의한 골흡수효과는 더 많은 연구가 뒷받침되어야
하리라고 생각한다. 이상의 결과에서 진주종의 상피층은 정상 피부의 상피층과는 다른 성질을 가지고 있으며, 상피층이 골흡수에 있어 가장 중요한 역할을 수행할 것이라고 생각된다.
결론
태아 쥐 두개골 조직배양방법을 통해 진주종조직의 각질세포배양액이 정상 이후부 피부에서보다 높은 칼슘유리율을 보여서 진주종조직의 상피층에 골흡수의 중요한 요소가 존재할 것으로 생각된다.
REFERENCES
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