| p53 Mutation Patterns in Primary Head and Neck Squamous Cell Carcinomas and Their Metastatic Neck Nodes. |
| Geon Choi, Jong Soo Lee, Dong Hee Yoo, Sung Won Chae, Kwang Yoon Jung, Jong Ouck Choi |
| Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Korea University College of Medicine, Seoul, Korea. Kughorl@nuri.net |
| 두경부 편평세포암종에서 원발암과 전이 림프절의 <i>p53</i> 변이 양상 |
| 최 건 · 이종수 · 유동희 · 채성원 · 정광윤 · 최종욱 |
| 고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실 |
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| 주제어:
두경부암. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Analysis of molecular events that occur during the evolution of head and neck squamous cell carcinoma has discovered multiple genetic changes, such as chromosomal abnormalities, activation of oncogenes, and inactivation of tumor suppressor genes. The involvement of p53 gene at the advanced tumor stage including lymph node metastasis has been demonstrated in head and neck cancers.
Although there is some evidences for the persistence of p53 mutation of lymph node metastasis in head and neck cancer, no systematic study has been carried out to elucidate the persistence of p53 mutations and together with intratumoral heterogeneity of p53 mutations in primary and metastatic head and neck cancers. The purpose of this study was to reveal the pattern and intratumoral heterogeneity of p53 mutations in primary head and neck squamous cell carcinomas and their metastatic lymph node.
MATERIALS AND METHODS:
In total 71 microdissected samples of primary tumors and their metastatic lymph nodes from 12 head and neck squamous cell carcinomas, exon 5 to 8 of p53 tumor supressor gene were analyzed by single strand conformational polymorphism and immunohistochemical study for the specimens.
RESULTS:
In eight of 12 cases, mutational inactivations were identified. Involved exons were five cases of exon 5, two cases of exon 8 and one case of exon 7. In all of eight cases, mutations were identical in the primary and all of its metastatic samples. In microdissected study to obtain tumoral clones, mutation of p53 showed identical kind of p53 mutation for both primary and metastatic samples.
CONCLUSION:
p53 mutations of primary and metaststic head and neck squamous cell carcinomas showed identical kind of p53 mutation with intratumoral heterogeneity. |
| Keywords:
p53 mutationㆍHead and neck cancerㆍSquamous cell carcinomaㆍLymph node metastasis |
서론
분자생물학의 발전으로 암이 발생하는 기전의 많은 부분을 이해하게 되었으며, 이중 괄목할만한 것 중의 하나가 암발생과정(oncogenesis)은 암유전자(oncogene)와 암억제유전자(tumor suppressor gene)가 변화하는 것을 비롯한 비정상적인 기능을 하는 염색체 및 유전자의 변화가 축적되어 나타나는 결과라는 사실이다.1) 현재까지 밝혀진 유전자 및 염색체의 변화 중에서 p53의 변이는 인체암 중 가장 흔한 유전자적 변화로 알려졌으며 두경부 편평세포암종에서도 p53 유전자의 변이는 연구자에 따라 다르지만 약 40%에서 60%로 보고되고 있다.2) p53의 정상적인 기능은 세포 주기의 조절, 전사의 조절 및 세포 분화의 조절이다. p53의 변이가 있을 때는 p53의 정상적인 기능을 소실하기 때문에 p53은 세포증식을 조절하는 기능을 잃게 된다.3) 인체암에서 p53의 변이는 exon 5, 6, 7, 8의 변이가 중요한 것으로 알려졌으나,4) 두경부 편평세포암종에서 원발암과 전이 림프절에서 p53의 변이에 관한 연구는 드물다. 인체에 발생하는 고형암(solid tumor)에서 같은 종양내의 부위별로 그 형태가 다른 형태학적 이질성(intratumoral phenotypic heterogeneity)을 관찰할 수 있으며,5) p53의 변이를 비롯한 유전자적 이질성(genotypic heterogeneity)도 같은 종양조직의 클론(clone) 또는 부위별로 있으리라 생각된다. 현재까지 종양에서 p53의 변이를 연구한 보고들은 적출한 종양을 동결하여 종양 전체 또는 일부 조직을 채취한 후 DNA를 추출하여 p53의 변이를 연구한 것들로 p53 유전자 변이를 종양내에서 부위별로 조사하여 이질성을 보고한 연구는 없었다. 최근에 p53 유전자의 변이가 있는 폐암 환자에서 야생형 p53 유전자를 이용한 유전자 치료를 시행하고 있으나,6) 이러한 치료를 두경부 편평세포암종에 적용하려면 종양 내에서 p53의 이질성 여부를 파악하는 것과 특히 두경부 편평세포암종에 있어서는 흔히 수반되는 경부 전이에 있어 p53의 변이를 이해하는 것이 중요하다. 따라서 p53 유전자 변이의 이질성 및 형태를 이해하는 것은 실제 인체에서 시행이 시작되고 있는 야생형 p53 유전자를 이용한 유전자 치료의 기초적 개념을 제공하는데 중요한 자료가 되리라 생각된다.
본 연구의 목적은 첫째 어떠한 exon의 변이가 두경부 편평세포암종의 원발부위와 전이림프절에서 존재하는가를 알아보고, 둘째 원발부위와 경부 전이 림프절의 파라핀 포매조직의 조직 절편에서 항 p53 항체를 사용하여 면역조직화학적 염색을 실시하고, 입체 현미경하에서 미세박리(microdissection)를 통하여 종양의 부위에 따른 종양세포군별로 polymerase chain reaction-single strand conformational polymorphism(PCR-SSCP)을 시행하여 각 환자의 종양 내에서 p53의 유전자 변이의 이질성 여부를 검색하고자 하는 것이다.
대상 및 방법
대상
경부 전이가 있었던 12례의 두경부 편평세포암종을 대상으로 하였으며, 경부청소술을 포함한 수술을 우선적으로 시행한 예들이다. 대상은 후두암 4례, 하인두암 3례, 구인두암 3례, 설암 2례로 이들의 병기는 제3병기가 1례였고 제 4 병기(AJCC 병기에 준함7))가 11례였다. 경부청소술은 다양한 술식으로 시술되었으며, 술후 방사선치료는 7례에서 실시하였다. 적출된 원발암과 경부 전이 림프절의 파라핀 포매조직의 절편에서 항 p53 항체를 사용하여 면역조직화학적으로 검색한 부위를 기준으로 원발 부위 36, 전이 림프절 35부위, 총 71부위를 검색하였다(Table 1).
면역조직화학적 염색
면역조직화학적 염색은 헤마톡실린-에오신 염색 슬라이드를 검색, 실험에 사용할 파라핀 포매조직을 선택하여 4 μm의 절편을 만든 다음 슬라이드를 제작하였다. 앞에서 제작된 슬라이드는 실렌(xylene)에 3분간 2회 처리하여 파라핀을 제거하고, 100%, 90%, 80%, 70% 에타놀과 증류수의 순서로 처리하여 함수시켰다. 면역조직화학적 염색은 내인성 과산화 효소(endogenous peroxidase)의 활동을 억제하기 위하여 3% 과산화수소가 포함된 메타놀 용액에 10분간 처리한 후 아비딘-비오틴-복합체법(avidin-biotin complex)을 사용하였다. 항체는 단클론성 항 p53 항체(clone DO7, 미국 Biogenex사 제품)를 사용하였으며 발색은 diaminobenzidine으로 발색하였다. 대조 염색은 Mayer씨 헤마톡실린(Mayer’s hematoxyline)으로 하였다. 양성의 판정은 종양의 세포핵에 갈색으로 염색된 세포가 집단을 이루는 절편으로 하였다(Fig. 1).
PCR-SSCP
PCR-SSCP를 위한 절편의 제작은 10 μm의 두께로 만들어 파라핀을 제거하고 헤마톡실린-에오신 염색을 실시한 후 유리덮게(cover glass)는 덮지 않았다. PCR을 위한 세포의 채취는 통상적인 헤마톡실린-에오신 및 면역조직화학적 염색 슬라이드를 참조하여 종양세포를 입체 현미경하에서 25 게이지 주사 바늘을 사용 종양 세포를 미세박리하여 PCR tube에 채취하였다(Fig. 2).
Outer PCR은 채취한 종양 세포에 Gene releaser(미국 Bioventure사 제품)을 첨가 exon 5에서 exon 8까지의 primer(5’-CCT GCC CTC AAC AAG ATG TT-3’, 5’-GTG GTG AGG CTG CCC TTT CT-3’)를 사용하여 PCR을 시행하고 이의 산물은 3% 저온 용해 아가로스 겔(low-melting agarose gel)로 전기 영동하여 에티디움 브로마이드(ethidum bromide)로 염색하였다. 염색된 DNA는 저온 용해 아가로스 겔과 함께 채취 하여 증류수에 녹여 exon 5(5’-AAC AAG ATG TTT TGC CAA C-3’, 5’ AGC AAT CAG TGA GGA ATC AG-3’), exon 6(5’-TGG TTG CCC AGG GTC CCC AG-3’, 5’-CTC AGG CGG CTG CCC AG-3’, 5’-CTC AGG CGG CTC ATA GGG CA-3’), exon 7(5’-CTC TGA CTG TAC CAC CAT C-3’, 5’-AGG GGT CAG CGG CAA GCA GA-3’), exon 8(5’-TTG GGA GTA GAT GGA GCC T-3’, 5’-CGG AGA TTC TCT TCC TCT GT-3’)의 각각의 primer를 사용하여 nested PCR을 시행하여 아가로스 겔에 전기 영동하여 충분한 DNA가 확보되었는지 여부를 확인하였다(Fig. 3).
PCR-SSCP 방법은 nested PCR 산물에 32P-dCTP를 첨가하고 exon 5, exon 6, exon 7, exon 8의 각각의 pri-mer(nested PCR에 사용하였던 동일한 primer)를 사용 PCR을 시행하여 PCR 산물을 얼음으로 식힌 후 저온에서 SSCP용 염색액(90% formamide와 20 mM EDTA 함유)를 첨가 30% denaturing 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)에 3시간에서 5시간 동안 전기 영동을 실시하였다. 전기영동한 겔은 건조기에 말려 방사선 필름(미국 Kodak사 제품)에 노출후 현상하여 변이가 있는 sample을 확인하였다(Fig. 4). 음성 대조로는 p53의 변이가 없음이 확인된 H460 세포주의 DNA를 사용하였다.
결과
면역조직화학적 염색
면역조직화학적 염색 결과 전체 12례중 8례(66.7%)는 1부위 이상의 양성인 부위가 있었으며, 양성인 부위를 갖는 8례(환자 1, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 12)는 50 부위중 32부위(64.0%)에서 양성 소견을 보였다. 또한 양성 부위를 갖는 8례 모두는 원발부위 및 전이 림프절에서 양성인 부위와 음성인 부위가 동시에 존재하는 이질성이 관찰되었다(Table 2).
PCR-SSCP
PCR-SSCP의 결과는 면역조직화학적 염색의 결과와 마찬가지로 전체 12례 중 8례(66.7%)에서 1부위 이상에서 양성 소견을 보였으며, 양성인 부위를 갖는 8례(환자 1, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 12)는 50 부위 중 35 부위(70.0%)에서 양성 소견을 보였다. 양성 소견을 보인 8례 중 5례는 exon 5의 변이, 2례는 exon 8의 변이, 1례는 exon 7의 변이가 각각 관찰되었다. 양성 부위를 갖는 8례 모두는 면역조직화학적 염색에서 관찰된 결과와 마찬가지로 원발부위 및 전이림프절에서 양성인 부위와 음성인 부위가 동시에 존재하는 이질성이 관찰되었다(Table 2).
면역조직화학적 염색과 PCR-SSCP의 비교
면역조직화학적 염색에서 양성을 보인 32부위 중 28부위(87.5%)는 PCR-SSCP에서 양성 소견을 보였고, 4부위(12.5%)는 음성 소견을 보였다. PCR-SSCP에서 양성 소견을 보인 35부위 중 31부위(88.6%)는 면역조직화학적 염색에서 양성 소견을 보였고 4부위(11.4%)는 음성 소견을 보였다(Table 2).
고찰
두경부 편평세포암종에서 원발 병소의 병기가 진행된 예에서 경부 전이가 많은 것이 일반적으로 알려진 사실이지만 원발 병소의 병기가 진행되지 않은 조기암에서 임상적으로 예측하지 못하였던 경부 전이를 일으킨다거나 반대로 원발 병소의 병기가 진행되어도 경부 전이가 없는 예를 볼 수 있다.8) 이렇게 원발 병기가 낮아도 경부 전이를 일으키는 것으로 보아 원발 종양의 종양 생물학적 특성이 경부 전이에 관여하는 것으로 생각되어 이러한 종양 생물학적 특성을 찾고자 많은 연구가 이루어졌다. 원발 종양의 종양 생물학적 특성중 nm23 발현의 감소,9) 종양내 신생혈관 수의 증가,10) 세포증식지수의 증가11) 등이 종양에서 전이를 쉽게하는 요인이라는 연구 결과들이 있었다. 최근 Shin 등12)은 적극적인 국소치료를 실시한 두경부 편평세포암의 원발 종양에서 p53의 면역조직화학적 검색을 실시하여 원발 종양에서의 p53의 과표현이 경부 전이를 비롯한 재발을 예측하게 하는 예후 인자로의 가치를 보고하였다. 그외 두경부암에서 p53에 관한 중요한 연구들로 Boyle 등13)은 두경부 편평세포암종에서 종양이 진행할수록 p53의 변이의 빈도가 높아진다고 보고하였고 Chung 등4)은 상부 기식도관(upper aerodigestive tract)에 발생하는 일차암(primary tumor)과 이차암(second primary tumor)에서 p53의 변이의 형태가 서로 다르다는 것을 밝혀 두경부암에서 영역암발생(field cancerization)의 분자생물학적 증거를 보고하였으며, Nees 등14)은 두경부 편평세포암종에서 암조직 외에도 암조직에서 멀리 떨어진 정상 상피조직에서도 p53의 과표현이 있다는 보고를 하였다. 이들 이외에도 p53에 관한 연구는 여러 학자들에 의해 많은 연구가 이루어졌으나 p53의 변이의 종양내 이질성에 관한 연구는 없었다.
본 연구에서 원발 종양에서 p53의 변이가 있었던 예에서는 같은 변이가 전이 림프절에서도 관찰되었으며 원발암에서와 마찬가지로 전이 림프절에서도 p53의 변이가 있는 부위와 없는 부위가 공존하는 p53 변이 여부의 이질성이 같은 환자의 종양 내에서 관찰 되었다. 이렇게 p53 변이의 이질성이 관찰된 것은 p53에 관한 연구 중 중요한 소견의 하나로 생각된다. 이러한 결과는 본 실험에서 p53의 면역조직화학적 염색 결과에 따라 종양의 부위별로 미세 박리하여 p53의 변이 여부를 관찰하였기 때문에 가능하였으며 타 부위 고형암의 원발암과 전이암에서 p53의 변이를 관찰한 타 연구15)에서는 관찰하지 못한 소견이다.
Liu 등16)은 p53의 변이가 있는 세포주에서 recombinant adenovirus를 통하여 야생형 p53 유전자를 주입하여 세포의 성장이 억제되는 것을 관찰하였고, Roth6)는 기관지를 막고 있는 말기 폐암환자 중 p53의 변이가 있는 예들에서 야생형 p53과 재결합한 retrovirus를 기관지경을 통하여 기관지에 주입하는 임상 치료를 시행하였다. 그러나 시험관 내에서 동일 클론의 세포주에 야생형 p53을 주입하여 종양의 성장이 억제되는 것을 관찰한 실험16)과는 달리 Roth 등6)의 결과는 9명의 환자중 3명에서만 종양의 퇴행(regression)을 보였다. 본 연구에서 관찰하였듯이 동일 환자의 종양에서 p53 변이가 있는 부위와 없는 부위가 함께 존재하는 유전형의 이질성은 인체의 고형암에서는 유전자 치료의 한계를 예측하게 하는 하나의 중요한 증거로서의 가치가 있다고 생각되지만 향후 이에 관해 결론을 얻기 위하여는 실제 환자를 통한 실험을 포함한 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다.
이 실험에서 원발암에서 p53의 변이가 있었던 예는 전이 림프절에서도 같은 변이가 관찰되었으나 원발암 및 전이 림프절에서 p53의 변이의 이질성이 존재하고 또한 12례 중 4례에서는 p53의 변이가 관찰되지 않는 것으로 보아 p53의 변이가 전이과정에 필수적인 역할을 하는 것으로는 생각되지 않았다. 폐암에서 원발암과 전이암에서 p53의 변이를 연구한 Reichel 등15)은 대부분의 예에서 원발암과 전이암에서 같은 종류의 p53의 변이가 관찰되었다고 하여 본 연구와 유사한 결과를 보고하였으나 이들의 연구에서는 종양내 p53의 변이의 이질성은 조사하지 않았다. 본 연구에서는 대상환자 수가 적고 경부 전이가 있었던 두경부 편평세포암종에서 p53의 변이를 관찰하였기 때문에 원발종양에서 p53의 변이 여부와 경부 전이와의 관계를 찾기는 어려웠으나, 12 례중 8례에서 변이가 있었으며 이들은 exon 5의 변이가 5례, exon 8의 변이가 2례, exon 7의 변이가 1례에서 보여 exon 5의 변이가 가장 흔하게 나타났다. Exon 5, 7, 8의 변이의 존재는 Chung 등4)의 연구와 유사하였으나 Chu-ng 등4)의 연구에서는 exon 5, 7, 8의 변이의 빈도가 유사하였다 하여 빈도에서는 본 연구와는 차이를 보였다.
재배열(rearrangement), 결손(deletion), 삽입(insertion), 점변이(point mutation) 등 p53의 변화는 인체의 여러가지 암종에서 보고되고 있으며 이중 가장 흔한 유전자적 변화는 점변이이다.2) 이러한 유전자적 변화를 관찰하는 방법은 restriction fragment length polymorphism(RFLP),17) PCR-SSCP,4) 및 면역조직화학적 염색,14) DNA 염기서열법4)등이 흔히 사용되고 있으며, 본 연구에서 사용한 면역조직화학적 염색과 PCR-SSCP의 방법은 많은 재료를 쉽게 처리할 수 있는 장점을 가지고 있다. 본 연구에서 면역조직화학적 염색에서 양성을 보인 32부위중 28부위(87.5%)에서 PCR-SSCP에서 양성소견을 보였고, 4부위(12.5%)에서는 음성소견을 보였다. PCR-SSCP에서 양성소견을 보인 35부위중 31부위(88.6%)에서 면역조직화학적 염색에서 양성소견을 보였고 4부위(11.4%)에서 음성소견을 보이는 등 서로간의 불일치를 보였다. 이러한 결과는 실제 DNA의 변이가 없는 정상적인 야생형 p53의 안정화로 면역조직화학적으로 양성반응을 보일 수도 있고, p53의 변이가 있어도 non-sense 변이가 있거나 p53 자체의 결손이 있으면 면역조직화학적으로 검출되지 않기 때문으로 설명하고 있다.18) 이 실험의 방법으로는 p53의 결손이 있는 예는 면역조직화학적 방법이나 PCR-SSCP으로 검색할 수 없으며 이 연구에서는 PCR-SSCP의 이상 소견을 보인 검체에서 DNA 염기서열을 기술적인 문제로 실시하지 못하여 향후 이러한 실험방법에 대하여 보완해 나갈 예정이다.
요약
원발 부위와 경부 전이 림프절에서 종양의 부위에 따른 종양 세포군 별로 p53의 변이를 관찰하여, 어떠한 exon의 변이가 두경부 편평세포암종의 전이와 연관이 있는가를 알아보고, 각 환자의 종양 내에서 p53 유전자 변이의 이질성 여부를 검색하고자 두경부 편평세포암종 중 경부 전이가 있었던 12례에서 원발 부위와 전이 림프절에서 부위별로 p53에 대한 면역조직화학적 염색을 실시하고 종양 세포를 미세분리하여 PCR-SSCP를 시행하여 다음과 같은 성적을 얻었다.
p53 변이가 발견된 8례에서 원발암과 전이 림프절 모두에서 종양의 부위별로 변이가 있거나 없는 부위가 함께 존재하는 p53의 변이의 이질성을 관찰할 수 있었고 변이가 관찰된 예에서는 원발암과 전이 림프절에서는 동일한 변이가 발견되었으며 관찰된 변이는 exon 5의 변이가 5례, exon 8의 변이가 2례, exon 7의 변이가 1례이었다.
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