| Morphologic Change of Nasal Epithelium in Animal Model with Nasal Hyperreactivity. |
| Weon Jo Choi, Jin Uk Jeong, Woo Jin Jeon, Ki Sang Rha, Chan Il Park |
| Department of Otolaryngology, College of Medicine, Chungnam National University, Taejon, Korea. otolar@chollian.net |
| 비과민성 동물 모델에서 비상피층의 형태학적 변화 |
| 최원조 · 정진욱 · 전우진 · 나기상 · 박찬일 |
| 충남대학교 의과대학 이비인후과학교실 |
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| 주제어:
비과민성ㆍTDIㆍ광학현미경ㆍ전자현미경. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND:
Nasal hyperreactivity is a cardinal pathophysiological feature in allergic or nonallergic rhinitis. However, the mechanisms underlying nasal hyperreactivity are largely unknown. One of the proposed mechanisms is that epithelial damage may contribute to the development of nasal hyperreactivity. However, it is hard to find studies on this topic.
OBJECTIVE: The aim of this study is to demonstrate whether the morphological change of nasal epithelium exists in animal model with nasal hyperreactivity or not.
MATERIALS AND METHODS:
Guinea pigs were sensitized in 10% TDI-ethyl acetate solution for 5 days, after which a recess of 3 weeks were allowed before exposing them in 5% TDI-ethyl acetate solution twice a week for 4 weeks. Thereafter, we observed the morphologic change of nasal mucosa with a light microscope and an electron microscope.
RESULTS:
Under the light microscopic observation, there were no morphological changes including epithelial damage in the TDI-provoked group. Under the electron microscopic, however, the widening of the intercellular space, the disruption of the basement membrane and the cytoplasmic vacuolization were observed.
CONCLUSION:
Morphological changes of the nasal epithelium were found in the animal model with nasal hyperreactivity under electron microscopic observation. Further studies to verify the relationship between the morphological changes and the nasal hyperreactivity will be needed. |
| Keywords:
Nasal hyperreactivityㆍTDIㆍLight microscopyㆍElectron microscopy |
서론
기관지천식 환자는 특이적 자극뿐 아니라 비특이적 자극에 대하여도 과민성을 보이며, 이러한 기관지과민성은 기관지천식의 근본적 병태생리이다.1) Ohashi 등2)은 천식 환자의 기관지점막에서 상피세포간극의 확대와 폐쇄소대의 개대 등의 소견을 관찰하였고, 확대된 세포간극과 폐쇄소대에서 호산구와 그 과립들이 발견되어 활성화된 호산구의 침윤이 이러한 변화를 일으키는데 연관이 있을 것이라고 하였으며, Flavahan 등3)은 활성화된 호산구로부터 분비되는 과립단백질인 major basic protein(MBP), eosinophil cationic protein(ECP) 등에 의해 기관지 점막상피가 파괴되고 따라서 감각신경종말이 외부에 노출됨으로써 기관지과민성이 일어날 수 있을 것이라 하였다.
최근 기관지천식에서와 마찬가지로 알레르기성비염 및 비알레르기성비염의 병태생리에서도 비과민성이 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다.4-6) 그러나 이러한 질환에서도 기관지천식에서와 마찬가지로 상피세포의 탈락, 폐쇄소대의 개대, 상피간극의 확대 등의 상피손상이 발견되는지, 그리고 이러한 상피손상이 비과민성의 형성에 중요한 역할을 하는지 여부는 아직 확실치 않다.
이에 저자는 비과민성을 보이는 질환에서도 비점막상피의 손상이 나타나는지 알아보기 위하여 이미 작업장에서 천식양증상과 비과민성을 초래하는 것으로 알려진 toluene 2,4-diisocyanate(TDI)6-8)를 기니픽의 비전정에 국소도포하여 감작, 유발시킨 후 광학현미경과 투과전자현미경을 이용하여 비점막의 형태학적 변화유무를 관찰하였다.
실험 대상 및 방법
비과민성 동물 모델의 제작
Tanaka7)8)의 방법을 약간 변형하여 비과민성 동물모델을 만들었다. 체중 300∼500 g의 건강하고 상기도감염의 증상이 없는 기니픽 20마리를 사용하여, 10% TDI ethyl acetate 용액을 이과용 면봉을 이용하여 동물의 양측 비전정에 1일 1회, 연속 5일간 도포하고 감작시킨 후(감작도포기간), 3주간 무처치 기간을 둔 뒤(도포휴지기간), 감작시와 같은 방법으로 5% TDI ethyl acetate 용액을 이용하여 1주에 2회씩 4주간 유발시켰다(유발도포기간).
실험군 및 대조군의 분류
아무런 처치도 하지 않은 정상군을 Group A, TDI 감작도포실시 후 24시간 후에 희생한 동물을 Group B, TDI 감작 후 3주간의 도포휴지기간 후에 희생한 동물을 Group C, 도포휴지기간을 지난 후 유발기간동안 TDI를 사용하지 않고 용매인 ethyl acetate만을 2주, 4주간 도포한 동물을 각각 Group D, E, 4주의 유발도포기간 중 2주간 총 4회 도포를 시행한 뒤 24시간 후에 희생한 동물을 Group F, 4주간 총 8회 도포 후 마지막 유발도포 24시간 후 희생한 동물을 Group G로 하였다(Table 1, Fig. 1).
증상의 평가방법
TDI 도포시 동물들은 재채기, 수성비루, 킁킁거림 등 알레르기비염과 유사한 증상들을 보였다. 저자는 도포 후 5분간 위의 증상들을 관찰하였으며, 각각의 증상을 경중에 따라 각각 4단계로 나누고, 각각 증상의 점수의 합을 비반응의 정도로 판단하였다(Table 2).9)
광학현미경용 표본제작
동물을 희생시킨 뒤 중간 1/3 부위의 비중격을 채취하여 10% 중성포르말린에 48시간 고정 후, 흐르는 물에 12시간 세척한 다음, 70%, 80%, 90%, 100% ethanol 용액에 각각 2시간씩 침적하여 탈수시킨 후, xylene 처리를 한 다음, 파라핀 포매를 실시하였다. Microtome을 이용하여 3∼4 μm의 두께의 절편을 만들어 hematoxylin and eosin 염색을 실시한 다음 관찰하였다.
투과전자현미경용 표본제작
70 mg/kg의 ketamine hydrochloride를 복강내 주사하여 마취시킨 후, 전자현미경용 전고정용액인 2.5% glutaraldehyde＋0.1 M phosphate buffer solution(PBS, pH 7.4)에 두부를 담궈서 호흡이 정지한 것을 확인한 뒤 절두하였다. 중간 1/3 부위의 비중격을 채취한 다음 2.5% glutaraldehyde＋0.1 M PBS에 실온에서 24시간 고정하였다. 전 고정 후 0.1 M PBS에 30분간 3번 세척한 다음 세포표면막의 염색성을 증가시켜 상피세포간극의 관찰을 용이하게 하기 위하여 osmium-low ferrocyanide법10)을 이용하여 염색하였다. 암실에서 osmium-low ferrocyanide[1% OsO4＋2 mM(0.08%) Fe II] 용액에 침적하여 실온에서 90분간 2차 고정후 0.1 M PBS에 다시 3회 세척하였다. 다음 50%, 70%, 80%, 90%, 100% ethanol 용액으로 각각 20분간 탈수시킨 다음 propylene oxide로 치환시킨 후 epon 수지로 포매하였다. 포매된 조직은 초박절편기를 사용하여 일단 0.35 μm의 semi-thin section을 한 후 toluidine blue로 염색한 뒤 광학현미경으로 관찰하여, 상피층이 잘 보존된 부위를 선택한 다음 70 nm 두께의 초박절편을 만들어 uranyl acetate와 lead citrate로 이중염색을 한 뒤 Hitachi H-600 투과전자현미경을 이용하여 관찰하였다.
결과
증상점수
TDI를 비전정에 도포한 후 나타나는 증상의 평균점수는 감작기간 동안에는 1.41이었으며, 유발기간동안에는 2.88이었으나, ethyl acetate만 도포한 경우의 증상점수는 0이었다(Fig. 2). Group F와 Group G에서는 감작도포기간의 증상점수는 1.3, 유발도포기간의 증상점수는 2.8로 감작도포기간에 비해 유발도포기간중 비증상이 통계학적으로 유의하게 증가함을 보였다(Wilcoxon signed-rank test, p＝0.0313)(Fig. 3).
광학현미경적 관찰
정상소견을 보이는 Group A와 비교해 보았을 때, 감작도포 24시간 후에 희생한 Group B에서는 점막하에 주로 중성구가 침윤되어 있는 것이 관찰되었고, 그 외에도 형질세포, 호산구 등이 관찰되었다. 그러나 감작도포 후 3주의 도포휴지기간을 지난 Group C의 경우 정상소견을 보였으며, 유발도포기간중 ethyl acetate를 도포한 Group D, E의 경우에도 정상소견을 보였다. TDI로 유발도포한 Group F, G를 Group A와 비교해 보았을 때, 전반적으로 상피층내에서 호산구를 다수 관찰할 수 있었으며, 일부 예에서 점막하부종, 혈관확장, 배세포 및 분비선의 증식 등의 소견이 관찰되었고 어떤 부위에서는 상피세포가 탈락되어 있는 소견을 관찰할 수 있었다(Figs. 4 and 5).
투과전자현미경적 관찰
Group A의 정상 비점막에서는 세포간극, 폐쇄소대, 기저막 등이 잘 보존되어 있었고, 호산구나 비반세포 등의 침윤을 거의 관찰할 수 없었다. 감작도포 24시간 후에 희생한 Group B에서는 상피세포 사이나 점막하에서 호산구가 발견되었으나 비반세포는 관찰되지 않았으며, 일부 절편에서는 기저막의 파괴되어 있고 세포간극이 약간 확대되어 있는 소견이 관찰되었다. 3주간의 도포휴지기간을 지낸 Group C에서는 상피층내에 세포의 침윤이 없었으며, 기저막도 잘 보존되어 있었고 세포간극의 확대 등도 관찰되지 않았다. 유발도포기간동안 ethyl acetate로 처치한 Group D, E의 경우 세포간극은 잘 보존되었으며, 일부 절편에서 기저막 손상이 보였으며 손상된 기저막 주변에서 호산구를 관찰할 수 있었다. 또한 상피세포의 세포질내에 공포화도 관찰할 수 있었다. TDI로 유발도포한 Group F, G에서는 폐쇄소대는 잘 보존되어 있었으나 대부분의 절편에서 상피세포간극의 확대, 기저막의 파괴, 상피세포 세포질의 공포화 등이 관찰되었으며, 특히 세포간극이 확대된 부위에서는 세포표면막의 염색성이 저하됨을 보였다. 그리고 대부분의 절편에서 호산구 및 비반세포의 상피내 침윤 등이 관찰되었으며, 비반세포내의 과립도 분화가 잘 되어 보였고, 가끔 탈과립을 시사하는 과립주위막의 소실이 관찰되었다(Table 3, Figs. 6-11).
고찰
비과민성이란 비강내로 유입되는 각종 자극에 대해 비점막의 반응성이 증가되어 재채기, 코막힘, 비루 등이 쉽게 나타나는 현상으로 정의할 수 있다. Connell1)은 알레르기성비염 환자에서 처음 알레르겐에 노출된 뒤 24시간 후 다시 노출되었을 때 비반응이 증가됨을 관찰하였으며, 이를 “priming effect”라고 하였다. 그리고 이러한 현상은 알레르겐에 노출되지 않으면 소실되고, priming된 비점막은 다른 알레르겐에도 감수성이 증가함을 보였다고 하였다. 이러한 “priming effect”는 알레르기성 비염 환자에서 보이는 특이적 과민반응으로 정의할 수 있으며 알레르기성 비염 환자는 비특이적 과민반응으로 먼지, 기온변화, 담배연기, 방향제, 대기오염물질 등과 같은 자극에도 과민성을 보이는 것으로 알려져 있다.
공업용 화학물질인 TDI는 기관지천식을 유발하거나 천식증상을 악화시키는 것으로 알려져 있다. 또 유기용매에 용해된 TDI를 이용하여 동물의 비전정에 도포하면 비과민성을 야기할 수 있다고 알려져 있다. 본 실험에서 저자는 비과민성 동물모델을 만들기 위하여 TDI를 기니픽의 비전정에 도포하여 감작시킨 다음 3주간의 휴지기 후에 유발시킨 결과 사람의 알레르기성 비염에서 나타나는 증상인 재채기, 비즙, 킁킁거림 등의 증상이 감작기간에 비해 유발기간에 유의하게 증가함을 관찰할 수 있었다.
알레르기성 비염에서 보이는 priming이나 비과민성의 형성기전은 아직 명확하지 않으나, 상피세포의 손상, 감각신경종말의 감수성의 증가, 자율신경계의 조절 이상, 세포수용체의 수와 감수성의 변화,12) 호산구를 비롯한 여러 가지 염증세포의 영향, 신경종말에서 분비되는 신경펩타이드의 영향13) 등 여러 가지 가설이 제시되고 있다.
알레르기성 비염 등의 질환에서 상피세포의 손상이 비과민성의 형성에 중요한 역할을 하는지에 대하여는 아직 확실치 않으며 여러 가지 상반된 보고가 있다.14-19) 비점막의 상피는 점액섬모기능에 의해 이물질을 배출하는 기능과 외부 이물질에 대하여 점막고유층을 방어하는 방어벽으로써의 기능이 있다. 천식 환자의 기관지점막에서는 흔히 상피층이 탈락된 소견을 보이며 이러한 상피세포의 탈락으로 인해 감각신경의 종말이 노출되고 따라서 외부자극에 대한 감수성이 증가되어 기관지과민성을 형성한다고 알려져 있다. 그러나 비과민성을 보이는 질환에서도 비점막 상피층의 탈락을 보이는지는 논란이 많다. 저자의 연구에서는 광학현미경 관찰에서 실험군의 일부 절편에서 상피세포가 탈락된 부위가 관찰되었으나 같은 개체의 다른 절편에서는 상피층이 잘 보존되어 있었으며, 정상군에서도 상피세포가 탈락된 부위를 관찰할 수 있어, 이것이 TDI 비과민성 모델에서 보이는 전형적인 소견인지, 아니면 조직준비과정중의 인위적인 변화인지 명확하게 알 수 없었다. 그러나 전자현미경적 관찰에서 상피세포의 세포질내에 공포화가 관찰되어 상피세포의 변성이 있음을 생각할 수 있으며, 고농도의 TDI에 노출되거나 장기간 노출될 경우 상피세포가 탈락될 가능성을 배제할 수는 없었다.
그러나 투과전자현미경적 관찰에서는 폐쇄소대는 잘 유지되어 있었지만, 세포간극의 확대, 기저막의 파괴 등을 관찰할 수 있었다. Ohashi 등2)은 천식환자의 기관지 점막의 전자현미경적인 연구에서 상피세포간극의 확대와 폐쇄소대의 개방, 호산구와 그 과립들이 확대된 세포간극과 폐쇄소대에서 발견됨을 관찰하고 이는 기도과민성의 형성과 유사한 상관관계를 갖는다고 보고하였다. 세포간극의 확대 등의 형태학적 변화에 의해 비점막상피의 투과성이 증가되어 감각신경종말, 혈관, 분비선으로 알레르겐을 비롯한 외부 자극물질의 접근이 용이해질 수 있을 것으로 생각되며19) 따라서 과민성을 항진시킬 가능성이 있다고 추측된다. 저자의 실험에서도 이러한 변화가 대부분의 TDI 유발군에서 발견되어 비과민성과 어떤 연관성이 있음을 추측케 하였다.
비과민성을 보이는 환자의 비점막에서는 호산구를 비롯하여 여러 가지 염증세포들이 많이 관찰된다. 그중 활성화된 호산구는 eosinophil cationic protein(ECP), major basic protein(MBP), eosinophil peroxidase(EPO), eosinophil derived neurotoxin(EDN) 등 독성 매개체를 유리하며 이들 독성 매개체들은 상피세포를 손상시키는 것으로 알려져 있다.3) 통년성 알레르기성 비염의 환자에서 보이는 비즙내의 증가된 호산구가 비과민성과 연관이 있다는 보고가 있으며,13) 본 연구에서도 호산구는 비과민성 모델에서 고유층과 상피층에서 모두 발견되었다. 또한 확대된 세포간극내로 비반세포와 호산구의 침입을 관찰할 수 있었으며 기저막이 파괴된 주위에서 호산구를 많이 관찰할 수 있었다. 호산구내에서는 독성을 갖는 MBP, ECP, EDN, EPO 등을 함유하는 이차과립을 관찰할 수 있었으며, 이는 사람의 활성화된 호산구에서 볼 수 있는 이차과립과 동일한 모양을 하고 있었다. TDI로 유발도포시킨 군에서는 비반세포를 발견할 수 있었으며, 비반세포 내에는 부분적으로 탈과립을 시사하는 과립 주위막의 소실20)을 관찰할 수 있었다.
결론
기니픽에서 TDI를 이용한 비과민성모델을 만들어 증상점수, 비중격의 광학현미경 소견, 투과전자현미경 소견 등을 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
1) TDI 감작, 유발군에서는 감작도포기간의 증상점수는 1.3, 유발도포기간의 증상점수는 2.8로 감작도포기간에 비해 유발도포기간중 비증상이 통계학적으로 유의하게 증가함을 보였다(Wilcoxon signed-rank test, p＝0.0313).
2) 광학현미경상 호산구를 비롯한 여러 가지 염증세포의 침윤, 부종, 혈관확장, goblet cell의 증식, 분비선의 증식 등이 보였으나 전체적으로 보이는 소견은 아니었고, 상피세포의 탈락 등이 관찰되었으나 이것이 비과민성의 전형적인 병리학적 소견인지 아니면 조직준비과정중 인위적으로 만들어진 것인지 여부는 알기가 어려웠다.
3) 투과전자현미경상 모든 경우에서 폐쇄소대는 잘 유지되어 있었으나 세포간극의 확대, 확대된 세포간극내로 호산구 및 비반세포의 침윤, 기저막의 파괴, 세포질내의 공포화 등이 감작도포만 실시한 군의 일부 절편에서, 그리고 유발도포를 실시한 군의 대부분의 절편에서 관찰되었다.
결론적으로 실험적으로 만들어진 비과민성 동물모델에서 비점막 상피의 손상 및 변화가 관찰되었으며, 향후 이러한 형태학적 변화가 어떻게 비과민성의 형성에 영향을 끼치는지에 대한 연구가 필요하리라 생각된다.
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