| Amplification of Cyclin D1 in Head and Neck Squamous Cell Carcinomas. |
| Kyung Tae, Hyung Seok Lee, Chul Won Park, Kyung Sung Ahn, Youl Hee Cho, Gu Kong |
1Department of Otolaryngology, College of Medicine, Hanyang University, Seoul, Korea.
2Department of Medical Genetics, College of Medicine, Hanyang University, Seoul, Korea.
3Department of Pathology, College of Medicine, Hanyang University, Seoul, Korea. |
| 두경부 편평세포암에서 Cyclin D1 유전자의 증폭에 관한 연구 |
| 태 경1 · 이형석1 · 박철원1 · 안경성1 · 조율희2 · 공 구3 |
| 한양대학교 의과대학 이비인후과학교실1;유전학교실2;조직병리학교실3; |
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| ABSTRACT |
BACKGROUND:
Amplification of the chromosome 11q13 region has been observed in a variety of human cancers, including head and neck squamous cell carcinoma and carcinomas of breast, esophagus, lung, bladder, and liver. The chromosome 11q13 region has various putative oncogenes, of which cyclin D1 is most consistently amplfied and overexpressed.
OBJECTIVES:
To estabilsh the frequency and clinicopathologic correlations of cyclin D1 amplification in head and neck squamous cell carcinomas.
MATERIALS AND METHODS:
Fresh tissue samples were obtained from 26 patients with head and neck cancers undergoing surgery or biopsy. Amplification of cyclin D1 was evaluated in 26 head and neck squamous cell carcinomas by Southern blotting. The presence or absence of amplification was correlated with anatomic site, tumor stage, and differentiation pattern.
RESULTS:
Five tumors of 26(19%) showed a twofold to 4-fold amplification of cyclin D1 compared with beta-actin control prove. Amplified and nonamplified groups revealed no differences in anatomic primary site, stage, N stage, and pathologic differentiation.
CONCLUSION:
We showed a significant incidence of cyclin D1 amplification in head and neck squamous cell carcinomas, but cannot demonstrate an association with clinical presentation and pathologic findings. |
| Keywords:
Cyclin D1ㆍHead and neck carcinomaㆍSouthern blot |
서론
세포주기의 조절과 암발생 과정(oncogenesis)은 매우 밀접한 관계가 있으며 세포주기 과정의 이상이 암발생과 연관이 있다고 최근 알려지고 있다. 세포주기 조절에 관련된 인자중 특히 cyclin, cyclin-dependent kinase(CDK), cyclin-CDK 혼합물 그리고 cyclin-dependent kinase inhibitor(p16, p15)의 상호관계와 암발생과정에서 각각의 역활이 종양에 따라 상이하다고 보고되고 있다.
Cyclin은 세포주기를 조절하는 주 단백질로 생각되며 이는 cyclin-dependent kinase에 결합하여 이 효소의 활성도를 조절하여 세포주기를 조절한다. Cyclin은 크게 G1기에서 S기로, G2기에서 M기로 이동하는 check point를 조절하는데 이에 따라 전자에 관여하는 cyclin은 G1 cyclin, 그리고 후자에 관여하는 cyclin은 M cyclin이라 하며 G1 cyclin에는 D와 E, M cyclin은 A와 B 등이 있다. 이중 cyclin D는 가장 중요한 조절인자로서 R point cyclin이라 부르며 지금까지 cyclin D1, D2, D3가 알려져 있다. 그중 cyclin D1 유전자증폭은 암발생 및 암의 악성도와 관계가 있는 암유전자로 인정되고 있다. Cyclin D1 유전자가 있는 염색체 11q13 영역의 증폭이 식도암1), 유방암2), 두경부 편평세포암3) 및 폐암4) 등에서 발견되었으며 이 11q13의 증폭이 임상적 예후와 연관이 있다고 하였다. 유방암에서 증폭이 있는 경우 예후가 나쁘다고 하였으며2) 두경부편평세포암에서는 경부림프절 전이나 낮은 생존율과 연관이 있다 하였다.5)6)7)
이에 저자들은 두경부 편평세포암조직에서 Southern blotting방법을 이용하여 cyclin D1 유전자의 증폭을 조사하고 이와 여러 위험인자 즉, 종양의 병기 및 병리학적 분화도 등과의 연관 관계를 알아보고자 하였다.
연구재료 및 방법
1. 연구재료
연구 재료는 1995년 3월부터 1996년 5월까지 한양대학교병원 이비인후과에서 두경부 편평세포암으로 수술적 치료나 조직검사로 얻은 신선냉동조직 26례를 대상으로 하였으며 조직을 채취한 후 바로 -70℃ 냉장고에 보관하였다가 실험에 이용하였다. 26례중 후두암이 11례, 구강암이 9례, 구인두암이 3례, 하인두암이 3례였다. 남자가 20례, 여자가 6례였으며 연령분포는 28세에서 80세까지로 평균 59세였다. 환자의 병기분류는 AJCC의 TNM분류법에 따라 분류하였다.
2. 연구방법
-70℃에 냉동보관된 조직에서 QIAamp Tissue Kit(Qiagen)을 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. 정상인의 백혈구에서 DNA를 얻어 음성대조군으로 이용하였으며 A431 세포주의 DNA를 양성대조군으로 이용하였다. 추출한 각 DNA에서 10μg을 취하여 제한효소인 EcoRI로 DNA를 자른 후 1% agarose gel에서 전기영동하였다. 다음 나일론지인 Hybond N＋ membrane(Amersham)흡착지에 이전시켰다. 32P가 결합된 cyclin D1 소식자를 이용하여 Southern hybridization을 시행하였으며 Southern blotting의 대조군으로 β-actin 소식자를 이용하였다. 사용된 cyclin D1과 β-actin 소식자는 정상 태반 RNA에서 RT-PCR방법을 이용하여 제조하였다. 보합결합이 끝나면 건조된 흡착지위에 X-ray 필름을 놓고 감광시킨 다음 BAS-1500(Fuji)기기를 이용하여 보합결합 시그널을 인식하고 보합결합 띠의 강도는 TINA program을 이용하여 측정하였다. β-actin 띠에 비하여 cyclin D1 띠의 강도가 큰 경우를 증폭된 것으로 측정하였다. 통계처리는 Fisher’s Exact test를 이용하였다.
결과
총 26례중 5례(19%)에서 2내지 4배의 cyclin D1 유전자의 증폭이 있었다(Fig. 1). 증폭된 예는 후두가 2례, 구강이 1례, 구인두가 1례, 하인두 1례 등으로 원발부위에 따른 cyclin D1의 증폭은 통계학적 차이가 없었다(Table 1). 종양의 병기에 따른 cyclin D1의 증폭은 stage II가 5례중 2례, stage III가 6례중 2례, Stage IV가 13례중 1례로 통계학적 의의가 없었다(Table 2). 경부림프절 전이유무에 따른 cyclin D1의 증폭은 림프절전이가 있었던 경우가 16례중 3례, 없었던 경우가 10례중 2례로 통계학적 차이가 없었다(Table 3). 병리조직학적 분화도에 따른 cyclin D1의 증폭은 분화도가 좋았던 9례중 2례에서 증폭이 있었으며 중증도 분화도의 경우는 7례중 1례, 분화도가 나쁜 경우는 10례중 2례에서 증폭이 있어 분화도와 cyclin D1의 증폭과는 통계학적 의의가 없었다(Table 4).
고찰
11번 염색체 단완 13에는 bcl-1, cyclin D1(PRAD1), FGF3(INT2), FGF4(HST1), EMS1 등의 유전자가 위치해 있으며 이 영역의 증폭이 두경부암, 식도암, 폐암 및 유방암 등의 여러 암조직에서 발견되고 있으며 이들 유전자의 증폭이 이들 암발생과 많은 연관이 있을 것으로 추정되고 있다. 이들 유전자는 단독이나 공동으로 증폭되며 이들 유전자중 FGF3(INT2)와 FGF4(HST1)는 많이 증폭되지만 과발현되지는 않아 중요한 암유전자는 아닌 것으로 사료된다.8) Bcl-1은 FGF유전자에서 중심절(centromere)쪽으로 위치하며 이 영역은 어떤 유전자를 코딩한다기 보다는 B-cell non-Hodgkin’s lymphoma에서 발견되는 t(11：14)(q13；32)의 염색체전좌(translocation)되는 부위로 알려져 있다.9) 이 bcl-1의 분절점에서 telomere쪽으로 110kb 떨어져 있는 cyclin D1 유전자(CCND1)는 원래 PRAD1 암유전자로 알려졌으며 세포주기와 세포증식의 조절에 관여하고 있다.10)
세포주기의 조절에 있어서 2개의 중요한 조절부위가 있는데 이는 G1-S 이행기와 G2-M 이행기로 이중 G1-S 이행기가 가장 중요하며 이는 START(R site)로 불리운다. 이들 조절부위에 작용하는 중요 인자는 cyclin, cyclin-dependent kinase(CDK), cyclin-dependent kinase inhibitor(CDKI) 등이 있다. START점에서 cyclin D1이 양성조절자로 작용하며 Rb 단백과 cyclin-dependent kinase inhibitor(p16)가 음성조절자로 작용한다. D cyclin은 D1, D2, D3의 종류가 있는데 이들 D cyclin은 CDK4나 CDK6와 결합하여 cyclin-CDK 혼합물을 형성하여 G1기에서 S기로 세포분열이 진행되도록 한다.11)12) Cyclin D1은 부갑상선종에서13) 11번 염색체 p15와 q13의 전위(inversion)에 의해, centrocytic B cell lymphoma에서는9) bcl-1 분절점에서 염색체전좌에 의해 과발현되며 유방암, 위암, 식도암, 방광암, 두경부암 등에서는 유전자증폭에 의하여 과발현된다.
Cyclin D1이 암발생과정에 관여 된다는 증거는 이 cyclin D1이 암억제단백인 Rb단백을 조절한다는 것이다. Rb단백은 G1기에 저인산화 상태로 있다가 S기 직전에 인산화되는데 저인산화 Rb단백은 G1기에서 세포주기를 억제하며 Rb단백이 인산화되면 이 억제효과가 없어진다.14) Cyclin D1은 CDK4와 결합하여 cylin-CDK혼합물을 만들어 Rb단백을 인산화시키고 전사인자인 E2F를 방출하여 G1기에서 S기로의 이행을 촉진한다.15) Cyclin D1은 또 세포분화에도 관련되는데 이 cyclin D1에 이상이 생기면 비정상적으로 성장호르몬 등으로부터 자극을 받아 분화하기 보다는 계속 세포분열을 하게 된다.10) 그리고 cyclin D1은 다른 암유전자와 공동으로 작용하여 형질변형을 야기하는데 쥐의 신장세포주에서는 ras암유전자와 같이 작용하며14) transgenic mice에서는 myc암유전자와 같이 작용하여 B 림프종을 야기한다.16)
EMS1 유전자는 cyclin D1 유전자에서 telomere쪽으로 약800kb정도 떨어져 위치하며 대개 cyclin D1 유전자와 공동으로 증폭된다.17) EMS1은 조류의 cortactin이라는 유전자와 비슷하며 F-actin binding protein과 연관된 cytoskeletal protein을 코딩하는 유전자로 이 EMS1의 과발현은 암의 침습성과 연관이 있다 한다.18)
여러 암종에서 염색체 11q13의 증폭과 임상 예후와의 관련성에 대한 보고가 있는데 Mori19), Kitigawa 등은1) 식도의 편평세포암에서 염색체 11q13 증폭이 전신전이와 연관이 있으며 생존율을 감소시킨다 하였다. Berenson 등에4) 의하면 폐암에서 염색체 11q13의 증폭이 있는 경우 진행된 원발암이나 분화도가 나쁜 것과 연관이 있다 하였으며 두경부암에서도 비슷한 결과를 보고하였다.3) Schuuring 등은2) 유방암에서 cyclin D1의 증폭이 나쁜 예후와 연관이 있다 하였으며 Muller 등은5) FGF4와 bcl-1유전자의 동반 증폭이 두경부 편평세포암의 57%에서 있었으며 이는 경부림프절전이나 임상적으로 진행된 병기와 상관관계가 있다 하였다. Michalides 등은20) 면역조직화학법에 의한 연구에서 cyclin D1의 과발현이 47례중 30례(64%)에서 있었으며 이는 낮은 생존율과 연관이 있다 하였다. 그러나 Leonard 등은21) 두경부 편평세포암에서 증폭과 생존율과는 관계가 없다 하였으며 Davidson 등도22) cyclin D1의 증폭이 두경부 편평세포암의 22%에서 있었으나 임상병기나 병리학적 인자와는 연관이 없다 하였다. Williams 등은8) 두경부편평세포암에서 염색체 11 q13의 증폭이 36%에서 있었고 cytologic grade나 growth pattern 및 하인두 원발부위와 연관이 있다 하였으며 Meredith 등은6) 낮은 생존율과 연관관계가 있다 하였다.
저자들의 연구에서 26례중 5례(19%)에서 cyclin D1유전자의 증폭이 있었으며 이와 원발부위, 임상적 병기, 경부림프절 전이유무, 암세포의 병리학적 분화도와는 상관관계가 없었다. 앞으로 이들 환자들을 장기 추적하여 cyclin D1의 증폭과 예후와의 관계를 분석하여야 할 것으로 사료된다. 환자 증례수가 적어 여러 위험인자와의 상관관계를 알아보기가 어려웠기 때문에 좀더 많은 예의 두경부암의 신선냉동조직을 대상으로 하여 cyclin D1유전자의 증폭과 여러 임상적, 병리학적인 인자들과의 상관관계를 살펴보아야 할 것으로 사료된다.
결론
26례의 두경부 편평세포암조직을 대상으로 Southern blotting방법을 이용하여 cyclin D1유전자의 증폭을 알아 본 결과 5례(19%)에서 증폭이 있었다. 이로 미루어 cyclin D1증폭이 두경부 편평세포암의 발생과정에 관여할 것으로 추측되며 cyclin D1증폭과 종양의 원발부위, 종양의 병기, 경부림프절 전이유무 및 병리조직학적 분화도 등과는 연관관계가 없었다.
REFERENCES
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