The Generation of Superoxide Radicals and Activities of Antioxidant Enzymes in Influenza A Virus-Induced Maxiliary Sinusitis of Rabbits.

Cho, Jin Hak; Jung, Keun; Cho, Chin Saeng; Lim, Hyun Joon; Kim, Hyung Baek; Choi, Soo Young

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 41(7); 1998 > Article

Original Article

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1998;41(7): 868-875.

The Generation of Superoxide Radicals and Activities of Antioxidant Enzymes in Influenza A Virus-Induced Maxiliary Sinusitis of Rabbits.

Jin Hak Cho, Keun Jung, Chin Saeng Cho, Hyun Joon Lim, Hyung Baek Kim, Soo Young Choi

¹Department of Otorhinolaryngology, College of Medicine, Hallym University, Chunchon, Korea. chojh@www.hallym.or.kr
²Genetic Science, College of Natual Science, Hallym University, Chunchon, Korea.

Influenza A Virus에 감염된 가토상악동점막에서 Superoxide Radical의 생성 및 항산화효소의 활성도

조진학¹ · 정 근¹ · 조진생¹ · 임현준¹ · 김형백¹ · 최수영²

한림대학교 의과대학 이비인후과학교실1;자연대학 유전공학과2;

주제어: 산소유리기ㆍ항산화 효소.

ABSTRACT

BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Oxygen free radicals are generated markedly in various infected condition, and these molecular species were identified as potent pathologic agents. The activities of various antioxidant enzymes have close relationships to genereration and metabolism of oxygen free radicals. The purpose of this study was to investigate the changes in the generation of superoxide radicals and activities of antioxidant enzymes and to compare histopathological changes in influenza A virus-induced maxillary sinusitis.
MATERIALS AND METHODS:
The experimental viral infection was induced in New Zealand white rabbits by inoculating 0.3 ml of influenza A virus. Maxillary sinus mucosa were examined with a light microscope and the generation of superoxide radicals and activity of antioxidant enzymes were measured at the intervals up to 28 days after inoculation.
RESULTS:
The mucosal changes deteriorated and reached maximum at seven days after inoculation. The first day of inoculation, mononuclear phagocytes and neutrophils began to be found in subepithelial layer. We also found that capacity of oxygen generation increased about one and a half fold compared with the non-infected control group. The activity of SOD, GSH-Px and CAT, which are specific scavengers of oxygen radicals, peaked at three, five, and seven days after viral inoculation, respectively. CONCLUSIONS: These results suggest that oxygen free radicals play an improtant role in the histopathologic damage in the early stage of influenza A viral infection, and the activities of antioxidant enzymes are enhanced by the generation of superoxide radicals. It is also indicated that antioxidant enzymes may have a therapeutic potential for this viral infection and other conditions associated with free radicals.

Keywords: Superoxide radicalsㆍSuperoxide dismutaseㆍCatalaseㆍGlutathione peroxidase

서론 Influenza A 바이러스가 상기도 점막조직내에 침입하게 되면 상피세포의 탈락,1) 점액수송능력의 현저한 감소,2) 섬모의 파괴3) 등의 변화가 일어난다. 그 외, 부분적 호흡상피세포의 탈락과 섬모의 소실 및 혈관밖으로 적혈구 유출의 증가와 염증세포의 침윤 등의 변화도 발생한다.4) 그러나 이의 원인에 대한 병리기전이 명확히 밝혀지지 않은 상태에서 최근 Oda 등5)이 influenza 바이러스에 감염된 쥐의 폐에서 superoxide radical의 급격한 증가를 보고하였다. 산소유리기는 정상적 상태에서 다양한 세균의 침입으로부터 몸을 보호하는 매우 중요한 역할을 하게되나 바이러스 감염시에는 숙주내에서 바이러스가 증식하면서 많은 양의 산소유리기가 생산되어 주위의 세포 성분 즉 지질, 단백질, 핵산 등을 산화시켜 숙주조직이 손상된다. 본 연구는 급성상기도염의 중요한 원인균의 하나인 infl-uenza A 바이러스를 가토의 상악동에 감염시켜, 바이러스가 상악동 점막에 미치는 조직병리학적 변화를 관찰하고, 염증상태에서 다량 분비되는 산소유리기 및 산소유리기의 세포독성을 무독화시키는 항산화효소인 superoxide dismutase(SOD), catalase(CAT), glutathione peroxidase(GSH-Px)의 활성도를 측정하여, 바이러스 감염후 발생하는 조직손상과 산소유리기 중 superoxide radical의 상호관계를 규명하고 바이러스 감염시의 생체방어기전의 일단을 알아보아 향후 influenza A 바이러스 감염시 각종 유리기 소거제(scavenger)의 역할에 관한 연구의 기초자료로 사용하는데 그 목적이 있다. 재료 및 방법 재료 실험동물은 체중 2 kg 전후의 건강한 가토(New Zeal-and white rabbit) 32마리를 24마리는 실험군으로, 8마리는 대조군으로 암수의 구별없이 사용하였다. 본 실험에 사용한 바이러스는 한림대학교 의과대학 미생물학교실에서 배양중인 influenza A 바이러스：A/Korea/1/80(H 3N 2)를 부화계란의 요낭막내에 배양하여 실험전까지 -70℃에 보관하였다가 실험시 해빙하여 혈구응집저지시험으로 역가를 측정하고 Eagle’s minimum essential medium을 첨가하여 가토 부비동 점막에서 바이러스가 증식하기에 적절한 농도(7×10 6 plaque forming units/ml, 이하 p.f.u./ml로 약함) 로 희석하여 사용하였다. 방법 실험동물처치 Ketamine(50 mg/kg)으로 전신마취한 후 혈청학적 검사를 위하여 혈액을 채취한 다음, 코 주위의 털을 깎고 베타딘 용액과 알코올로 소독한 후 우측 상악동 측벽을 천자흡인하여 상악동내에 저류액 등의 병변이 없는 것을 확인하였다. 약 7×10 6 p.f.u./ml 정도의 부유액으로 만든 바이러스용액 0.3 ml를 피부반응용 주사기를 사용하여 24마리의 실험군에 주입하였으며 8마리의 대조군에는 같은 양의 바이러스 배양액만을 주입하였다. 실험조작 후 같은 환경에서 사육하면서 6시간, 1일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일에 각각 3마리를 희생하여 혈액을 채취한 후, 상악동을 노출하여 저류액의 유무와 점막을 육안 관찰하고 상악동 점막을 채취하였다. 채취한 점막의 일부는 조직학적 관찰을 위하여 포르말린 용액에 고정하였으며 나머지는 가능한 한 빨리 -70℃에 급속 냉동하여 실험할 때까지 보관하였다. 실험전과 희생시 심장에서 채취한 혈액을 원심분리하여 얻은 혈청은 -70℃에 보관하였다가 혈구응집저지시험(Hemagglutination Inhibition Test)을 시행하여 바이러스 주입전에 비하여 항체 역가가 4배 이상 증가한 경우 감염이 되었다고 판단하였다. 상악동점막의 병리표본제작 및 관찰 골막을 포함하여 적출한 상악동내측벽 점막을 10% 중성 포르말린 용액에 24시간 고정한 후 파라핀 포매과정을 거쳐 4∼5 μm 두께로 박절하여 hematoxylin-eosin 염색을 하여 관찰하였다. 상악동 점막의 병변을 섬모의 크기, 염증세포의 침윤, 섬모세포의 손상, 배세포 및 기저세포의 증식 등으로 구분하여 검색을 실시하였다. Superoxide radical 및 항산화효소의 측정 가토상악동점막의 homogenization 정해진 시간에 따라 희생시켜 얻은 상악동 점막조직을 -70℃에 급속 냉동하였다가 실험시 5∼10배 volume의 0.25 M sucrose 용액에 넣어 teflon glass homogenizer로 2∼4℃를 유지하면서 분쇄하여 3000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 시료로 사용하였다. 단백질 정량은 Bra-dford 6) 방법에 의하여 농도를 결정하였다. Superoxide radical의 생성 측정 Superoxide radical은 Auchlar와 Voisin 7)의 방법에 의하여 측정하였다. 0.01 mM NBT, 0.2 mM mannitol을 포함하는 50 mM Tris-HCl buffer(pH 7.4)에 시료를 넣고 30℃에서 prewarming시킨 후 최종 농도가 0.2 mM 되게 NADH를 넣은 후 560 nm에서 흡광도 변화를 측정하였다. Superoxide radical의 생성량은 NBT가 얼마나 환원되느냐에 따라 정량된다. Superoxide Dismutase(SOD)의 활성도 측정 Superoxide dismutase의 효소 활성도 측정은 alkaline dimethylsulfoxide(DMSO)를 superoxide anion-generating system으로 사용하여 cytochrome C의 환원을 측정하는 Hyland 등 8)의 방법을 사용하였다. 시료를 10 -4 M EDTA와 2X10 -5 M cytochrome C를 포함하는 0.2 M potassium phosphate buffer(pH 8.6)에 넣고 20분간 ice bath에서 incubation시킨 후 1% 물과 5 mM NaOH가 포함된 0.5 ml alkaline DMSO를 넣고 잘 젓는다. 그 후 550 nm에서 cytochrome C의 감소로 인한 흡광도 변화를 측정하였으며 효소 활성도 1 unit는 alkaline DMSO에 의한 cytochrome C를 50% 감소시켰을때의 효소의 양으로 정하였다. Catalase(CAT)의 활성도 측정 Catalase의 효소 활성도 측정은 Nelson 등9)의 방법에 의하여 측정하였다. 실온에서 5 mM H2O2와 0.1 mM EDTA를 포함하는 50 mM phosphate buffer(pH 7.0)에 시료를 넣고 240 nm에서 흡광도 감소를 측정하였으며 1 unit는 1분간 1 μM의 H 2O 2가 없어지는 양으로 측정하였다. Glutathione peroxidase(GSH-Px)의 활성도 측정 Glutathione peroxidase의 효소 활성도 측정은 glutathione peroxidase에 의해 산화된 glutathione이 glutathione reductase에 의해 환원되면서 감소되는 NADPH의 양으로 Palgia와 Valentine10)의 방법에 의하여 측정하였다. 반응 혼합물에 0.008 M NADPH 100 μl, glutathione reductase 10 μl, 1.125 M NaN 3 10 μl, 0.15 M reduced glutathione 100 μl를 준비하여 이 반응혼합물에 0.0022 M H 2O 2로 변하는 양을 340 nm에서 흡광도의 변화에 의하여 측정하였다. 결과 육안소견 실험 기간중 사망한 동물은 없었으며 감염 후 7일까지 바이러스를 주입한 상악동에 점액성 분비물이 있었으나, 14일 군부터는 소실되었고 반대쪽 상악동에서는 분비물을 관찰할 수 없었으며, 전기간에 걸쳐 상악동의 자연개구부가 막힌 경우는 없었다. 혈청학적 검사 소견 적혈구응집 저지시험을 시행한 결과 바이러스 주입전 항체 역가는 모두 32 이하이나, 주입 후에는 모든 군에서 512 ∼2048까지의 역가를 보여 대조군에 비하여 모두 4배 이상으로, 바이러스의 감염이 되었다고 판정할 수 있었으며 3, 4주에서 가장 높은 역가를 보였다(Fig. 1). 광학현미경 소견 정상 상악동 점막은 일정한 방향으로 배열된 섬모를 갖는 상피층과 상피하 결체조직 및 분비선으로 구성되며 점액분비세포는 비교적 드물게 관찰되었다(Fig. 2-A). 배양액만을 주입한 군에서는 특별한 병변을 관찰할 수 없었으며, 감염 6시간 후의 상악동 점막은 정상 대조군에 비하여 특별한 변화는 없었으나, 1일군에서는 부분적으로 섬모의 배열상이 흐트러지며, 대식세포, 다핵구 등을 포함한 염증세포가 나타나기 시작하였다. 이러한 변화는 시간이 경과하면서 더욱 심하여 감염 5일째에는 많은 수의 염증세포가 상피세포 및 상피하층에 나타나고, 섬모의 파괴도 심하였으며, 배세포 및 기저세포의 증식이 일어나기 시작하였다. 감염 7일째에는 섬모가 완전히 소실되고 상피세포의 퇴행성 변화 및 부분적 섬모상피의 탈락이 관찰되는 등 가장 심한 조직학적 변화를 나타내었다(Fig. 2-B). 호흡상피는 변성되어 공포화되고, 혈관의 울혈 및 적혈구의 혈관외 유출도 관찰할 수 있었다. 감염 후 14일이 지나면서 7일 군에 비하여 염증세포나 배세포의 현저한 감소가 보였으며 섬모도 부분적으로 재생되었다. 이후 28일에는 외형상으로는 정상소견을 보였다(Fig. 2-C). Superoxide radical 생성 및 항산화효소의 활성도 Superoxide radical의 생성량 바이러스 주입 후 1일째 최고치를 보였다. 그 후 급격히 감소하여 3일째 이후는 회복되어 21일째부터는 정상과 비슷한 생성량을 나타냈다(Fig. 3). Superoxide dismutase(SOD)의 활성도 바이러스 주입 후 점차 증가하여 3일째 최고치를 보이고 5일째부터는 급격히 감소하여 정상이하로 유지되다가 28일째는 정상과 비슷한 효소 활성도로 회복되었다(Fig. 4). Catalase(CAT)의 활성도 바이러스 주입 후 점차 증가하여 7일째 최고치를 보였으며 그 후 감소하여 28일째는 정상치와 비슷한 효소 활성도를 보였다(Fig. 5). Glutathione peroxidase(GSH-Px)의 활성도 바이러스 주입 후 감소치를 보이다가 5일째 최고치를 보였으며 7일 이후에는 감소한 효소 활성도를 보였다(Fig. 6). 고찰 최근 최외각전자가 쌍을 이루지 못하여 화학적으로 매우 반응성이 높고 불안정하며 세포독성을 갖고 있는 superoxide radical(O2-), hydroxyl radical(OH-), 과산화수소수(H2O2)와 같은 산소유리기에 관한 연구가 세포손상의 생리적 혹은 병리적 역할을 규명하기 위한 과정으로 활발히 이루어지고 있다. 산소유리기는 산소의 불완전한 환원으로 생성되는 산소산물로써 세포내에서 여러기전에 의하여 끊임없이 생성되고 있으며, 따라서 세포는 항상 산소유리기에 노출되어 있다고 할 수 있다. 정상적으로 산소의 98∼99%는 물로 환원되고나머지 1∼2%의 산소는 산소유리기를 생성하게 되는데 어떠한 원인에 의하여 산소유리기 생성계가 활성화되어 정상적으로 작동하는 소거계의 능력을 넘어 과생산되면 여러가지 기전을 통한 반응으로 자체세포손상이라는 결과를 초래하게 된다. 조직에서 생성되는 산소유리기 중 90% 이상을 차지하는 superoxide radical의 바이러스 감염에 있어서의 영향에 관하여 Oda 등5)은 influenza A 바이러스에 감염된 쥐의 폐조직과 혈장에서 다량의 superoxide radical를 생성하는데 관여하는 xanthine oxidase의 활성도가 바이러스 감염 후 점차 증가하는 것을 확인하였으며, 강력한 superoxide radical의 소거효소인 superoxide dismutase(SOD)를 주입한 후에는 현저히 감소한 사망률을 보고함으로써 바이러스 감염에 의한 세포손상의 병인이 바이러스의 증식으로 인한 직접적 영향보다는 과도한 자가면역반응의 영향으로 인한 손상임을 강하게 시사하였다. Xanthine oxidase는 허혈상태에서 다량 축적된 hypoxanthine을 재관류때 공급된 산소와 반응하여 xanthine으로 전환하는 효소이며 이때 다량의 superoxide radical이 생성된다. 그는 이러한 작용을 갖는 xanthine oxidase가 influenza 바이러스에 의한 세포손상의 병리기전에 중요한 인자라고 하였다. 그러나 이 연구는 산소와 직접 접촉하여 활발한 가스교환이 일어나는 폐세포의 경우이고 상악동상피세포에서는 표면에 많은 배세포와 점액층이 있어 외부 병원미생물에 강한 저항력을 갖고 있으며, 자율신경계 및 각종 신경전달물질이 산재해 있으므로 하기도점막과는 다른 병리기전을 보일 것으로 생각된다. 본 연구에서는 바이러스 주입 후 1일째 superoxide radiacla의 생성이 가장 많고 그 후 점차 감소하여 5일째는 오히려 정상보다 적어졌으며 그 후 21일째부터는 정상과 비슷한 양을 보여 감염초기에 다량의 superoxide radical과 같은 산소유리기를 생산하는 기전이 있음을 암시하였다. 본 연구에서 관찰한 상악동 점막의 형태학적 변화는 바이러스 감염 후 1일째부터 부분적으로 섬모의 일정한 배열상이 흐트러지며, 대식세포, 다핵구 등의 염증세포가 나타나기 시작했다. 이는 superoxide radical의 역할과 관련하여 superoxide radical의 생성이 섬모의 파괴에 직접적으로 관여하는 것을 시사하며, superoxide radical은 염증초기에 모여드는 대식세포와 다핵구에서 생성되는 것으로 짐작된다. 다형핵구에 의한 탐식작용은 주위기질에서 산소를 소비하여 superoxide radical과 과산화수소를 생산하며, 생산된 superoxide radical과 과산화수소는 강력한 산화제인 hydroxyl radical로 환원되어 이것으로 침입한 병원체를 산화시켜 파괴하여 일어난다.11) Drath & Karnovsky12)도 백서와 기니아 픽의 대식세포에서 superoxide radical의 생성을 보고하였으며, 이러한 superoxide radical의 발생은 인체의 대식세포 및 다핵구가 병원미생물의 침입으로 인하여 염증매개체에 의한 자극을 받아 포도당 대사와 산소소모가 급격히 증가하면서 세포막에 있는 NADPH 산화효소들에 의하여 산소가 불완전 환원되어 배출되는 것으로 알려졌다.13) 이렇게 배출된 superoxide radical가 세포독성을 나타내어 세포손상을 일으키며 화학주성인자를 활성화시켜 염증반응을 더욱 촉진시키는 것으로 생각된다. 실제로 바이러스에 감염된 조직은 시간이 경과하면서 조직의 손상이 더욱 심하여져 감염 7일째에 이르러는 부분적으로 섬모가 완전히 소실되고 상피세포의 탈락 및 세포의 공포화 등 가장 심한 조직학적 변화를 관찰할 수 있었다. 이때의 superoxide radical의 생성량은 초기에 비하여 감소하였는데 이는 superoxide radical의 조직손상으로부터 보호하려는 생체방어기전이 작동하여 superoxide dismutase(SOD), catalase(CAT), glutathion peroxidase(GSH-Px) 등의 항산화 효소가 활성화되어 산소유리기를 소거함으로써 감염 초기보다 감소한 것으로 생각된다. 특히 SOD는 superoxide radical을 과산화수소와 산소로 대사시키는 강력한 항산화 효소로써 감염후 3일째 가장 높은 효소 활성도를 보였는데 SOD의 고유기능상 당연한 결과라 여겨진다. SOD는 최근 그 역할에 대한 연구가 활발히 이루어져 Atalla 등14)은 개의 간을 이용한 실험에서 SOD와 CAT가 산소유리기가 관여하는 허혈성 손상에서 방어역할을 한다고 보고하였고, Guice 등15)은 인공적으로 쥐의 췌장염을 유발시킨 실험에서 산소유리기가 췌장염의 발생에 관여하며 SOD와 CAT가 방어적 역할을 한다고 보고하였다. 또한 SOD는 flap의 생존을 연장시키며,16) 허혈성 청력장애,17) 혹은 소음성 청력장애18)를 감소시키는 등 각종 superoxide radical의 유해로부터 생체를 보호하는 것으로 보고되고 있다. CAT와 GSH-Px는 SOD에 의하여 생성된 과산화수소를 물과 산소로 대사시킨다. CAT는 바이러스 주입 후 7일째 가장 높은 활성도를 보였고 GSH-Px의 활성도는 3일까지 감소하다가 5일째 증가한 후 다시 감소하였다. 각각의 항산화효소가 최대 활성도를 보이는 시간이 각각 다른 것은 산소유리기의 대사가 시간에 따라 순차적으로 이루어지는 것을 의미한다. 광학현미경하의 형태학적 변화는 바이러스 주입 후 7일째 가장 심한 세포손상을 보였는데 이때에 superoxide radical의 주 생성원인 다형핵구 및 대식세포의 출현이 더욱 증가하였다. 그러나 superoxide radical의 생성량은 오히려 감소하여 최대의 생성량을 보인 시간과는 약 6일의 차이가 발생하였는데, 이는 감염 후 3일째부터 항산화 효소들의 활성도가 증가하면서 생성된 superoxide radical이 즉시 대사되기 때문으로 생각된다. 본 연구에서 superoxide radical의 생성과 SOD의 활성도는 서로 반비례하는 결과를 보임으로써 SOD가 superoxide radical의 대표적 소거제일 것으로 추정되었다. 바이러스 주입 후 7일째의 세포손상은 결국 산소유리기에 의한 손상이라기 보다는 다형핵구 및 대식세포에서 분비되는 hydrolase, proteinase, cationic protein 등의 분해효소의 작용 및 바이러스 증식에 의한 직접적 작용, 세포전달물질을 통한 화학적 작용으로 인한 손상으로 짐작된다. 따라서 본 연구의 결과로 바이러스 감염시, 염증세포들이 활성화되면서 산소유리기가 발생하여 세포 손상이 시작되나, 곧 SOD, CAT, GSH-Px 등의 항산화 효소의 작용으로 산소유리기는 소거되는 것으로 보이며 그 이후 염증세포에서 분비되는 분해효소로 인한 세포손상이 계속되어 감염 7일째 최대치의 세포손상을 보이는 것으로 생각된다. 따라서 감염초기에 산소유리기 소거제의 다량투여가 세포손상을 감소시킬 것으로 예상되어 향후 산소유리기 소거제를 사용한 후 조직의 손상에 대한 비교 연구가 필요할 것으로 사료된다. 요약 본 연구를 통하여 influenza A 바이러스 감염으로 발생하는 초기 조직의 손상은 superoxide radical의 생성에 의한 것이며 감염 후 항산화효소의 활성도가 증가함으로써 superoxide radical이 소거되는 상호 관계를 증명하였다. 따라서 향후 바이러스 감염시 산소유리기를 생성하는 주 생성세포에 관한 추가적 연구 및 각종 산소유리기 소거제를 사용한 후 조직의 손상에 대한 비교 연구를 수행으로써 바이러스 감염의 예방적 조치로써 산소유리기 소거제 사용 여부의 판단 기준을 제시 할 수 있을 것으로 생각된다.
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