A Study of the Expression of Heat Shock Protein 72 in Guinea PigCochlea after Cisplatin Injection.

Yu, Won Seok; Oh, Seung Ha; Kim, Chong Sun

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 41(9); 1998 > Article

Original Article

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1998;41(9): 1105-1110.

A Study of the Expression of Heat Shock Protein 72 in Guinea PigCochlea after Cisplatin Injection.

Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Seoul National University College of Medicine, Seoul, Korea. chongkim@plaza.snu.ac.kr

Cisplatin 투여 후 기니픽 와우에서의 HSP 72의 발현에 대한 연구

유원석 · 오승하 · 김종선

서울대학교 의과대학 이비인후과학교실

주제어: Cisplatinㆍ이독성ㆍHSP 72ㆍ유리기ㆍ면역조직화학염색.

ABSTRACT

BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Several studies have attempted to show the reasons for ototoxicity induced by cisplatin, but the cochlear ototoxicity remained poorly understood. Recently, it is considered that free radicals play an important role in cisplatin ototoxicity. Heat shock proteins (HSP) are consistently present at some level in normal tissues and increased synthesis following stress. They have been implicated in the role of cellular protection during sub-lethal stressors. Many studies have demonstrated the increased synthesis of HSP following hyperthermia, ischemia, surgical injury and noise exposure. Free radicals are also considered as important inducer of HSP. The purpose of this study was to demonstrate the increase of HSP after cisplatin injection.
MATERIALS AND METHOD:
Thirty six Albano guinea pigs were used in this study. The animals were injected with a dose of 8 mg/kg cisplatin intraperitoneally. Cochleae are harvested 1, 3, 5 or 6, 12, 24 hours after injection. Immunocytochemistry and surface preparation method were used to detect the expression of HSP 72 in the cochlear tissues.
RESULTS:
The level of HSP 72 immunoreactivity began increasing by 3 hours after injection and continued to increase thereafter to reach maximal levels at 6 hours. Twelve hours after injection, the level of HSP 72 seemed to decrease to its normal levels. The increase of HSP 72 was mainly detected in Deiters' cells.
CONCLUSION:
Cisplatin induces a HSP in the guinea pig cochlea, particularly in the organ of Corti. However, further studies including quantitative analysis should be followed.

Keywords: CisplatinㆍOtotoxicityㆍHSP 72ㆍFree radicalㆍImmunocytochemistry

서론 Cisplatin의 항암효과는 DNA에 비가역적으로 결합하여 구아닌잔기(guanine residue)와 교차결합(intrastrand crosslink)을 만들어 염기치환변이(base substitution mutation)를 일으킴으로서 나타난다. 하지만 cisplatin의 이독성은 그 항암효과와는 다른 기전으로 일어날 것이라 추측되고 있으나 정확한 기전은 알려진 바 없다. 가능성 있는 기전으로 혈관조(stria vascularis)의 손상에 의한 허혈, 외유모세포의 칼슘전달통로 폐쇄 등이 거론되고 있으나 cisplatin의 이독성을 완전히 설명하기에는 부족한 점이 많다.1) 새로운 기전으로 유리기 (free radical)의 중요성이 대두되고 있는데 1995년 Ravi등이 항산화체계(antioxidant system)의 변화를 보고한 것이 있다. 그들은 glutathione과 glutathione peroxidase가 감소하고 glutathione reductase의 활성도가 감소하여 그 결과로 유리기가 증가함으로써 와우내 지질 과산화(lipid peroxidation)가 증가하여 세포손상을 일으킨다고 하였다.2) Heat Shock Protein(HSP)은 가열한 초파리에서 처음 발견되었고 정상세포에 어느 정도 존재하면서 protein folding과 maturation에 관여한다. HSP은 허혈, 열, 철분, 외상 등의 여러 자극에 의해 유도되며 특히 유리기는 중요한 HSP 유도물로 알려져 있다. 이렇게 유도된 HSP은 misfold 또는 변성된 단백을 refolding 시키거나 수용화시켜 세포를 보호하는 것으로 알려져 있다.3)4) 현재까지 와우내에서 cisplatin에 의한 HSP의 변화양상을 살펴본 연구는 알려진 것이 없다. 저자들은 cisplatin의 이독성기전이 유리기와 관계가 있다는 연구와 유리기가 HSP을 유도한다는 보고를 기초로 cisplatin이 기니픽의 와우에서 HSP을 유도할 것이라 가정하였다. 이 가정에 따라 HSP 72에 대한 면역조직화학적염색과 표면전처치기법(surface preparation method)을 이용하여 cisplatin 이독성이 증명되어 있는 기니픽 모델에서 cisplatin 투여 후 HSP 72의 발현증가를 확인해 보고자 하였다. 재료 및 방법 실험동물 및 조직표본 실험동물로는 이경검사상 정상고막을 가지고 있고 이개반사가 양성인 체중이 200에서 250 gm 정도의 기니픽 36마리를 사용하였다. 동물의 몸무게를 측정한 후 xylazine 과 sodium pentobarbital(50 mg/Kg)을 복강내 주사하여 마취하고, 동물고정기안에 넣어서 움직이지 못하게 하였다. 실험군은 대조군, 주사 후 1시간, 3시간, 5시간 또는 6시간, 12시간, 24시간의 6개 군으로 나누어 cisplatin을 Kg당 8mg씩 복강내 주사하였다. 각 군은 2마리의 기니픽으로 구성되었으며 전체 실험군을 3번 되풀이하였다. 마취된 동물은 4% paraformaldehyde를 사용하여 심장 관류를 이용한 생체고정방법으로 처리 후 측두골 조직을 얻었다. 동물에서 떼어낸 측두골 한쪽은 4% paraformaldehyde에 고정(24 시간, 4℃)하였다가 픽과 드릴을 이용하여 와우를 제외한 측두골의 다른 부분을 제거하였다. 얻어진 와우는 4℃에서 5% EDTA에 5일간 넣어 탈석회화 과정을 거친 후 냉동절편을 얻기 위하여 다시 30% sucrose로 고정(24시간, 4℃)하였다. 탈석회화 과정을 거친 와우는 면역조직화학염색을 위하여 8 μm 두께로 냉동절편하였다. 다른 측두골 한쪽은 표면전처치에 사용하였다. 항체 HSP의 발현양상을 보기 위하여 면역조직화학염색과 표면전처치에서 모두 1차 항체로 mouse anti-human HSP72 단클론성항체(StressGen, Glanford, Canada)를 사용하였고 본 실험에서는 1：800∼1000으로 희석하여 사용하였다. 포유류의 HSP에 대한 항체는 서로 다른 종간에도 교차반응이 있으므로 사용하는 데 지장은 없다고 알려져 있다. 5) 본 실험에서도 기니픽의 HSP에 대한 항체를 사용하는 것이 합당하지만 현재까지 기니픽에서 유도할 수 있는 형태의 HSP은 밝혀진 것이 없어 부득이하게 human HSP에 대한 항체를 사용하였다. 면역조직화학염색 염색은 Universal LSAB Kits(DAKO, Copenhagen, Denmark)를 이용하여 avidine-biotin peroxidase complex(ABC) 법으로 하였다. 먼저 검체를 PBS(phosphate buffered saline)로 세척하고 3% H 2O 2에 3분간 반응시켜 endogenous peroxidase를 제거하였다. 그 후 10분 동안 PBS로 세척하고 1% goat serum albumin으로 30분간 반응시켰다. 여기에 anti-human mouse HSP72 일차항체 (StressGen사, Glanford, Canada)를 12시간 동안 (overnight) 4℃에서 반응시켰다. 이차항체로 biotinylated anti-mouse immunoglobulin을 사용하여 30분간 다시 반응시켰다. PBS로 10분간 세척 후 avidin conjugated HRP(horse-radish peroxidase)에 30분, DAB-chromogen으로 5분간 반응시켜 발색시켰다. 대조 염색은 Meyer’s hematoxyline으로 5분간 반응시켰고 음성대조군은 위 과정 중 일차항체 만을 반응시키지 않고 발색시켜 관찰하였다. 표면전처치 픽과 드릴을 이용하여 와우의 모든 면의 골벽을 제거하여 골나선판(osseous spiral lamina), Corti 기관, 와우축(modiolus)을 남겼으며 면역조직화학염색법과 동일한 방법으로 염색하였다. 염색 후에는 해부현미경하에서 미세겸자로 조심스럽게 염색된 와우신경 부분을 잡은 후 다른 미세겸자를 이용하여 와우축의 층간의 경계 부위를 분쇄하여 층별로 조직을 분리하였다. 분리된 층의 골나선판 두꺼운 부위를 픽으로 제거하고, Corti 기관의 관찰에 방해가 되는 나선인대(spiral ligament)와 개막(tectorial membrane)을 미세가위로 제거하였다. 이렇게 표면전처치기법을 이용하여 준비된 와우 각층을 조직의 두께를 유지하도록 특별히 준비된 slide glass위에 층별로 전개하고 50% glycerol mount 하에 광학현미경으로 관찰하였다. 결과 면역조직화학염색 정상 기니픽에서는 interdental 세포, 지주세포(supporting cell), 외유모세포(outer hair cell), 기저막(basilar membrane), 변연세포(marginal cell)의 내측에서 양성반응이 관찰되었다(Fig. 1). Interdental 세포에서는 6개의 와우 중 5개(83%)에서 Reissner막 부착부위가 다른 부위보다 약간 강하게 염색됐으나 큰 차이는 없었다. 지주세포에서는 6개의 와우 전부(100%)에서 양성반응을 관찰할 수 있었고 특히 Deiters 세포에서 강한 양성반응이 나타났다.외유모세포는 6개의 와우 중 3개(50%)에서 양성반응을 발견 할 수 있었다. 그 염색 정도는 지주세포에 비하여 약하게 염색되었으며 양성반응을 보인 3개의 와우 중 2개는 기저부에 한 개는 첨부에 양성반응이 나타나는 등 매우 불규칙적인 반응양상을 보였고 심지어 거의 염색이 되지 않는 부위도 있었다. 내유모세포에서는 양성반응이 관찰되지 않았다. Cisplatin 주사군은 정상과 거의 유사하게 외유모세포보다는 주로 지주세포에 강하게 염색되었고 내유모세포는 염색되지 않았다. 외유모세포의 양성반응 양상은 정상 기니픽과 유사하게 매우 불규칙적으로 나타나서 분석에서 제외하였다. 시간 경과에 따른 지주세포의 양성반응 정도는 주사 후 1시간군은 정상과 큰 차이가 없었으나 주사 후 3시간, 6시간군은 시간에 경과에 따라 정상보다 상당히 증가하는 양상을 보였다. 6시간군의 400배 확대사진에서 양성반응은 주로 지주세포 중 Deiters 세포에서 강하게 관찰되었고 상대적으로 외유모세포는 약하게 염색되었다. 반면에 내유모세포는 전혀 염색되지 않았다. 주사 후 12시간, 24시간군에서는 다시 정상과 유사하게 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 2). 표면전처치 면역조직화학염색에서 지주세포에 강한 양성반응이 나타나므로 외유모세포와 지주세포의 염색정도를 비교하기 위하여 외유모세포의 핵과 지주세포의 세포질이 동시에 관찰되는 부위를 촬영하였다(Fig. 3). 정상에서 면역조직화학염색에서 관찰한 바와 같이 지주세포 중 Deiters 세포에 주로 양성반응이 나타났다. Cisplatin 주사군에서 양성반응의 정도는 면역조직화학염색에서와 같이 주사 후 1시간은 정상과 유사한 양상을 보였으나 주사 후 6시간에서 가장 강한 양성반응을 나타내었다(Fig. 3). 주사 후 5시간대의 한 와우에서 기저회전과 첨단회전을 동시에 관찰할 수 있었는데 기저회전보다는 첨단회전에서 양성반응이 더 강하게 나타났다. 고찰 Cisplatin은 항암제로서 널리 쓰이고 있지만 신장과 내이, 말초신경에 대한 부작용으로 인하여 그 사용이 제한되어 왔다. 하지만 투여 전 충분한 수액공급과 이뇨제의 사용은 신장독성을 감소시켰으며 그 결과 고용량의 cisplatin을 투여할 수 있게 되었다. 하지만 고용량 요법은 오히려 이독성과 말초신경병의 발병 가능성을 더 높여주게 되었다. 쥐에서 신장독성은 5∼10 mg/kg의 농도에서 나타나지만 이독성은 16 mg/kg의 농도에서 나타나며1) 임상연구에서도 신장독성이 이독성보다 낮은 cisplatin 농도에서 나타난다. 그 이유로는 아마도 신장이 와우에 비해 더 넓은 표면적과 더 많은 혈관분포를 갖고 있기 때문이라 생각되고 있다. 이번 실험에서도 기니픽의 이독성을 유도하기 위하여 신독성이 나타나는 용량(5 mg/kg) 보다 높은 8 mg/kg의 cisplatin을 주사하였다. 8 mg/kg의 용량은 이전 연구에서 확실한 이독성이 나타남이 증명되어 있는 양이다(발표예정). Cisplatin의 이독성은 주로 이명이 먼저 나타나고 4000∼8000 Hz 이상의 고주파영역의 난청이 나타난다. 하지만 3 kHz부분의 중간계(scala media)에 cisplatin을 직접 주입하면 3 k 2H대의 난청이 먼저 오고 이어서 내림프의 흐름과 같은 속도로 고주파영역의 난청을 관찰할 수 있다. 따라서 고주파영역의 혈액와우장벽(blood cochlear barrier)이 저주파영역보다 cisplatin에 대한 투과성이 더 높다고 할 수 있다. 이번 실험의 일부에서 관찰된 첨부와 기저부의 반응 차이는 cisplatin에 대한 혈액와우장벽의 투과성차이를 간접적으로 시사하고 있다. 다만 기저부에 비하여 첨부가 더 강하게 염색된 것은 아마도 기저부의 HSP 생성기능이 첨부보다 훨신 심하게 손상받았기 때문이라 사료된다. Cisplatin의 투여는 Corti 기관의 형태학적, 기능적 변화를 일으키는데 특히 와우기저부의 외유모세포가 선택적으로 파괴된다고 알려져 있다. 그 외에도 내유모세포, 지지세포, 혈관조의 손상도 알려져 있다. 하지만 Cisplatin에 의한 와우의 생화학적 변화에 대해서는 알려진 것이 거의 없다. 신장에 대한 연구는 활발하여 Bompart가 1989년에 신독성이 glutathione과 관계가 있을 것이라고 보고하였고6) Dolbyan 등이 1986년 쥐에서 superoxide dismutase와 antioxidant를 투여하여 cisplatin에 의한 신독성을 완화시켰다고 보고한 바 있다.7) 그 밖에 임상 및 동물실험에서 glutathione을 투여하여 신장을 보호할 수 있었고 aminoglycoside 이독성을 감소시켰다는 보고들이 있다.8) 와우에 대한 연구는 1995년 Ravi 등이 cisplatin 투여 후 내이에서 glutathione, glutathione peroxidase, glutathione reductase의 감소를 보고한 것이 거의 유일하다. 이러한 항산화체계의 기능저하는 세포막의 지질과산화를 유발하고 이는 세포파괴로 이어진다.1) Heat shock protein(HSP)은 1974년 Tissieres 등에 의해 열을 가한 초파리에서 발견되었다.이 단백은 열 뿐아니라 외상, 철분, 산화물, 허혈, 소음자극, 항생제 등의 자극으로도 발현된다고 알려져 있다. HSP은 그 크기와 역할에 따라 HSP 60 family, HSP 70 family, HSP 90 family, low molecular protein family 등으로 대분되며 각각의 family는 다시 여러 종류의 HSP으로 이루어 진다. 이중 가장 많이 연구되고 중요하게 생각되는 HSP는 HSP 70 family로서 적어도 4종 이상으로 이루어져 있다. 이과영역에 있어서 HSP 72의 연구는 과연 이 단백이 외유모세포에 대한 보호역할을 하느냐에 집중되어 있다. 전기생리학적연구에서 보면 와우에는 이전의 소음으로 활성화되어 외유모세포의 손상을 방지하는 능동적인 기전이 존재할 것이라는 보고가 많다.9)10) 이 기전은 확실하지는 않지만 아마도 HSP 72가 관여할 가능성이 높다고 생각된다. 동물실험에서도 Lim 등이 1993년 쥐에서 105 dB의 소음을 준후 HSP 72가 외유모세포에 선택적으로 발현함을 보고하여 HSP 72가 아마도 소음에 대한 보호작용을 할 것이라 추측하였고11) 임상적으로도 진행성 감각신경성난청 환자의 32%에서 HSP 72에 대한 항체가 발견되어 이런 가정을 뒷받침하고 있다.12) In vivo에서 cisplatin과 HSP의 관계에 대한 연구는 거의 없으며 대부분의 연구는 세포주(cell line)에서 시행되었다. 1996년 Matumoto 등이 사람의 glioblastoma 세포주에서 5 μg/ml의 cisplatin을 투여한 후 10시간 후에 HSP 72가 정상보다 3배 정도 증가하였음을 보고하였고13) 1997년에는 Kamishima 등이 사람의 난소 암세포주에서 cisplatin 투여 후 여러종류의 HSP 증가를 보고하면서 이 현상이 drug resistance에 큰 역할을 할 것이라 하였다.14) 1998년에는 Roigas 등이 inducible HSP70이 나타나는 thermotolerant 세포에서 cisplatin과 같은 항암제에 대해 더 높은 생존률을 보인다고 보고하였다.15) HSP 72의 와우내 분포를 살펴보면 외유모세포 뿐 아니라 다른 와우세포에서도 관찰된다. 면역조직염색을 해보면 정도의 차이는 있지만 내유모세포를 제외한 대부분의 세포에서 HSP 72의 발현을 관찰할 수 있는데 이는 자극의 종류나 실험동물에 따라 달라진다. 예를 들면 인간이나 원숭이는 외부자극이 없어도 HSP 72를 생산한다고 알려져 있다. 하지만 정상 토끼, 쥐, 생쥐나 져빌의 와우에서는 관찰되지 않고 소뇌나 대뇌의 일부분, 신장의 수질부위, 식도, 방광 등에서만 정상적으로 관찰된다. 정상 기니픽에서는 특이하게 정상 와우에서도 관찰된다. HSP 72는 주로 Corti기관의 Hansen 세포, inner and outer pillar 세포, Deiters 세포 등 지주세포에 분포해 있고 외유모세포에는 일부에서만 관찰된다. 그 외에 interdental 세포나 혈관조에도 관찰되나 내유모세포에서는 전혀 관찰되지 않는다.16) 본 연구에서 관찰된 정상 기니픽 와우의 염색 양상도 위의 보고와 동일한 양상을 보여주었다. 이렇게 정상적으로 존재하는 HSP 72의 역할에 대해서는 아직 모르고 있으나 아마도 미리 존재하는 HSP 72는 자극에 대한 HSP 72의 유도과정을 억제하는 역할을 하고 있다고 추측되며 같은 동물에서도 HSP 72가 존재하는 조직은 다른 조직보다 자극에 대한 HSP 72의 발현이 적다고 알려져 있다.17) HSP 72를 유도하는 방법에는 전통적으로 열을 가하는 방법이 주로 사용된다. 체온 상승에 따른 와우내 HSP 72의 발현은 기니픽에서는 정상에서와 같이 Corti기관의 지주세포에 주로 분포해 있고 외유모세포에는 일부에서만 관찰되며 그 외에 interdental 세포나 혈관조에도 관찰되나 내유모세포에서는 전혀 관찰되지 않는다. 이러한 HSP 72의 발현은 열자극 처음 1시간 후부터 증가하기 시작하여 6시간까지 증가하다가 그후 차츰 감소한다.18) 또한 열자극 직후에는 HSP 72의 핵전이(nuclear transition)가 관찰되고 이 현상 역시 열자극 6시간 후면 소실된다. 열자극에 따른 mRNA를 in situ hybridization으로 관찰한 바에 의하면 그 분포는 주로 Corti기관의 지주세포와 interdental 세포, 나선연(spiral limbus), 나선돌기(spiral prominence)에 나타나고 외유모세포에는 불규칙하게 관찰되어 열 자극 후 증가된 HSP 72의 분포와 잘 일치한다.19) 이번 실험에서도 열 자극에서와 유사하게 cisplatin 주사 3시간에서 6시간까지는 HSP 72가 점차 증가하는 양상을 보이다가 12시간 이후는 다시 정상수준으로 감소함을 관찰할 수 있었다. 하지만 그 증가정도를 정량적으로 나타낼 수 있는 가장 좋은 방법이 western blot인데 이번 연구에서는 증가정도를 증명하지 못하였다. 그 이유는 첫째, 먼저 전술한 대로 HSP이 constitutive 형태로 존재하는 경우 증가된 HSP이 negative feedback으로 작용하여 증가되는 양이 많지 않고, 둘째, 증가되는 정도가 지주세포 중 주로 Deiters 세포에 집중되어 Corti 기관만을 분리한 western blot이 필요한데 이런 경우 Corti 기관에서 미량의 HSP 증가만으로는 이미 HSP이 존재하는 정상 기니픽 와우와 비교가 힘들기 때문이다. 이상의 연구 결과를 종합해 보면 기니픽 와우에서 정상적으로 다량 존재하던 HSP 72가 cisplatin 투여 후 3시간 이후부터 증가하여 6시간 전후에 최고치를 보이다가 이후로 감소하는데 이때 증가정도는 면역조직염색법에 의하면 정상의 50% 이하로 추측된다. 증가부위는 외유모세포보다는 지주세포에서 뚜렷한데 이는 외유모세포의 HSP 생성기능이 지주세포 보다 훨 씬 심하게 손상되었기 때문이라고 생각되었다. 지주세포에서 관찰된 강한 HSP 양성반응의 의미를 확인하기 위하여 계속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다. 요약 기니픽에 cisplatin을 주사한 후 면역조직화학염색법과 표면전처치기법을 이용하여 HSP 72의 발현 양상을 관찰한 결과는 다음과 같다. 1) 정상기니픽에서도 HSP 72가 관찰되었는데 그 분포는 주로 Corti기관의 Hansen 세포,inner and outer pillar 세포, Deiters 세포 등 지주세포에 분포해 있었고 외유모세포에는 일부에서만 관찰되었다. 그 외에 interdental 세포나 혈관조에도 관찰되나 내유모세포에서는 전혀 관찰되지 않는다. 2) Cisplatin 주사 후 3시간에서 6시간까지는 HSP 72가 점차 증가하는 양상을 보이다가 12시간 이후는 다시 정상수준으로 감소함을 관찰할 수 있었다. 그 분포는 주로 지주세포 중 Deiters 세포에서 강하게 나타났다. 이상의 결과에서 cisplatin이 기니픽 와우에서 HSP을 유도한다는 가능성을 확인하였다. 다음 연구는 정량적인 분석을 위하여 HSP 72가 정상적으로 존재하지 않는 쥐 모델에서 동일한 실험을 시행하는 것이 필요할 것으로 사료되었다.
REFERENCES
1) MacAlpine D, Johnstone BM. The ototoxic mechanism of cisplatin. Hear Res 1990;47:191-204. 2) Ravi R, Somani SM, Rybak LP. Mechanism of cisplatin ototoxicity: antioxidant system. Pharmachology & Toxicology 1995;76:386-94. 3) Pappolla MA, Sos M, Omar RA, Sambamurti K. The heat shock/oxidative stress connection. Relation to Alzheimer disease. Mol Chem Neuropathol 1996;28:21-34. 4) Heufelder AE, Wenzel BE, Bahn RS. Methimazol and propylthiouracil inhibit the oxygen free radical-induced expression of 72 kilodalton heat shock protein in Graves’ retroocular fibroblasts. J Clin Endocrinol Metab 1992;74:737-42. 5) Schulesinger MJ. Heat Shock Protein. J Bio Chem 1990;265:1211-4. 6) Bompart G. Cisplatin-induced changes in cytochrome p-450, lipid peroxidation, and drug metabolizing enzyme activities in rat kidney cortex. Toxicol Lett 1989;48:93-9. 7) Dobyan DC, Bull JM, Streubel FR, Sunderland BA, Bulger RE. Protective effects of O-beta-hydroxyethyl-retoside on cisplatin induced acute renal failure in the rat. Lab Inv 1986;55:557-63. 8) Zenner HP, Keiner S, Zimmermann U. Specific glutathione-SH inhibition of toxic effects of metabolized gentamicin on isolated guinea pig hair cells. Eur Arch Otorhinolaryngol 1994;251:84-90. 9) Boettcher FA, Spongr VP, Salvi RJ. Physiological and histological changes associated with the reduction in threshold shift during interrupted noise exposure. Hear Res 1992;62:217-36. 10) Canlon B, Berg E, Flock A. Protection against noise trauma by pre-exposure to a low level acoustic stimulus. Hear Res 1988;34:197-200. 11) Lim HH, Jenkins OH, Myers MW, Miller JM, Altschuler RA. Detection of HSP 72 synthesis after acoustic overstimulation in rat cochlea. Hear res 1993;69:146-50.12) Billings PB, Keihley EM, Harris JP. Evidence linking the 68 kilodalton antigen identified in progressive sensorineural hearing loss patient sera with heat shock protein 70. Ann Otol Rhinol Laryngol 1995;104:181-8. 13) Matsumoto H, Hayashi S, Shiroura H, Ohtsubo T, Ohnishi T, Kano E. Suppression of heat-induced hsp72 accumulation by cisplatin in human glioblastoma cells. Cancer Lett 1996;110:253-7. 14) Kamishima T, Fukuda T, Yoshiya N, Suzuki T. Expression and intercellular localization of heat shock proteins in multidrug resistance of a cisplatin resistant human ovarian cancer cell line. Cancer Lett 1997;116:205-11. 15) Riogas J, Wallen ES, Loening SA, Moseley PL. Effects of combined treatment of chemotherapeutics and hyperthermia on survival and regulation of heat shock proteins in Dunning R3327 prostate carcinorma cells. Prostate 1998;34:195-202. 16) Neely JG, Thompson AM, Gower DJ. Detection and localization of heat shock protein 70 in the normal guinea pig cochlea. Hear Res 1991;52:403-6. 17) Manzerra P, Rush SJ, Brown IR. Tissue-specific differences in heat shock protein hsc70 and hsp70 in control and hyperthermic rabbit. J Cell Physiol 1997;170:130-7. 18) Thompson AM, Neely JG. Induction of heat shock protein in interdental cells by hyperthermia. Otolaryngol Head Neck Surg 1992;107:769-74. 19) Gower VC, Thompson AM. Localization of inducible heat shock protein mrna in the guinea pig cochlear with a nonradioactive in situ hybridization technique. Laryngoscope 1997;107:228-32.